本发明涉及生物发酵方法领域，尤其涉及一种绿僵菌高孢粉的制备方法。
背景技术：
20世纪中期以来，由于化学杀虫剂无限制地使用，严重污染了环境和农林牧产品，危害了人畜健康，同时使自然生态系统遭到破坏。生物防治日益被人们所重视，利用昆虫病原微生物防治害虫是生物防治的重要手段之一。真菌杀虫剂由于具有良好的扩散效果、较长的宿存能力、独特的体壁入侵方式，以及对害虫不产生抗药性和易大量生产等特点，使得真菌杀虫剂在森林害虫、土壤害虫和刺吸式口器害虫的生物防治中具有明显的优势。
绿僵菌是最早应用于害虫生物防治的一种虫生真菌，能寄生8个目30个科昆虫超过200余种昆虫，利用绿僵菌防治害虫的研究与实践已逾百年，其具有致病力强、不污染环境、持效期长等特点，是一种可持续防治害虫的优良生物制剂，也是当今用于生物防治的主要真菌杀虫剂之一，在生物防治中具有重要的应用价值。分生孢子是绿僵菌剂型的主要成分，而绿僵菌高孢粉(母粉)是指经过提取、筛分得到的含孢量高的绿僵菌分生孢子粉，绿僵菌高孢粉可以作为可湿性粉剂、油剂、微胶囊剂等多种剂型的原料，用途十分广泛。因此，如何大量、快速获得绿僵菌孢子是绿僵菌高孢粉制备的基础。
目前，国内外绿僵菌分生孢子的获得主要是采用液固双相发酵的方式，即将液体种子接种于常规的大米、麦麸、玉米粉等营养基质固体剂型固体发酵，但不足之处显而易见：培养过程中环境因子调控复杂，不易干燥，发酵周期长，污染率高，产品质量不稳定，接种量一般在10％，同时分生孢子与固体基质混合在一起，不易分离，这些因素制约了绿僵菌高孢粉的生产应用和防治效果。
作为改进，公开号为CN 1212772 C的中国发明专利公开了金龟子绿僵菌无纺布菌条生产工艺方法，该方法包括五道生产工序，即菌种的取得，一级斜面菌种培养、液体种子培养、液体发酵罐生产和菌条的接种培养。将无菌布条作为金龟子绿僵菌的固定载体，最终将金龟子绿僵菌无纺布菌条直接用于害虫防治，虽然一定程度上避免了孢子与基质难分离的问题，但是其液体发酵采用三级发酵，发酵时间需要8-10天，发酵周期很长，影响了生产效率，且其制得的最产品仅仅只能作为菌条使用，限制了其使用形式，不能像分离的高孢粉可作为可湿性粉剂、油剂、微胶囊剂等的原料，同时，其菌条较大，表面积较小一定程度也限制了接种量，也不易操作。
因此，有必要发明一种生产效率高、易分离的绿僵菌高孢粉的制备方法。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是：一种生产效率高、易分离的绿僵菌高孢粉的制备方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
本发明提供一种绿僵菌高孢粉的制备方法，包括：绿僵菌菌丝发酵液与经蒸汽高温灭菌并冷却室温的营养液按1：1-3的比例混合得混合液，将浸有混合液的布块或浸有混合液的海绵块装入底部具有通孔且可堆叠的发酵容器中，置于温度为25-28℃的发酵室中进行发酵5-6天；
所述营养液包括以下重量份原料制备而成：麦麸汁1000份、米粉20份和白砂糖40份；
所述麦麸汁的制备方法为：按每1000g水中加300g麦麸，煮沸10min过滤取滤液，所得滤液加水补至1000g得所述麦麸汁。
所述布块可以是任意的织物纤维块，优选为的土工织物布块，规格为700～1000g/m2，所述的海绵块为PVA高密度吸水海绵。
本发明的有益效果在于：(1)通过采用浸有混合液的布块或海绵块作为绿僵菌生产和产孢的固定载体，与传统大米、麦麸、玉米粉等营养基质相比，干燥速度快、孢子易分离，且由于布块或海绵块的体积小，表面积大使得其接种量大(其接种量为传统等体积培养基接种量的2.5-5倍)，平均发酵周期为5-6天，较传统固体基质培养的7-10天，大大缩短了培养时间，因此，大大提高了绿僵菌高孢粉的生产效率且产品质量稳定；(2)由于绿僵菌分生孢子为气生孢子，培养过程中，由于发酵容器中间层有通气孔，保持中间层的通气效果好，加之基质高度≤3cm，有利于孢子产生，培养过程中整个发酵容器密闭，布块或海绵块内的水分几乎不会散失，所以无需调控环境湿度也能保证绿僵菌菌丝生长过程中所需的高湿度，简化了生产工艺；(3)采用织物布或海绵块作为绿僵菌生产和产孢的固定载体，方便收集孢子时操作；(4)在绿僵菌菌丝发酵液加入上述营养液，确保接种到布块或海绵块上的菌丝再生长和产孢的营养，同时增加繁殖系数，增加布块或海绵块上的绿僵菌分生孢子的产量。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式予以说明。
