本发明涉及紫杉二烯过表达载体及其应用。
背景技术：
1963年美国科学家首次从一种太平洋杉树皮和木材中分离到了紫杉醇的粗提物，并发现其对鼠肿瘤细胞有很高活性。后来通过ⅱ-ⅲ临床研究，紫杉醇被广泛应用于卵巢癌和乳腺癌等癌症的治疗，是现在最有潜能且商业应用最为成熟的一种抗癌药。但随着逐年的砍伐以及生长速度的缓慢，可利用的红豆杉已经越来越少，使得红豆杉的供需失衡问题日趋严重，难以实现可持续商业化生产。现今主要通过化学半合成法生产紫杉醇：通过从红豆杉叶片等组织中提取中间产物如巴卡亭iii、10-去乙酰基巴卡亭ⅲ等，随后通过化学合成生产紫杉醇，但该方法仍然没有摆脱对红豆杉的依赖，因而价格一直居高不下。
利用微生物发酵生产人类所需目标化合物现今已经取得了可喜成果，因而也有很多科学家立志于寻找能产生紫杉醇的微生物来高效生产紫杉醇。自1993年stierle等人发现了第一株能够产紫杉醇的真菌以来，人们已发现并报道了多个种属的真菌具有合成紫杉醇的能力。然而由于检测手段的缺陷以及代谢不稳定的问题则使得其难以被用于商业化生产。
因而，目前代谢稳定，产率较高的紫杉醇产生菌的获得仍有待进一步研究。
技术实现要素：
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种代谢稳定，产率较高的紫杉醇产生菌。
需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现和工作而完成的：
紫杉醇产生菌tpf6为植物内生真菌，其对外界环境要求较为苛刻，存在着次级代谢不稳定的内生菌共性问题，严重影响着真菌产紫杉醇这一方向的科学研究及工业化应用。
而由于以ggpp为底物的紫杉醇生物合成途径涉及19个酶促反应步骤，其中包含着紫杉二烯合酶以及一系列细胞色素p450羟化酶等限速步骤，这极大地限制了紫杉醇的高效生物合成。本发明通过对交链格孢体内涉及前体物质ggpp合成的mva途径中的关键基因以及紫杉醇生物合成第一步所需的紫杉二烯合酶进行过表达，成功地在交链格孢体内实现了紫杉二烯的积累，为后续代谢中间产物的积累提供尽可能多的前体物质。
从而，发明人通过对真菌交链格孢(alternariaalternatatpf6)进行一系列代谢工程改造实现了紫杉醇生物合成前体物质紫杉二烯的积累，使得紫杉二烯产量达到61.91±6.32μg/l，为紫杉醇的生物合成提供尽可能多的底物，从而使得紫杉醇的产率可以有效提高。
由此，在本发明的第一方面，本发明提供了一种紫杉二烯过表达载体。根据本发明的实施例，该载体包含：选自紫杉二烯合酶ts基因、idi基因和thmg1基因的至少之一。
其中，甲羟戊酸途径生成紫杉醇合成的前体物质香叶基香叶基焦磷酸(ggpp)，而其中将hmg-coa还原为甲羟戊酸的基因thmg1、将异戊烯焦磷酸异构为二甲基烯丙基焦磷酸的基因idi均为甲羟戊酸途径的关键基因。紫杉二烯为紫杉醇生物合成第一步所需的底物，而将牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸环化为紫杉二烯的紫杉二烯合酶ts基因则是紫杉二烯合成的关键基因。
由此，将本发明的过表达载体转入产紫杉醇的真菌中，能够使该真菌过表达上述ggpp和紫杉二烯合成的关键基因，从而能够在产紫杉醇的真菌中实现前体物质ggpp和紫杉二烯的积累，为后续代谢中间产物的积累提供尽可能多的前体物质，进而能够有效提高包含本发明的过表达载体的重组微生物的紫杉醇产率，以及发酵生产紫杉醇的代谢稳定性。
根据本发明的实施例，所述载体为质粒。
根据本发明的实施例，所述紫杉二烯合酶ts基因的核酸序列如seqidno.8所示，所述idi基因的核酸序列如seqidno.10所示，所述thmg1基因预先经过tpf6密码子优化，其核酸序列如seqidno.12所示。由此，基因表达效率高。
根据本发明的实施例，进一步包含启动子和终止子。
根据本发明的实施例，所述启动子为选自alca、agda、glaa、trpc、gpda和olic的至少之一，优选alca、trpc和olic的至少之一。
其中，需要说明的是，发明人进行了一系列实验，选择绿色荧光蛋白(gfp)作为启动子强度的筛选标记，分别将其置于不同来源的启动子控制下，以研究不同来源启动子在tpf6体内的启动基因表达能力。结果发现，启动子alca在交链格孢体内具有最强的启动子强度，可用于需要高表达量蛋白的精确控制，而诱导型启动子agda，glaa以及组成型启动子trpc，gpda和olic之间无明显的差别，适合于中等强度的基因的表达。因而，当本发明的过表达载体选择上述启动子时，转入tpf6后表达效果突出。
根据本发明的实施例，所述终止子为选自camv，agda、niad和nos的至少之一。
根据本发明的实施例，进一步包含卡那霉素筛选基因、潮霉素筛选基因、头孢霉素筛选基因。
在本发明的第二方面，本发明提供了一种重组微生物，所述微生物为紫杉醇产生菌。根据本发明的实施例，该重组微生物包含前面所述的紫杉二烯过表达载体。由此，本发明的包含前述过表达载体的重组微生物能够过表达ggpp和紫杉二烯合成的关键基因，从而能够实现前体物质ggpp和紫杉二烯的积累，为后续代谢中间产物的积累提供尽可能多的前体物质，进而能够有效提高紫杉醇产率以及发酵生产紫杉醇的代谢稳定性。
根据本发明的实施例，所述微生物为交链格孢。
