一种可降解多环芳烃的菌株及其应用的制作方法

本发明涉及一种可降解多环芳烃的菌株及其应用，属于生物工程
技术领域：
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背景技术：
：多环芳烃是一类持久性有机污染物。土壤环境中多环芳烃污染主要来自于石油及其衍生产品的生产使用和木材、有机高分子化合物、纸张等含碳氢化合物的物质的不完全燃烧。由于多环芳烃及其衍生物具有致癌性、致突变性和致畸性，目前多环芳烃污染修复问题已引起人们的极大关注。目前，对于这些多环芳烃类的污染物，某些特定种类的微生物可催化多环芳烃进行氧化还原、脱羧、水解和脱水等各种化学反应，使之最终矿化。较之其他多环芳烃污染的修复处理，采用微生物降解能够更有效、低耗能地降解这些难降解的污染物，且微生物降解也是现今多环芳烃污染修复的主要途径。为此国内外进行了大量多环芳烃降解微生物的筛选工作。到目前为止，已分离出多个具有多环芳烃降解能力的菌株。然而，就目前已报道的这些多环芳烃降解微生物中，大多只能降解萘(2环)、芴(3环)等低环多环芳烃，而当多环芳烃的苯环个数达到或超过4个时，其生物毒性明显升高，生物可降解性显著降低。虽然，现有技术中也有筛选到的菌株能够降解高环多环芳烃的效果，如中国专利(授权公告号：CN102943052B)公开了一株耐重金属的多环芳烃降解菌，其也能够降解多环芳烃萘、菲、荧蒽、芘、苯并蒽和苯并芘的能力。但是，目前筛选到这一些的具有降解多环芳烃尤其是能够降解高环多环芳烃的菌株仍然相对较少，使其应用受到了一定的限制。因此，如何筛选得到更多的菌株，使能够高效降解高环多环芳烃的微生物菌株显得尤为重要，使更广泛的采用生物降解多环芳烃污染的应用。技术实现要素：本发明针对上述现有技术中所存在的问题，本发明提供一种可降解多环芳烃的菌株及其应用，解决的问题是如何实现一种能够降解高环多环芳烃的新菌株。本发明的目的之一是通过以下技术方案得以实现的，一种可降解多环芳烃的菌株，其特征在于，该菌株为CitrobacterfreundiiL2-14，在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCCNO：M2016371。本发明可降解多环芳烃的菌株是从多环芳烃污染的土壤中筛选得到的一株新的菌株，属于弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)，命名为L2-14，该菌株已于2016年07月04日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCNO：M2016371，保藏地点为中国武汉武汉大学，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山。本发明可降解多环芳烃的菌株可在15～35℃，pH值6.0～8.5培养条件下较好生长；菌株形态特征为革兰氏阴性，杆状，周生鞭毛，无芽孢，不生荚膜；菌株在LB固体培养基上培养18小时可形成圆形半透明的菌落，表面湿润，边缘整齐；同时，本菌株对多环芳烃污染，尤其是对高环多环芳烃具有快速降解能力，且降解底物范围广、降解率高，从而也使其在多种多环芳烃污染修复中有着广阔的应用潜力。在上述可降解多环芳烃的菌株中，作为优选，所述菌株的16SrRNA序列如SEQ.NO1所示。菌株的另一种表达形式，具有相应的碱基序列。在上述可降解多环芳烃的菌株中，作为优选，所述菌株具有降解多环芳烃的能力。由于本菌株能够以多环芳烃为碳源进行生长，尤其是对高环芳烃的也具有较好的降解能力，从而使具有降解多环芳烃的能力，实现对污染土壤的修复过程。在上述可降解多环芳烃的菌株中，其中的多环芳烃可以是低环多环芳烃如萘、芴等等，也可以是高环芳烃，本菌株对这些多环芳烃均具有较好的降解能力。