本发明涉及一种基于流式细胞术的高通量筛选阿维菌素高产菌株的方法，属于高通量筛选技术领域。
背景技术：
阿维菌素作为阿维链霉菌次级代谢产物，其代谢存在复杂庞大的网络。尽管阿维菌素全基因组测序已经完成，但其生物合成过程复杂，受不同水平的调控，代谢途径也尚未清晰阐明。分子育种手段费用高，过程复杂。为了加快选育速度，建立一个简便、快速和准确的检测方法是有必要的。高通量筛选技术是在传统筛选技术的基础上，将生物化学、现代生物学、计算机、自动化控制等高新技术有机组合成一个高自动化的新模式，与传统随机筛选相比，高通量筛选周期和投资更低，成功机率高。从发酵工程微生物育种史，可以看到经典诱变育种是最主要的育种手段，也是最基础的育种手段，经典诱变结合高通量筛选仍可作为可靠的方法。
目前的经典诱变结合高通量筛选方法，由于经典诱变会存在大量死细胞而可能导致后续可培养无法实现，同时经典诱变后的菌株要进一步分离纯化、扩大培养之后才能进行后续酶标板等高通量筛选而存在筛选周期长、前期工作量大等问题。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明联合经典诱变、流式细胞术、高通量孔板筛选、固液联合培养，提供了一种基于流式细胞术的高通量筛选阿维菌素高产菌株的方法。本发明基于流式细胞术对阿维链霉菌高通量筛选，可在短时间内对大量有效菌株进行分析，从而分选目的活孢子，进而进行高通量培养检测。
本发明的基于流式细胞术的高通量筛选阿维菌素高产菌株的方法，主要包括步骤如下：
(1)获得阿维链霉菌的多个含量死孢子在内的待筛选的孢子；
(2)利用PI染料对步骤(1)的待筛选的孢子进行染色；
(3)使用流式细胞仪检测孢子活性；
(4)利用流式细胞仪分选有活性孢子，直接将单个有活性的孢子分选到装有固体培养基的高通量孔板中；
(5)待高通量孔板的固体培养基上培养3～4天，直接添加液体种子培养基继续培养得到种子液；将培养好的种子液转接入含有发酵培养基的新的高通量孔板中，发酵培养；
(6)配置一定浓度梯度的阿维菌素标准品，用酶标仪检测，得到线性浓度范围内阿维菌素与240nm下的吸光值OD的关系；发酵培养结束后，吸取发酵液，浸提后离心取上清，在合适的浓度下用酶标仪测定240nm下的吸光值OD，进而得知待筛选菌株产阿维菌素含量的相对高低；
(7)选取上一步得到的阿维菌素含量相对较高的菌株多株，进行复筛。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)的待筛选孢子可以是不同活性的孢子，包括死孢子。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)的待筛选孢子是将阿维链霉菌进行诱变后得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)的待筛选的孢子中，死孢子含量达90％以上，优选地达95％以上更优选地达99％以上。
在本发明的一种实施方式中，所述诱变，可以是物理诱变或者化学诱变，比如常压室温等离子体(ARTP)诱变、紫外诱变、甲基磺酸乙酯(EMS)诱变、亚硝基胍(NTG)诱变、硫酸二乙酯(DES)诱变等等。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)的染色，具体是：将待筛选的孢子调整至浓度105～106个孢子/mL的悬浮液，将等体积悬浮液与10μg/mL PI染色剂混合，避光放置4℃冰箱孵育15min。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)和步骤(4)具体是：以没有标记任何荧光素的样品为阴性对照、将完全无活性的与PI染色剂结合的样品设置为阳性对照，确定阴性与阳性孢子群体；取染色后的阿维链霉菌孢子悬浮液，重新过滤，稀释一定倍数，上流式细胞仪分析，用FL3通道((610±15)nm)检测，以FCS-Log-Height为横坐标，SSC-Log-Height为纵坐标，SSC阈值为0.03，荧光通道电压为513，将无荧光区域最集中部分设门分选至装有固体培养基的高通量孔板中，每孔分选设定为单个孢子。