在本发明的第三方面，本发明提供了一种制备重组微生物的方法，所述微生物为紫杉醇产生菌。根据本发明的实施例，该方法包括：将前面所述的紫杉二烯过表达载体导入野生型的微生物。由此，能够有效获得前面所述的能够过表达ggpp和紫杉二烯合成的关键基因的本发明的重组微生物。
根据本发明的实施例，所述微生物为交链格孢，所述方法包括以下步骤：
利用钙转的方法将前面所述的紫杉二烯过表达载体转化到农杆菌感受态细胞中；
挑取转化子，并转接到含有第一筛选药物的lb培养基中，28℃过夜培养，使得od达到0.8～1.2；
离心收集菌体，并用im培养基稀释农杆菌至od600为0.5，再在28℃下培养6h，以便获得农杆菌菌液；
利用所述农杆菌菌液将交链格孢孢子稀释至浓度为105个/ml，以便获得混合菌液；
吸取混合菌液涂布于铺有玻璃纸co-im的平板上，25℃共培养3d，其中所述co-im培养基是通过在im培养基中添加1g/l葡萄糖，0.4mmol/l乙酰丁香酮，20g/l琼脂获得的；
将经过共培养的混合菌液倒入含有第二和第三筛选药物的pda培养基中，于28℃下进行筛选培养；
将所述筛选培养中生长出来的转化子挑取到无菌pda平板上，进行传代培养；以及
将经过传代培养的转化子进行pcr验证筛选，以便获得最终转化子，所述最终转化子即为重组交链格孢。
由此，转化效率高，获得的转化子阳性率高。
其中，所述im培养基包含：
0.5g/lnh4no3，0.3g/lnacl，0.01g/lcacl2·2h2o，0.6g/lmgso4·7h2o，0.136g/lkh2po4，0.5mg/lcuso4·5h2o，0.5mg/lznso4·7h2o，0.5mg/lh3bo3，0.5mg/lna2moo4·2h2o，1.3mg/lna2-edta·2h2o，1mg/lfeso4·7h2o，6.3g/lglycerol，8.5g/lmes，2g/l葡萄糖，0.2mmol/l乙酰丁香酮。
根据本发明的实施例，所述第一筛选药物为卡那霉素，所述lb培养基中包含50mg/l的卡那霉素。由此，转化子筛选效率高。
根据本发明的实施例，所述第二筛选药物为潮霉素b，所述第三筛选药物为头孢霉素，所述pda培养基中包含50mg/l潮霉素b和0.5g/l头孢霉素。由此，转化子筛选效率高。
如前所述，本发明的包含前述过表达载体的重组微生物能够过表达ggpp和紫杉二烯合成的关键基因，从而能够实现前体物质ggpp和紫杉二烯的积累，为后续代谢中间产物的积累提供尽可能多的前体物质，进而能够有效提高紫杉醇产率以及发酵生产紫杉醇的代谢稳定性。因而，在本发明的第四方面，本发明提供了前面所述的重组微生物在制备紫杉醇中的用途。利用本发明的重组微生物能够稳定有效地生产紫杉醇。
在本发明的第五方面，本发明提供了一种制备紫杉醇的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将前面所述的重组微生物进行发酵培养。由此，能够稳定有效地获得紫杉醇，且产率较高，发酵生产紫杉醇的代谢稳定性好。
根据本发明的实施例，利用pgt发酵培养基，于28℃、250rpm条件下进行所述发酵培养。由此，发酵培养效果好。
根据本发明的实施例，进一步包括：将发酵培养产物进行萃取，以便获得紫杉醇。由此，获得的紫杉醇纯度高。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了实施例1中，不同外源启动子在交链格孢体内的表达强度检测结果，其中，
图1a：gfp在不同启动子的控制下的质粒的结构示意图，
图1b：荧光显微镜检测交链格孢体内不同启动子控制下的突变株中gfp蛋白表达情况的结果图；以及
图2-图4显示了代谢工程改造tpf6实现紫杉二烯的过表达的结果，其中，
图2：为实施例2中，用于代谢工程改造tpf66实现紫杉二烯的过表达质粒的构建过程，其中lb和rb分别代表用于农杆菌方法转化真菌质粒所携带的左右边界；p代表启动子，分别有trpcp，olicp以及alcap；t代表终止子，分别有camvt，agdat以及nost；ts代表紫杉二烯合酶(taxadienesynthase)，idi代表异戊烯基焦磷酸异构酶(isopentenyldiphosphateisomerase)，thmg1代表截短的羟甲基戊二酸单酰辅酶a还原酶(truncatedversionof3-hydroxy-3-methylglutaryl-coareductase)，
图3：为实施例4中，根据紫杉二烯特征离子碎片122所提取的野生型菌株tpf6、突变株gb127以及紫杉二烯标准品离子流的gc-ms分析结果，
图4：为实施例4中，野生型菌株tpf6、突变株gb127以及紫杉二烯标准品所对应的离子碎片的gc-ms分析结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1启动子不同外源启动子在交链格孢体内的应用