本发明最关键的构思在于：将浸有绿僵菌液体培养基和营养液的布块或海绵块代替常规的大米、麦麸、玉米粉等营养基质作为绿僵菌生产和产孢的固定载体，布块或海绵块的表面积大，绿僵菌在布块或海绵块快速生长和产孢，然后将绿僵菌孢子筛分制成绿僵菌高孢粉。
本发明提供一种绿僵菌高孢粉的制备方法，包括：绿僵菌菌丝发酵液与经蒸汽高温灭菌并冷却室温的营养液按1：1-3的比例混合得混合液，将浸有混合液的布块或浸有混合液的海绵块装入底部具有通孔且可堆叠的发酵容器中，置于温度为25-28℃的发酵室中进行发酵5-6天；所述营养液包括以下重量份原料制备而成：麦麸汁1000份、米粉20份和白砂糖40份；所述麦麸汁的制备方法为：按每1000g水中加300g麦麸，煮沸10min过滤取滤液，所得滤液加水补至1000g得所述麦麸汁。
所述布块可以是任意的织物纤维块，优选为的土工织物布块，规格为700～1000g/m2，所述的海绵块为PVA高密度吸水海绵。
从上述描述可知，本发明的有益效果在于：通过采用浸有混合液的布块或海绵块作为绿僵菌生产和产孢的固定载体，与传统大米、麦麸、玉米粉等营养基质相比，干燥速度快、孢子易分离，且由于布块或海绵块的体积小，表面积大使得其接种量大(其接种量为传统等体积培养基接种量的2.5-5倍)；平均发酵周期为5-6天，较传统固体基质培养的7-10天，大大缩短了培养时间。因此，大大提高了绿僵菌高孢粉的生产效率且产品质量稳定；由于绿僵菌分生孢子为气生孢子，培养过程中，由于发酵容器中间层有通孔，保持中间层的通气效果好，加之基质高度≤3cm，有利于孢子产生，培养过程中整个发酵容器密闭，布块或海绵块内的水分几乎不会散失，所以无需调控环境湿度也能保证绿僵菌菌丝生长过程中所需的高湿度，简化了生产工艺；采用布块或海绵块作为绿僵菌生产和产孢的固定载体，方便收集孢子时操作；在绿僵菌菌丝发酵液加入上述营养液，确保接种到布块或海绵块上的菌丝再生长和产孢的营养，同时增加繁殖系数，增加布块或海绵块上的绿僵菌分生孢子的产量。
进一步的，所述绿僵菌菌丝发酵液的培养：将绿僵菌菌种用盛有斜面培养基的试管在24-26℃条件下传代培养、活化，当所述斜面培养基的斜面表面长满孢子时于无菌操作台中，从所述斜面培养基的斜面挑取少量孢子及菌苔接入经蒸汽高温灭菌并冷却至室温的液体培养基中；接种后的液体培养基在振荡箱25±1℃恒温培养60-72h，待长成粘稠菌丝体后即得所述绿僵菌菌丝发酵液。
进一步的，所述液体培养基包括以下重量份原料制备而成：水1000份，玉米粉20份，米粉20份及白砂糖40份。
由上述描述可知，本发明的有益效果在于：将玉米粉、米粉及白砂糖作为液体培养基，配制简单，原料价廉、来源广泛，降低了生产成本。
进一步的，所述布块或海绵块的长度为4-6cm，宽度为2-4cm，高度为0.3-0.5cm。
由上述描述可知，本发明的有益效果在于：布块或海绵块的长、宽、高均较小，相对于简单用长布条或长条海绵而言，表面积更大，可以在同一空间培养更多绿僵菌，提高空间利用率，从而产孢量增大，进而使得振动筛分获得的孢子更多，即使得同样的空间中绿僵菌分生孢子的产量提高。
进一步的，所述浸有混合液的布块或所述浸有混合液的海绵块的制备方法为：将10-15块所述布块或所述海绵块放入于100mL所述混合液，20-60S后取出即得所述浸有混合液的布块或所述浸有混合液的海绵块。
由上述描述可知，本发明的有益效果在于：将所述布块或海绵块直接浸入混合液，快速简单的完成接种，又将营养液吸附到了布块或海绵块上，满足了绿僵菌生长和产孢的需要。
