利用莱比托游动球菌催化底物制备丹参素，属于生物工程技术领域。本发明涉及一种以莱比托游动球菌催化底物制备丹参素的方法，该发明对于丹参素的工业化生产有着重要意义。
背景技术：
丹参素，学名R-(+)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-羟基丙酸、D-(+)-β-(3,4-二羟基苯基)乳酸，英文名为：Danshensu、(R)-(+)-3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-lactic acid、(R)-(+)-3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-2-hydroxypropanoic acid，是一种右旋酚酸类化合物。
丹参素是丹参水提液中的重要要有效成份，国内于1980年从丹参水提液中得到并鉴定了结构(丹参水溶性有效成分的研究,Ⅱ.D(+)β(3,4-二羟基苯基)乳酸的结构，上海第一医学院学报，1980，05(7)，384-385)，确定了天然丹参素为右旋，全称为D-丹参素。各种研究表明丹参素具有重要的药理药效作用，在心脑血管疾病的治疗等方面具有独特治疗作用。
当前丹参素主要从丹参中提取得到(专利CN200810038853.9)。丹参素在丹参中的含量较低，并且丹参素种植成本高且产量有限，因此当前丹参素不仅价格高而且远远无法满足市场的需求。专利CN201310559498.0提出了一种构建大肠杆菌基因工程图利用葡萄糖发酵产丹参素的方法，由于合成代谢途径涉及利用羟基化酶，该酶很容易使代谢过程产物氧化而影响丹参素的产率，同时由于大肠杆菌发酵是高耗氧过程，也会氧化丹参素，因此当前该方法产率较低，成本将会高于植物提取过程。专利CN201210190171.6提出了水解丹酚酸B生产丹参素的方法，丹酚酸B需从丹参提取，并且化学水解过程有大量副反应，同样不适用于规模化生产。手性合成丹参素(专利CN201210420488.4)的催化剂极为昂贵，当前也仅停留在实验室水平。
基于丹参素的重要应用价值，本发明采用莱比托游动球菌以特定底物转化生产丹参素，转化率高，成本低，步骤简便，可用于工业化生产。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种采用莱比托游动球菌催化底物制备丹参素的方法。所述方法包括：工艺A，在莱比托游动球菌培养过程中加入底物，生成丹参素。工艺B，首先培养得到莱比托游动球菌菌体，然后以菌体全细胞将底物转化成丹参素，技术方案如下：
1、菌株
本发明所用的菌株有购自美国ATCC菌种库的莱比托游动球菌Planococcus rifietoensis ATCC BAA-790，也可以是其突变株或任何菌种库可公开购得的莱比托游动球菌株。
2、菌体培养
液态发酵培养基组成为：碳源0-50g/L，氮源0-50g/L，磷酸氢二铵0-2g/L，磷酸二氢钾0-1g/L，硫酸镁0-0.5g/L，硫酸亚铁0-0.5g/L，氯化纳0-5g/L，可调节pH至2-8，可也pH自然；接种量为5-20％，发酵温度为20-35℃，发酵周期为24-72小时。种子和发酵均采用此培养基。
用于培养菌种的碳源可以是葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、半乳糖、甘油。培养用氮源可以是硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、尿素、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、玉米浆。碳源和氮源可以是一种或多种的组合。
3、转化产丹参素
转化过程采用的工艺有2种：
工艺A：细胞的液态培养过程，将底物加入上述的培养体系中；底物添加量为0.1-3g/L，液体培养时间24-72小时。
工艺B：将液态发酵培养物离心去除发酵液得到菌体，将菌体放入含有底物的水溶液反应体系中进行；转化过程温度20-35℃，pH 4-8，转化时间1-72小时。转化液中底物起始浓度为0.1-10g/L。
工艺A)或工艺B)的底物可以是以如下所示的肉桂酸及其结构相近物：肉桂醛、肉桂醇、L-多巴、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸。
4、样品的检测分析
丹参素含量采用PerkinElmer Series 200高效液相色谱仪检测分析，色谱条件为：流动相是甲醇-0.1％甲酸水(40:60)、采用汉邦Megres C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)，流速0.6ml/min、柱温30℃、进样量20μl、检测器波长280nm。
丹参素的构型及准确结构测定方法为：采用江苏汉邦科技有限公司的DAC-HB50制备色谱柱制备转化样品，制备色谱条件为：流动相50％甲醇、柱温自然、流速3ml/min、进样量5ml。样品达到色谱纯99.9％，反复进样分离得到的产品于50℃下真空旋转蒸干。称取制备得到的样品0.5g，溶于去离子水中并定容至50ml，采用日本爱宕AP-300全自动旋光仪测定放光度。进一步采Varian Gemini 2000(VnmrS 600MHz,600/54/ASP)分析样品的核磁数据。样品进一步采用UPLC-QTOF-MS法分析分子量，仪器为Waters MALDI SYNAPT QTOF MS液相色谱串联四极杆飞行时间质谱仪。