作为优选，所述多环芳烃为具有4环以上的多环芳烃。由于多环芳烃的苯环个数达到或超过4个时，其生物毒性明显升高，生物可降解性显著降低，而本发明通过筛选得到的菌株对具有4环以上的多环芳烃有着很好的适应性，对这些高环的多环芳烃同样具有较好的降解效果，从而能够对高环多环芳烃污染的环境达到修复的效果。作为进一步的优选，所述多环芳烃选自菲、荧蒽、芘、苯并蒽或苯并芘。在上述可降解多环芳烃的菌株中，作为优选，所述菌株具有以多环芳烃为碳源和能源进行生长的能力。正是由于该菌株能够以多环芳烃为碳源和能源进行生长，从而实现对污染物多环芳烃降解的效果。当然，本菌株也可以在营养培养基如普通牛肉膏蛋白胨、普通LB、营养琼脂中生长。本发明的目的之二是通过以下技术方案得以实现的，一种上述可降解多环芳烃的菌株应用，其特征在于，所述菌株用于修复多环芳烃污染的土壤。由于本发明的可降解多环芳烃菌株能够以多环芳烃为碳源和能源进行生长，从而也具有了对多环芳烃污染物进行降解的能力，通过将其应用到污染土壤中对污染物进行降解，从而达到修复土壤的效果，且由于本菌株对于高环多环芳烃也具有较好的降解能力，从而也提高了其应用的广泛性。综上所述，与现有技术相比具有以下优点：1.本发明可降解多环芳烃的菌株，能够对多环芳烃污染实现快速解降的效果，尤其是对高环多环芳烃有快速降解能力，且降解底物范围广、降解率高。2.本发明可降解多环芳烃的菌株，具有以多环芳烃为碳源和能源进行生长的能力，无需外加其它碳源和能源，就能够从而实现有针对性的解降多环芳烃污染物的效果。附图说明图1本可降解多环芳烃的菌株CitrobacterfreundiiL2-14随时间对萘的降解曲线图。图2本可降解多环芳烃的菌株CitrobacterfreundiiL2-14随时间对芘萘的降解曲线图。图3本可降解多环芳烃的菌株CitrobacterfreundiiL2-14随时间对苯并芘的降解曲线图。具体实施方式下面通过具体实施例和附图，对本发明的技术方案作进一步具体的说明，但是本发明并不限于这些实施例。实施例1本可降解多环芳烃菌株CitrobacterfreundiiL2-14的分离和筛选从某固废拆解场采集距地表下15cm处的表层土壤样品，按每1g土壤样品加入1mL驯化液的比例(土壤样品：驯化液的比例为1g：1mL)加入驯化液进行驯化培养,驯化培养条件为温度25℃，转速100rpm，时间72h。其中，上述驯化液的配方为：(NH4)2SO4：2g/L；MgSO4：0.2g/L；K2HPO4：4g/L；KH2PO4：6g/L；多环芳烃(萘、菲、荧蒽、芘、苯并蒽和苯并芘)混合物200mg/L，其中，萘、菲、荧蒽、芘、苯并蒽和苯并芘的加入量可以是等量，也可以采用不同的含量，主要是加入这些多环芳烃起到较好的驯化效果。然后，将上述驯化混合物按质量比为1：50的比例接种于无机盐选择培养基中进行选择培养，其中，无机盐选择培养基配方为：蛋白胨：5g/L；(NH4)2SO4：2g/L；MgSO4：0.2g/L；K2HPO4：4g/L；KH2PO4：6g/L；多环芳烃(萘、菲、荧蒽、芘、苯并蒽和苯并芘)混合物200mg/L，其中，萘、菲、荧蒽、芘、苯并蒽和苯并芘的加入量可以是等量，也可以采用不同的含量；选择培养条件为温度25℃，转速100rpm，时间72h，得到相应的选择培养物。将上述选择培养物用磷酸盐缓冲溶液进行梯度稀释，选取合适浓度的梯度稀释液稀释涂布于固体无机盐选择培养基上，选取单菌落进行分离，即分离出一株菌株命名为L2-14。该菌株于2016年7月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号CCTCCNO：M2016371。同时，对该菌株进行鉴定，其中，菌株L2-14的16SrDNA基因PCR扩增、测序由上海美吉生物公司完成，得到长度为1430bp的序列，具体测序结果见SEQNO.1。