本发明选择绿色荧光蛋白(gfp)作为启动子强度的筛选标记，分别将其置于不同来源的启动子控制下，以研究不同来源启动子在tpf6体内启动基因表达能力。用引物trpc-f-ecori，trpc-r-saci；gpda-f-ecori，gpda-r-saci；alca-f-ecori，alca-r-saci；olic-f-ecori，olic-r-saci从构巢曲霉中pcr扩增得到启动子trpc(seqidno.1)，gpda(seqidno.2)，alca(seqidno.3)以及olic(seqidno.4)。用引物agda-f-ecori，agda-r-saci；glaa-f-ecori，glaa-r-xbai分别从米曲霉(a.oryzae)以及黑曲霉(a.niger)中扩增获得启动子agda(seqidno.5)以及glaa(seqidno.6)。接着分别用引物gfp-f-saci，gfp-r-bsteii；gfp-f-xbai，gfp-r-bsteii扩增获得不同酶切位点的gfp片段(seqidno.7)。最终将启动子trpc，gpda，alca，olic，glaa以及agda分别与酶切后的gfp以及质粒骨架酶连起来得到与之对应的质粒pgb92，pgb93，pgb94，pgb96，pgb98以及pgb99(见图1a)。
本发明所选择的启动子可分为组成型启动子和诱导型启动子。来源于构巢曲霉的组成型启动子trpc，gpda以及olic能够控制基因持续稳定地表达，并不受时空调控和诱导因子的影响。在甘油以及苏氨酸存在的情况下，来源于构巢曲霉(a.nidulansfgsca4)的alca启动子能够被显著诱导实现所控制的目的基因的过表达，而葡萄糖的存在则能够显著抑制其启动基因表达的能力。来源于黑曲霉(aspergillusnigergb01)的glaa启动子以及来源于米曲霉(aspergillusoryzaerib40)的agda启动子则能够被诱导剂麦芽糖诱导实现其所控制基因的过表达。为了研究不同启动子控制下的gfp表达强度，发明人选择gmm培养基作为组成型启动子突变株的培养基。将gmm培养基中的葡萄糖替换为等量的甘油并添加25mm的苏氨酸作为突变株a.alternate::alca-gfp的培养基。将gmm培养基中的葡萄糖替换为20g/l的甘油作为突变株a.alternate::glaa-gfp以及a.alternate::agda-gfp的培养基。采用插片法将交链格孢的不同突变株接种到盖玻片与培养基接触处，培养7天后荧光显微镜(olympusix71)检测不同突变株的荧光强度。
结果显示(见图1b)，突变株a.alternate::alca-gfp的荧光强度最强，剩余的5个突变株具有相似的荧光强度，说明alca在交链格孢体内具有最强的启动子强度，可用于需要高表达量蛋白的精确控制。剩余的诱导型启动子agda，glaa以及组成型启动子trpc，gpda和olic之间无明显的差别，适合于中等强度的基因的表达。
实施例2.真菌tpf6体内紫杉二烯过表达质粒的构建
为了实现在tpf6体内稳定生产紫杉二烯，从而为紫杉醇以及其它中间代谢产物的合成提供足够多的前体物质，来源于taxusbrevifolia的紫杉二烯合酶ts基因按tpf6密码子偏向性优化后进行基因合成(seqidno.8)，随后分别用引物ts-aa-f-saci，ts-aa-r-bsteiipcr扩增获得ts片段，saci-bsteii酶切后连接到相同酶切后的质粒pgb94上得到质粒pgb123。为了获得trpc-idi-aa-niad表达元件，选用引物trpc-f-ecori,trpc-idi-aa-r；niad-idi-aa-f,niad-r-spei从构巢曲霉(a.nidulansfgsc)中分别pcr扩增获得trpc启动子以及niad(seqidno.9)终止子。用引物idi-aa-trpc-f,idi-aa-niad-r扩增获得酿酒酵母(saccharomycescerevisiaeinvsc1)来源的按tpf6密码子优化的idi基因(seqidno.10)，随后利用重叠延伸pcr(soe-pcr)(可参见shevchuk,n.a.,bryksin,a.v.,nusinovich,y.a.,cabello,f.c.,sutherland,m.,ladisch,s.,2004.constructionoflongdnamoleculesusinglongpcr‐basedfusionofseveralfragmentssimultaneously.nucleicacidsres.32,19-19.，通过参照将其全文并入本文)方法将上述三个片段拼接起来获得表达元件trpc-idi-aa-niad。同时，用引物alca-f-spei以及ts-aa-r-bsteii扩增获得目的片段alca-ts-aa，将该片段与trpc-idi-aa-niad表达元件分别用ecori-spei以及spei-bsteii酶切后与ecori-bsteii酶切的pgb92连接起来得到质粒pgb125。为了获得表达元件olic-thmg1-aa-agda，选用引物olic-f-spei，olic-thmg1-aa-r从构巢曲霉(a.nidulansfgsca4)中pcr扩增得到olic启动子；用引物tagda-thmg1-aa-f，tagda-r-spei从米曲霉(a.oryzaerib40)中pcr扩增得到agda(seqidno.11)终止子；用引物thmg1-aa-olic-f，thmg1-aa-agda-r扩增获得酿酒酵母来源的按tpf6密码子优化的thmg1-aa基因(seqidno.12)(其中“aa”为alternariaalternatatpf6拉丁名的首字母缩写组合)。随后利用重叠延伸pcr(soe-pcr)方法将上述三个片段拼接起来获得表达元件olic-thmg1-aa-agda，将该片段以及质粒pgb125用spei酶切后酶连，得到质粒pgb127(图2)(seqidno.13)。