具体实施方式
实施例1
转化产物的分析测定。
配制培养基如下：葡萄糖20g/L，酵母酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L。500ml三角瓶中装液量为100ml，共50瓶，120℃，20分钟灭菌。取Planococcus rifietoensis ATCC BAA-790甘油管种子液1mL接种，发酵温度30℃，摇床转速200rpm。培养24后，将发酵液离心(转速10000rpm，时间10min)，去除上清液获得菌体，离心获得的菌体用无菌水清洗一遍后再离心(转速10000rpm，时间10min)得到湿菌体。取20g湿菌体放入肉桂酸浓度为2g/L的1000ml溶液中，混合均匀。于35℃摇床振荡(100rpm)24小时后，100℃水浴加热3分钟杀灭菌体。再离心(转速10000rpm，时间10min)去除菌体，得到转化后的上清液。液相分析丹参素浓度为0.9g/L。采用制备色谱得到0.73g纯品。
旋光仪分析其旋光度为核磁数据为:1H NMR(DMSO-d6,600MHz):δ8.74(s,1H),6.66(dd,J＝24Hz,1H),6.65(dd,J＝12Hz,1H),6.46(dd,J＝24Hz,1H),5.46(s,1H),4.06-4.18(m,1H),2.61-2.80(m,1H)；13C NMR(DMSO-d6,600MHz):δ175.6,173.2,144.6,144.3,143.5,143.2,128.5,128.4,120.3,120.1,116.9,116.2,115.4,114.8,71.8,71.7,51.3。转化产物的质谱数据为：(-ESI,negative mode)m/z:197.0[M-1]。
根据以上数据及相关文献(Stereochemical configuration ofβ-(3,4-dihydroxyphenyl)lactic acid from Rosmarinus officinalis.Ricerea Sci.80:255-259.[Chem.Abs.54:24520.1960]，丹参水溶性有效成分的研究,Ⅱ.D(+)β(3,4-二羟基苯基)乳酸的结构，上海第一医学院学报，1980，05(7)，384-385)，确定其分子及光学结构与天然丹参素完全一致。
实施例2
培养基组成为：果糖50g/L，硫酸铵5g/L。250ml三角瓶中装液量为50ml，120℃，20分钟灭菌。取Planococcus rifietoensis ATCC BAA-790甘油管种子液0.5mL接种，发酵温度20℃，摇床转速200rpm。培养72后，将发酵液离心(转速10000rpm，时间10min)，去除上清液获得菌体，离心获得的菌体用无菌水清洗一遍后再离心(转速10000rpm，时间10min)得到湿菌体。取湿菌体放入L-多巴浓度为2g/L的2ml溶液中，使菌体浓度达1g/L，混合均匀。于20℃摇床振荡(100rpm)72小时后，微孔滤膜过滤转化液，液相色谱分析转化液中丹参素浓度为0.03g/L。
实施例3
培养基组成为：蔗糖25g/L，硫酸铵1g/L，磷酸氢二铵1g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸亚铁0.1g/L。250ml三角瓶中装液量为50ml，120℃，20分钟灭菌。取Planococcus rifietoensis ATCC BAA-790甘油管种子液0.5mL接种，发酵温度35℃，摇床转速200rpm。培养48后，将发酵液离心(转速10000rpm，时间10min)，去除上清液获得菌体，离心获得的菌体用无菌水清洗一遍后再离心(转速10000rpm，时间10min)得到湿菌体。取0.05g湿菌体放入肉桂醛浓度为2g/L的2ml溶液中，混合均匀。于20℃摇床振荡(100rpm)24小时后，微孔滤膜过滤转化液，液相色谱分析转化液中丹参素浓度为0.2g/L。
实施例4
培养基组成为：麦芽糖15g/L，氯化铵25g/L，磷酸氢二铵25g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，硫酸镁0.1g/L，硫酸亚铁0.1g/L，调节pH至5。250ml三角瓶中装液量为50ml，120℃，20分钟灭菌。取Planococcus rifietoensis ATCC BAA-790甘油管种子液0.5mL接种，发酵温度30℃，摇床转速200rpm。培养24小时后，将发酵液离心(转速10000rpm，时间10min)，去除上清液获得菌体，离心获得的菌体用无菌水清洗一遍后再离心(转速10000rpm，时间10min)得到湿菌体。取0.1g湿菌体放入L-酪氨酸为3g/L的2ml溶液中，混合均匀，调节pH到8。于30℃摇床振荡(100rpm)48小时后，微孔滤膜过滤转化液，液相色谱分析转化液中丹参素浓度为1.2g/L。
实施例5