同时，根据测序结果构建系统发育树，选择同源性大于97％的基因序列进行系统发育分析，系统发育树分析结果表明菌株L2-14与Citrobacterfreundii的进化距离最近，结合形态、菌落特征及生理生化特性，鉴定菌株属于弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)，即本CitrobacterfreundiiL2-14菌株。将本CitrobacterfreundiiL2-14菌株接种在LB固体培养基(胰蛋白胨1.0％，酵母提取物0.5％，氯化钠1.0％，琼脂2％)培养18小时形成圆形半透明的菌落，表面湿润，边缘整齐。且该菌株CitrobacterfreundiiL2-14的生理生化特征如下表1所示：表1：鉴定项目鉴定结果吲哚产生-M.R实验+V.P实验-明胶水解-尿酶实验+H2S+苯丙氨酸脱羧酶-精氨酸双水解酶-KNO3+KCN+丙二酸盐利用-柠檬酸盐利用+葡萄糖利用+麦芽糖利用+阿拉伯糖利用+木糖利用+甘露醇利用+蔗糖利用+实施例2本CitrobacterfreundiiL2-14菌株用于降解多环芳烃取本菌株CitrobacterfreundiiL2-14接种在LB固体培养基中进行活化；再选取单菌落接种于5mL的LB液体培养基进行培养，在温度28℃且转速100rpm的条件下进行培养至菌液OD600≈1；然后，将菌液按照2％的接种量接种于无机盐葡萄糖培养基中，在温度28℃且转速100rpm的条件下培养至菌液OD600≈1；其中，无机盐葡萄糖培养基配方为：蛋白胨：5g/L；葡萄糖：10g/L；(NH4)2SO4：2g/L；MgSO4：0.2g/L；K2HPO4：4g/L；KH2PO4：6g/L，培养结束后，得到相应的菌液。将上述菌液用10000r/min离心机离心5分钟，取下层菌体沉淀，用pH为7.0～7.5的磷酸盐缓冲液洗涤2次，备用。取上述菌体分别等体积重悬于无机盐-萘、无机盐-芘、无机盐-苯并芘培养基中，控制温度为25℃、转速为100rpm进行培养12天。过程中采用高效液相色谱检测不同时间的上述三种体系中萘、芘、苯并芘的含量来测试降解效果；其中，无机盐-萘培养基配方为：蛋白胨：2g/L；(NH4)2SO4：2g/L；MgSO4：0.2g/L；K2HPO4：4g/L；KH2PO4：6g/L；萘：200mg/L；无机盐-芘培养基配方为：蛋白胨：2g/L；(NH4)2SO4：2g/L；MgSO4：0.2g/L；K2HPO4：4g/L；KH2PO4：6g/L；芘：200mg/L；无机盐-苯并芘培养基配方为：蛋白胨：2g/L；(NH4)2SO4：2g/L；MgSO4：0.2g/L；K2HPO4：4g/L；KH2PO4：6g/L；苯并芘：200mg/L。其中，检测结果如图1-3所示；从图中可以看出，12天后，上述体系中萘、芘、苯并芘的降解率分别为84.6％、84.6％、62.6％，从而也说明了本发明的菌株具有较好的降解多环芳烃的能力，同时也能够较好的降解高环多环芳烃的能力。同样，将无机盐-苯并芘培养基中的苯并芘替代为菲、荧蒽或苯并蒽，12天后，降解率均能够达到60％以上。本发明中所描述的具体实施例仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属
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的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例，但是对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。当前第1页1 2 3