实施例3.重组交链格孢的获得——农杆菌介导的交链格孢遗传操作方法
选用钙转的方法将实施例2构建的用于转化交链格孢的质粒pgb127转化到农杆菌(agrobacteriumtumefacienseha105)感受态细胞中。随后挑取转化子转接到8ml含有50mg/l的卡那霉素的lb培养基中，28℃过夜培养(12-15h)，使得od达到0.8～1.2。随后5000rpm，5min收集菌体，并用im(0.5g/lnh4no3，0.3g/lnacl，0.01g/lcacl2·2h2o，0.6g/lmgso4·7h2o，0.136g/lkh2po4，0.5mg/lcuso4·5h2o，0.5mg/lznso4·7h2o，0.5mg/lh3bo3，0.5mg/lna2moo4·2h2o，1.3mg/lna2-edta·2h2o，1mg/lfeso4·7h2o，6.3g/lglycerol，8.5g/lmes，2g/l葡萄糖，0.2mmol/l乙酰丁香酮)培养基稀释农杆菌至od600为0.5，再在相同条件下培养6h得农杆菌液备用。
同时用无菌水将交链格孢孢子从28℃培养了25天的pda斜面上洗下来，用无菌擦镜纸过滤得孢子悬液，随后将孢子悬液转移至含有玻璃珠的锥形瓶中28℃，220rpm摇床培养30min以释放孢子，之后收集孢子并将其浓度调整至106浓度备用。用im培养基预培养6h的农杆菌菌液将交链格孢孢子稀释至105个/ml的浓度后吸取200μl涂布于铺有玻璃纸co-im(co-im：im培养基基础上添加1g/l葡萄糖，0.4mmol/l乙酰丁香酮，20g/l琼脂)平板上，25℃共培养3d。
共培养3d后将玻璃纸揭起放入空的无菌培养皿中，然后倒入约20ml含有50mg/l潮霉素b和0.5g/l头孢霉素(cs)的pda培养基，28℃培养，将生长出来的转化子挑取到无菌pda平板上，传代培养后提取基因组并用相应引物pcr验证筛选获得最终转化子，得到突变株a.alternategb127。
实施例4紫杉醇的制备
将pda平板上活化好的野生型菌株a.alternatetpf6以及突变株a.alternategb127(实施例3制备获得的)分别接种于含有100mlpgt发酵培养基(200g/l土豆，12.6g/l甘油，1g/l葡萄糖，3g/l苏氨酸)的500ml锥形瓶中，28℃/250rpm培养14d。待发酵结束后用等体积的有机溶剂正己烷/乙酸乙酯(4/1)萃取发酵液及菌体2次，合并有机相减压蒸馏后薄层层析法纯化紫杉二烯并用gc-ms鉴定。
发酵结果显示，相较于野生型菌株a.alternatetpf6，突变株a.alternategb127能够合成足够多的紫杉二烯，其产量为61.91±6.32μg/l(图3，图4)。从图3和图4中发明人可以看出野生型的tpf6菌株产生的紫杉二烯量很低，难以被检测到，而改造后的突变株gb127则产生足够量的紫杉二烯，能够被gc-ms检测到，并且与紫杉二烯标准品具有相同的保留时间以及碎片离子。也即，结果表明本发明能够显著提升交链格孢体内的紫杉二烯的产量，解决了紫杉醇生物合成途径中的第一个限速步骤，为紫杉醇以及代谢中间产物的生物合成提供足够多的前体物质，为后续的代谢工程改造产紫杉醇打下了坚实的基础。
sequenceno.1
>trpc启动子(a.nidulansfgsca4)
cagaagatgatattgaaggagcactttttgggcttggctggagctagtggaggtcaacaatgaatgcctattttggtttagtcgtccaggcggtgagcacaaaatttgtgtcgtttgacaagatggttcatttaggcaactggtcagatcagccccacttgtagcagtagcggcggcgctcgaagtgtgactcttattagcagacaggaacgaggacattattatcatctgctgcttggtgcacgataacttggtgcgtttgtcaagcaaggtaagtgaacgacccggtcataccttcttaagttcgcccttcctccctttatttcagattcaatctgacttacctattctacccaagc
sequenceno.2
>gpda启动子(a.nidulansfgsca4)
acagtgaccggtgactctttctggcatgcggagagacggacggacgcagagagaagggctgagtaataagcgccactgcgccagacagctctggcggctctgaggtgcagtggatgattattaatccgggaccggccgcccctccgccccgaagtggaaaggctggtgtgcccctcgttgaccaagaatctattgcatcatcggagaatatggagcttcatcgaatcaccggcagtaagcgaaggagaatgtgaagccaggggtgtatagccgtcggcgaaatagcatgccattaacctaggtacagaagtccaattgcttccgatctggtaaaagattcacgagatagtaccttctccgaagtaggtagagcgagtacccggcgcgtaagctccctaattggcccatccggcatctgtagggcgtccaaatatcgtgcctctcctgctttgcccggtgtatgaaaccggaaaggccgctcaggagctggccagcggcgcagaccgggaacacaagctggcagtcgacccatccggtgctctgcactcgacctgctgaggtccctcagtccctggtaggcagctttgccccgtctgtccgcccggtgtgtcggcggggttgacaaggtcgttgcgtcagtccaacatttgttgccatattttcctgctctccccaccagctgctcttttcttttctctttcttttccc