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(4)中，装有固体培养基的高通量孔板中固体培养基的体积为50μL/孔。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(5)中，是培养至长出可见孢子后添加液体种子培养基。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(5)中液体种子培养基的添加量为150μL/孔。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(5)中发酵培养液的添加量为900μL/孔。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(6)，在线性浓度范围内，目标物浓度越大，OD值越大。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(6)的一定浓度梯度是指0～210μg/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(6)，是绘制阿维菌素与240nm下的吸光值OD的标准曲线；发酵培养结束后，乙醇适当稀释超声浸提后离心，测定上清液在240nm下的吸光值OD，将吸光值OD代入标准曲线，得到相应的阿维菌素含量。
在本发明的一种实施方式中，所述高通量孔板可以是96深孔板、96浅孔板、48深孔板、24深孔板、12深孔板等任意一种具有高通量筛选作用的培养器皿。优选地，装有固体培养基的高通量孔板为96浅孔板，装有发酵培养基的高通量孔板为48深孔板。
本发明的有益效果：
本发明方法结合了常压室温等离子体(ARTP)、PI染色法、流式细胞术分析分选法、酶标仪检测、固液结合的培养方法和高通量筛选技术，对分选有活性阿维链霉菌孢子培养提供了一种精确快速的方法。本发明方法基于流式细胞仪能够在短时间内对单孢子检测，从而建立庞大的分析目标群体，流式细胞术高通量的分选培养减少了在平板上生长的过程，不漏筛每个孢子，分选速度和筛选效率得以提高。此外，利用固液结合的培养方法直接提高了单个阿维链霉菌孢子的生长率，解决了单个孢子在液体培养基中生长困难的问题。
具体实施方式
培养基：
(1)固体培养基(g/L)：可溶性淀粉4g，酵母粉3g，进口麦芽粉10g，CoCl2·6H2O5mg，琼脂粉20g。
(2)孔板种子培养基(g/L)：玉米淀粉28.5g，豆饼粉7.5g，酵母粉4.5g，酵母膏4g，CoCl230mg，淀粉酶0.67g。
(3)孔板发酵培养基(g/L)：玉米淀粉140g，豆饼粉25g，酵母粉10g，(NH4)2SO40.25g，CoCl2·6H2O 20mg，NaMoO422mg，MnSO42.3mg，淀粉酶0.67g。
荧光染色剂配制：
称取0.01g PI，用PBS(pH 7.4)缓冲溶液定容至10mL。梯度稀释至10μg/mL。4℃避光保存。
PI染色剂对阿维链霉菌孢子染色：
取等体积阿维链霉菌孢子悬液和10μg/mL PI染色剂混合，避光放置4℃冰箱染色一定时间。
上样检测：
取染色后的阿维链霉菌孢子悬浮液，重新过滤，稀释一定倍数，上流式细胞仪(MoFlo XDP)分析。根据染色剂发射荧光选择合适通道检测。设定合适光电倍增管电压，阈值等参数。所得数据用Summit 5.4软件分析。
分选培养：
将富集后的样品上流式细胞仪检测，自定分选条件，将阿维链霉菌孢子分选到合适的培养基中进行培养。
实施例1ARTP诱变或其他诱变方法获得不同活性孢子
出发菌株阿维链霉菌斜面菌种在28℃条件下，培养5天，直至孢子成熟，斜面菌落呈灰白色。刮取适量成熟斜面孢子于装有2mLPBS缓冲液的试管中，震荡器震匀制成菌悬液后，无菌滤纸过滤。吸取10μL合适浓度的菌悬液均匀涂布于无菌的载片表面，将载片置于载台上，用ARTP诱变仪进行诱变。条件：入射功率为100W、氦气流量为10SLM、分别照射一定时间获得不同活性的孢子。其他诱变方法获得不同活性的孢子同样适用。
实施例2PI染色剂对阿维链霉菌孢子染色