培养基组成为：半乳糖1g/L，尿素5g/L，磷酸氢二铵10g/L，硫酸镁0.1g/L，硫酸亚铁0.1g/L，调节pH至2。250ml三角瓶中装液量为50ml，120℃，20分钟灭菌。取Planococcus rifietoensis ATCC BAA-790甘油管种子液0.5mL接种，发酵温度20℃，摇床转速200rpm。培养24小时后，将发酵液离心(转速10000rpm，时间10min)，去除上清液获得菌体，离心获得的菌体用无菌水清洗一遍后再离心(转速10000rpm，时间10min)得到湿菌体。取0.1g湿菌体放入肉桂醇浓度为2g/L的2ml溶液中，并调节pH至4，混合均匀。于20℃摇床振荡(100rpm)1小时后，微孔滤膜过滤转化液，液相色谱分析转化液中丹参素浓度为0.02g/L。
实施例6
培养基组成为：甘油15g/L，牛肉膏50g/L，磷酸氢二铵1g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸亚铁0.5g/L。250ml三角瓶中装液量为50ml，120℃，20分钟灭菌。取Planococcus rifietoensis ATCC BAA-790甘油管种子液0.5mL接种，发酵温度30℃，摇床转速200rpm。培养24后，将发酵液离心(转速10000rpm，时间10min)，去除上清液获得菌体，离心获得的菌体用无菌水清洗一遍后再离心(转速10000rpm，时间10min)得到湿菌体。取0.01g湿菌体放入L-苯丙氨酸浓度为10g/L的2ml溶液中，调节pH至7，混合均匀。于30℃摇床振荡(100rpm)48小时后，微孔滤膜过滤转化液，液相色谱分析转化液中丹参素浓度为0.1g/L。
实施例7
培养基组成为：葡萄糖5g/L，蛋白胨1g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，硫酸镁0.1g/L，硫酸亚铁0.1g/L，调节pH至8。250ml三角瓶中装液量为50ml，120℃，20分钟灭菌。加入过滤除菌的L-多巴使培养基终度达2g/L，Planococcus rifietoensis ATCC BAA-790甘油管种子液0.5mL接种，发酵温度30℃，摇床转速200rpm。培养36小时后，微孔滤膜过滤转化液，液相色谱分析转化液中丹参素浓度为1g/L。
实施例8
培养基组成为：蔗糖10g/L，蛋白胨2g/L，玉米浆1g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，硫酸镁0.1g/L，硫酸亚铁0.1g/L，调节pH至6。250ml三角瓶中装液量为50ml，120℃，20分钟灭菌。加入过滤除菌的肉桂酸使培养基终度达1g/L，Planococcus rifietoensis ATCC BAA-790甘油管种子液0.5mL接种，发酵温度35℃，摇床转速200rpm。培养24小时后，微孔滤膜过滤转化液，液相色谱分析转化液中丹参素浓度为0.5g/L。
实施例9
培养基组成为：甘油10g/L，硫酸铵15g/L，玉米浆35g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，硫酸镁0.1g/L，硫酸亚铁0.1g/L，调节pH至5。250ml三角瓶中装液量为50ml，120℃，20分钟灭菌。加入过滤除菌的肉桂醇使培养基终度达1g/L，Planococcus rifietoensis ATCC BAA-790甘油管种子液0.5mL接种，发酵温度35℃，摇床转速200rpm。培养72小时后，微孔滤膜过滤转化液，液相色谱分析转化液中丹参素浓度为0.6g/L。
实施例10
培养基组成为：果糖10g/L，硝酸铵1g/L，尿素1g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，硫酸镁0.1g/L，硫酸亚铁0.1g/L，L-苯丙氨酸10g/L，调节pH至7。250ml三角瓶中装液量为50ml，120℃，20分钟灭菌。加Planococcus rifietoensis ATCC BAA-790甘油管种子液0.5mL接种，发酵温度35℃，摇床转速200rpm。培养72小时后，微孔滤膜过滤转化液，液相色谱分析转化液中丹参素浓度为0.2g/L。
实施例11
培养基组成为：半乳糖10g/L，牛肉膏20g/L，玉米浆30g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，硫酸镁0.1g/L，硫酸亚铁0.1g/L，调节pH至6。250ml三角瓶中装液量为50ml，120℃，20分钟灭菌。加入过滤除菌的L-酪氨酸使培养基终度达1g/L，Planococcus rifietoensis ATCC BAA-790甘油管种子液0.5mL接种，发酵温度25℃，摇床转速200rpm。培养36小时后，微孔滤膜过滤转化液，液相色谱分析转化液中丹参素浓度为0.5g/L。
实施例12
培养基组成为：麦芽糖50g/L，蛋白胨25g/L，玉米浆25g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，硫酸镁0.1g/L，硫酸亚铁0.1g/L，调节pH至5。250ml三角瓶中装液量为50ml，120℃，20分钟灭菌。加入过滤除菌的肉桂醛使培养基终度达0.1g/L，Planococcus rifietoensis ATCC BAA-790甘油管种子液0.5mL接种，发酵温度30℃，摇床转速200rpm。培养24小时后，微孔滤膜过滤转化液，液相色谱分析转化液中丹参素浓度为0.04g/L。