sequenceno.3
>alca启动子(a.nidulansfgsca4)
cgggatagttccgacctaggattggatgcatgcggaaccgcacgagggcggggcggaaattgacacaccactcctctccacgcaccgttcaagaggtacgcgtatagagccgtatagagcagagacggagcactttctggtactgtccgcacgggatgtccgcacggagagccacaaacgagcggggccccgtacgtgctctcctaccccaggatcgcatccccgcatagctgaacatctatataa
sequenceno.4
>olic启动子(a.nidulansfgsca4)
ctgcagctgtggagccgcattcccgattcgggccggattggtcaagatttgcgtccgaggtgccgtctatcattctagcttgcggtcctgggcttgtgactggtcgcgagctgccactaagtggggcagtaccattttatcggacccatccagctatgggacccactcgcaaatttttacatcattttctttttgctcagtaacggccaccttttgtaaagcgtaaccagcaaacaaattgcaattggcccgtagcaaggtagtcagggcttatcgtgatggaggagaaggctatatcagcctcaaaaatatgttgccagctggcggaagcccggaaggtaagtggattcttcgccgtggctggagcaaccggtggattccagcgtctccgacttggactgagcaattcagcgtcacggattcacgatagacagctcagaccgctccacggctggcggcattattggttaacccggaaactcagtctccttggccccgtcccgaagggacccgacttaccaggctgggaaagccagggatagaatacactgtacgggcttcgtacgggaggttcggcgtagggttgttcccaagttttacacaccccccaagacagctagcgcacgaaagacgcggagggtttggtgaaaaaagggcgaaaattaagcgggagacgtatttaggtgctagggccggtttcctccccatttttcttcggttccctttctctcctggaagactttctctctctctcttcttctcttcttccatcctcagtccatcttcctttcccatcatccatctcctcacctccatctcaactccatcacatcacaatcgatcc
sequenceno.5
>agda启动子(a.oryzaerib40)
gccatcggatgctcccgtcatggcaccactagagatggcgtggaaaaccctcaccggcacaccggaggggtttaggcaccttggaatatgaggtggggaacgatgtatttgccagtattgactctggtgaatggatctctcgagaaatactaccttttcagggctcaagcgtcgtgtcgggcatttatcgggggatggaccaatcagcgtagggatatcagatgatcgccagcattggtcaggaacgtttccaatttccggacacggaagtactgtaactgctcccaagaatcaacacactcttttccggtctcgtcctttgctcggcagagattcatctcccatcgtcggcttaaccggtactctttcgtcacgttccaaaaggcttgatcatgctgtccccactccgtgcgggtgaagccacctcattgctgcgtaggacctatacccttcaactagcgtgacttcttcccctctcatggtcgagagattgcaggcaatgcccctcggacgtttgacggggaatgttttgccttcacggcaggtagcacaaatcgatgggaacgggacgggccatcaattgtgagggatttcccgtggacacctggttcgtcaagacatatacatctagctacaattccggttcggagacggcagaggggtccgtttcttaaaagaacaactacaacacggtccggaatcaacttggcggaccacgac
sequenceno.6
>glaa启动子(a.nigergb01)