样品处理完毕，用无菌镊子将载片放至装有PBS(pH 7.4)缓冲溶液的EP管中，充分振荡1min，将附着在载片上的菌体被彻底洗脱到液PBS中。滤纸过滤，5000×g离心5min，弃去上清，加入PBS重悬。重复此操作步骤2～3次，得到纯净的阿维链霉菌孢子悬液。用PBS将纯净的阿维链霉菌孢子悬液稀释至浓度105～106个孢子/mL。取等体积阿维链霉菌孢子悬液和10μg/mLPI染色剂混合，避光放置4℃冰箱孵育15min。
实施例3流式细胞仪检测分选
检测要建立对照试验除去非特异性结合即背景。没有标记任何荧光素的样品为阴性对照，代表细胞背景荧光信号。通过阴性对照调节基本电压，设定阴性与阳性群体界限。将完全无活性，与PI染色剂结合的样品设置为阳性对照，确定阴性与阳性孢子群体。固定条件后进行样品检测。取染色后的阿维链霉菌孢子悬浮液，重新过滤，稀释一定倍数，上流式细胞仪(MoFlo XDP)分析。所得数据用Summit 5.4软件分析。根据PI发射红色荧光波长，用FL3通道((610±15)nm)检测。通过调节FSC、SSC、荧光通道坐标参数，电压以及阈值参数，首先初步获得分析对象的群体位置。对群体位置大致设门，再次调节FSC、SSC阈值，电压参数，将大部分的背景噪音去除。最终确定以FCS-Log-Height为横坐标，SSC-Log-Height为纵坐标，SSC阈值为0.03，荧光通道电压为513为最佳分析参数。从软件图示中，可以看出，阿维链霉菌无活性孢子被PI染色后，发出红色荧光信号。由于PI不能透过活细胞细胞膜，有活性阿维链霉菌孢子未能被染色，无荧光信号显示。将无荧光区域最集中部分设门分选至96孔板固体培养基中(每孔50μL)。每孔分选设定为单个孢子。
实施例4酶标仪检测
根据阿维菌素在240nm处有最大光吸收，而空白培养基在240nm处无吸收值的这一特点，选择酶标仪检测阿维菌素作为初筛方法。配置一定浓度梯度的标准品，用酶标仪检测，制得标准曲线方程y＝0.01782x+0.06191，R2＝0.99715，x为标准品浓度(μg/mL)，y为OD240nm，标准品浓度范围为0～210μg/mL。48孔板中的预发酵实验表明阿维菌素的效价在1000μg/mL左右。吸取48深孔板中培养液50μL，乙醇将阿维菌素稀释到标准曲线线性范围之内，超声浸提后4000r/min离心15min，取200μL上清液于96酶标板，用酶标仪测定240nm可见光下的吸光值OD。用乙醇超声浸提，将阿维菌素稀释到标准曲线线性范围之内，240nm处测OD值。
实施例5高产菌株的培养及筛选
经过流式细胞仪直接将单个阿维链霉菌孢子分选至96浅孔板中(液体培养基装量180μL)。由于阿维链霉菌孢子体积过小，直接在180μL液体培养基中生长率只有15％左右。为解决此问题，对培养方案进行改进。待装有50μL的96孔板固体培养基上长出可见孢子之后(约3～4d)，吸取种子培养液150μL于此孔板固体培养基上。种子培养液于750r/min，28℃的孔板摇床上培养47h左右。经此改进后的培养方案，阿维链霉菌在孔板固体培养基上生长率可达93％左右。种子培养液中阿维链霉菌生长状况正常。以5％(v/v)的接种量，将96孔板中的种子液平行转接至48孔板(装有发酵培养液900μL)中，28℃，750r/min发酵培养10d。剩余96孔板中的种子液用40％甘油保存于4℃冰箱。利用酶标仪高通量初筛检测。吸取48深孔板中培养液50μL，乙醇适当稀释超声浸提后4000r/min离心15min，取200μL上清液于96酶标板，用酶标仪测定245nm可见光下的吸光值OD。整个过程中以出发菌株作为对照，根据与对照菌株OD值的比较选择诱变效果明显的诱变菌株进行摇瓶复筛实验；或者是直接选取245nm可见光下的吸光值OD较大的菌株进行摇瓶复筛实验。
摇瓶复筛结果显示，本发明方法准确性很高，能够从众多孢子中筛选得到阿维菌素产量相对较高的菌株。
此外，发明人还对比了本发明的基于流式细胞术与孔板高通量筛选的方法，和传统诱变与孔板高通量筛选直接结合的方法，发现本发明的方法筛选效果极好，不会漏筛具有活性的孢子，分选速度和筛选效率显著提高。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。