ggatccgaactccaaccggggggagtatattgagtggccgcagtggaaggaatcgcggcagttgatgaatttcggagcgaacgacgccagtctccttacggatgatttccgcaacgggacatatgagttcatcctgcagaataccgcggcgttccacatctgatgccattggcggaggggtccggacggtcaggaacttagccttatgagattaatgatggacgtgtctggcctcggaaaaggatatatggggatcataatagtactagccatattaatgaagggtatataccacgcgttggacctgcgttatagcttcccgttagttatagtaccatcgttataccagccaatcaagtcaccacgcacgaccggggacggcgaatccccgggaattgaaagaaattgcatcccaggccagtgaggccagcgattggccacatctccaaggcacagggccattctgcagcgctggtggattcatcgcaatttcccccggcccggcccgacaccgctataggctggttctcccacaccatcggagattcgtcgcctaatgtctcgtccgttcacaagctgaagagcttgaagtggcgagatgcctctgcaggaattcaagctagatgctaagcgatattgcatggcaatttgtgttgatgcatgtgcttcttccttcagcttcccctcgtgcagatgaggtttggctataaattgaagtggttggtcggggttccgtgaggggctg
sequenceno.7
>gfp
atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaa
sequenceno.8
>ts-aa(t.brevifolia，按a.alternatetpf6进行密码子优化)
atgtcctcctccaccggcaccagcaaggtcgtcagcgagaccagcagcaccatcgtcgacgacatcccccgcctcagcgccaactaccacggcgacctgtggcaccacaacgtcatccagaccctcgagacccccttccgcgagtcctctacctaccaggagcgtgccgacgagctggtcgtcaagatcaaggacatgttcaacgctctcggtgacggcgacatctccccttctgcctacgacaccgcttgggtcgctcgtctcgctaccatcagctccgacggttctgagaagccccgtttccctcaggctctgaactgggtcttcaacaaccagctccaggacggctcctggggtatcgagtctcacttcagcctctgcgaccgcctcctgaacaccaccaactctgtcatcgccctcagcgtctggaagaccggtcactcccaggtccagcagggtgctgagttcatcgctgagaacctccgtctcctgaacgaggaggacgagctgtcccccgacttccagatcatcttccctgctctcctgcagaaggctaaggccctgggcatcaacctcccctacgacctgcctttcatcaagtacctgagcaccacccgtgaggctcgtctcaccgacgtttccgctgctgccgacaacatccccgctaacatgctcaacgccctggagggtctcgaggaggtcatcgactggaacaagatcatgcgcttccagtccaaggacggctctttcctctctagccccgcctccaccgcttgcgtcctcatgaacaccggtgacgagaagtgcttcaccttcctcaacaacctcctggacaagttcggtggctgcgtcccttgcatgtacagcatcgacctcctggagcgcctctccctggtcgacaacatcgagcacctcggtatcggccgtcacttcaagcaggagatcaagggtgctctcgactacgtctaccgccactggtccgagcgtggtatcggttggggtcgtgactctctcgtccccgacctgaacaccaccgctctcggtctgcgtaccctccgtatgcacggttacaacgtctcctctgacgttctcaacaacttcaaggacgagaacggccgcttcttcagctccgctggtcagacccacgtcgagctgcgctctgtcgtcaacctgttccgtgctagcgacctcgctttccctgacgagcgtgctatggacgacgctcgtaagttcgctgagccttacctccgtgaggctctggccaccaagatcagcaccaacaccaagctcttcaaggagatcgagtacgtcgtcgagtacccctggcacatgtccatccctcgcctcgaggcccgtagctacatcgactcctacgacgacaactacgtctggcagcgcaagaccctgtaccgtatgcccagcctctccaactctaagtgcctcgagctggctaagctcgacttcaacatcgtccagtccctccaccaggaggagctgaagctcctgacccgctggtggaaggagtctggcatggccgacatcaacttcacccgccaccgtgtcgctgaggtctacttctctagcgccaccttcgagcccgagtactccgctacccgtatcgccttcaccaagatcggctgcctgcaggtcctcttcgacgacatggctgacatcttcgccaccctggacgagctgaagtctttcaccgagggtgtcaagcgctgggacaccagcctcctgcacgagatccctgagtgcatgcagacctgcttcaaggtctggttcaagctcatggaggaggtcaacaacgacgttgtcaaggtccagggtcgtgacatgctcgctcacatccgtaagccctgggagctgtacttcaactgctacgtccaggagcgtgagtggctcgaggctggttacatccctaccttcgaggagtacctcaagacctacgccatctccgtcggtctcggtccttgcaccctgcagcctatcctcctgatgggcgagctggtcaaggacgacgttgtcgagaaggtccactacccctccaacatgttcgagctggtcagcctctcctggcgcctcaccaacgacaccaagacctaccaggctgagaaggctcgtggtcagcaggcttccggtatcgcctgctacatgaaggacaaccctggcgctaccgaggaggacgccatcaagcacatctgccgcgtcgtcgaccgtgctctcaaggaggcctccttcgagtacttcaagccctctaacgacatccctatgggttgcaagtccttcatcttcaacctccgcctgtgcgtccagattttctacaagttcatcgacggctacggtatcgctaacgaggagatcaaggactacatccgtaaggtctacatcgaccccatccaggtctaa
sequenceno.9
>niadterminator(a.nidulansfgsca4)
actagacgggttcgcataggtttggggttgtatcttggcgttgggacggactgggtatggtgtttcttttggatatatgacatgatatgtacacggccgtgaatctttaactttatatcattatagaaatgcacttgcacatttcaacacgctgcgagcagaatctcgaagattgttccgcaagtattagatcatgagagcattttcatttcctttcaggcagtgggagtaggccatcctgaaaacaaggcggccactgtagactagag
sequenceno.10
>idi-aa(s.cerevisiae，按a.alternatetpf6进行密码子优化)
atgactgccgacaacaactctatgccccacggtgccgtctcttcttacgccaagctcgtccagaaccagacccctgaggacatcctggaggagttccccgagatcatccctctccagcagcgccccaacacccgttcctctgagaccagcaacgacgagtccggcgagacctgcttctccggccacgacgaggagcagatcaagctgatgaacgagaactgcatcgtcctcgactgggacgacaacgccatcggtgctggcaccaagaaggtctgccacctcatggagaacatcgagaagggtctcctgcaccgcgccttctccgtcttcatcttcaacgagcagggcgagctcctgctccagcagcgtgctaccgagaagatcaccttccccgacctgtggaccaacacctgctgctctcaccctctctgcatcgacgacgagctgggtctcaagggcaagctcgacgacaagatcaagggtgccatcaccgctgctgtccgtaagctggaccacgagctcggtatccctgaggacgagaccaagacccgcggcaagttccacttcctcaaccgtatccactacatggctccttccaacgagccttggggcgagcacgagatcgactacatcctgttctacaagatcaacgctaaggagaacctcaccgtcaaccccaacgtcaacgaggtccgtgacttcaagtgggtctctcctaacgacctgaagaccatgttcgctgaccccagctacaagttcaccccttggttcaagatcatctgcgagaactacctcttcaactggtgggagcagctggacgacctgagcgaggtcgagaacgaccgccagatccaccgtatgctgtaa
sequenceno.11
>agdaterminator(a.oryzaerib40)
ttgtattggtattaccagaacgtcacgagaccgcctgccgcaatgttctcatcctttctttgctactagcaagttttttcgcaatttctcgaagctttagatggtcttttcttttccagtcgaaagctactagccggtcttttctgtcctattcagcttaggcagttataggatatcttcaagattcaggtactctttgactacacacaatgccctatgatatgaagggtaaatgtgtgggtatcattcattggatcttaagtaaggcacagcccgcggagcagaaatgaagctccttgtatgacatcaccaaatggtcacttaatgcaatttcgaaccctttccatccgagctcaagttcgagagctcagttcccattttactcatcttttttacttagaagagggatataatctaataacaaactgatttaaatgaacacagagctattactttcaaatttggcttaatgtccacttctcgccacccaacggtcctatggggtagtggttatcccaccggattttgatgaacaatatacatgtcctgtatatgtgtaggaagat
sequenceno.12
>thmg1-aa(s.cerevisiae，按a.alternatetpf6进行密码子优化)
atggtcctcaccaacaagaccgtcatcagcggttccaaggtcaagtccctctcctctgctcagtcctcctcctccggtccttcctctagctccgaggaggacgactcccgcgacatcgagtctctcgacaagaagatccgtcccctcgaggagctggaggctctcctgtctagcggtaacaccaagcagctcaagaacaaggaggtcgccgctctggtcatccacggtaagctccccctgtacgctctcgagaagaagctgggtgacaccacccgcgccgtcgctgtccgccgtaaggccctctctatcctggctgaggctcctgtcctcgctagcgaccgcctgccctacaagaactacgactacgaccgtgtcttcggtgcctgctgcgagaacgtcatcggctacatgcccctccctgtcggtgtcatcggccctctggtcatcgacggcacctcctaccacatccctatggccaccaccgagggttgcctcgtcgcttccgctatgcgtggttgcaaggccatcaacgctggtggcggtgctaccaccgtcctcaccaaggacggtatgacccgcggccctgtcgtccgtttccctaccctcaagcgcagcggtgcctgcaagatttggctcgactccgaggagggccagaacgccatcaagaaggctttcaactctaccagccgcttcgcccgtctccagcacatccagacctgcctggctggcgacctcctgttcatgcgcttccgtaccaccaccggtgacgctatgggcatgaacatgatctctaagggcgtcgagtacagcctcaagcagatggtcgaggagtacggttgggaggacatggaggtcgtctccgtctctggcaactactgcaccgacaagaagcctgccgctatcaactggatcgagggtcgtggcaagtccgtcgtcgctgaggctaccatccccggtgacgtcgtccgtaaggtcctcaagtctgacgtcagcgccctcgtcgagctgaacatcgctaagaacctcgtcggtagcgctatggccggctccgtcggtggtttcaacgctcacgctgctaacctcgtcaccgctgtcttcctcgctctgggtcaggaccccgctcagaacgtcgagtcctctaactgcatcaccctcatgaaggaggttgacggcgacctgcgcatcagcgtctccatgccttccatcgaggtcggcaccatcggtggtggcaccgtcctcgagcctcagggtgctatgctggacctcctgggtgtccgtggtcctcacgctaccgcccccggcaccaacgctcgtcagctcgctcgtatcgtcgcttgcgctgtcctcgctggcgagctgtccctgtgcgctgctctcgctgctggccacctggtccagtctcacatgacccacaaccgcaagcccgccgagcctaccaagcccaacaacctcgacgctaccgacatcaaccgtctcaaggacggctccgtcacctgcatcaagtcttaa
sequenceno.13
pgb127序列(不含骨架)
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在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。