进一步的，所述布块优选为的土工织物布块，规格为700～1000g/m2，所述的海绵块为PVA高密度吸水海绵。
由上述描述可知，本发明的有益效果在于：所述土工织物布块或所述高密度吸水海绵块的保湿性好，加之发酵容器的密封，可以减少绿僵菌菌丝生长及产孢过程中湿度的调控。
本发明的具体实施方式有：
一种绿僵菌高孢粉的制备方法，包括如下步骤：
1绿僵菌菌丝发酵液的培养
1.1菌种：产孢良好的绿僵菌。一般以斜面4℃低温保存。
1.2斜面菌种：预先将绿僵菌菌种用试管斜面在25±1℃条件下传代培养，当斜面表面长满孢子时即可使用。斜面培养基为微生物培养中所通用的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基。
1.3液体培养基：按重量份玉米粉20份，米粉20份及白砂糖40份，混合均匀后，加入水1000份，得液体培养基，每个500mL三角瓶中装入200mL培养基，121℃下蒸汽高温灭菌30min，冷却后备用。
1.4接种：于无菌操作台中，从菌种斜面上挑取少量孢子及菌苔接入上述液体培养基中。
1.5摇床培养：25±1℃恒温振荡培养箱中振荡培养60-72h，待长成粘稠菌丝体后即为绿僵菌菌丝发酵液。
2菌块的接种培养
2.1营养液的制备方法：按每1000g水中加300g麦麸，煮沸10min过滤取滤液，所得滤液加水补至1000g得所述麦麸汁，将所述麦麸汁1000份、米粉20份和白砂糖40份混合得所述营养液，每个500mL的三角瓶装入200mL所述营养液，于121℃下蒸汽高温灭菌30min，冷却后备用。
2.2布块或海绵块灭菌处理：将长度为4-6cm，宽度为2-4cm，高度为0.3-0.5cm的土工织物布块(规格为700～1000g/m2)或PVA高密度吸水海绵块装入塑料袋，于121℃条件下蒸汽高温灭菌30min。
2.3接种：在预先进行空间灭菌的密闭房间内，将所述绿僵菌菌丝发酵液与经蒸汽高温灭菌并冷却室温的营养液按1：1-3的比例混合、搅拌得混合液，即接种量为25％-50％，将10-15块上述经蒸汽高温灭菌处理的布块或海绵块放入100mL混合液，每5S翻动一次混合液中的布块或海绵块，20-60S后，待布块或海绵块吸收饱和后，取出得所述浸有混合液的布块或所述浸有混合液的海绵块。
2.4培养：将所述浸有混合液的布块或所述浸有混合液的海绵块装入已经过表面消毒的底部具有通孔且可堆叠的塑料发酵箱中(外尺寸：480×355×170mm，内尺寸：445×320×165mm)，随即转入发酵室培养，置于温度为25-28℃的发酵室中进行发酵5-6天。
步骤1.2中所述马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基，具体配方为：含100g马铃薯(煮沸过滤)、10g葡萄糖、20g琼脂及水1000g；
步骤2.3中所述的营养液，具体配方为：麦麸汁1000份、米粉20份和白砂糖40份，所述麦麸汁的制备方法为：按每1000g水中加300g麦麸，煮沸10min过滤取滤液，所得滤液加水补至1000g得所述麦麸汁；
步骤2.3中所述布块或海绵块的长度为4-6cm，宽度为2-4cm，高度为0.3-0.5cm。
实施例一
本实施例的绿僵菌高孢粉的制备方法，包括如下步骤：
1绿僵菌菌丝发酵液的培养
1.1菌种：绿僵菌(MaZPTR-01)菌株，福建省林业科学研究院森林保护研究所保存，为公知菌株。
1.2斜面菌种：预先将绿僵菌菌种用试管斜面在25±1℃条件下传代培养、活化，当斜面表面长满孢子时即可使用。斜面培养基为微生物培养中所通用的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基。
1.3液体培养基：按重量份玉米粉20份，米粉20份及白砂糖40份，混合均匀后，加入水1000份，得液体培养基，配制该液体培养基2L，每个500mL三角瓶中装入200mL培养基，121℃下蒸汽高温灭菌30min，冷却后备用。
1.4接种：于无菌操作台中，从菌种斜面上挑取少量孢子及菌苔接入上述液体培养基中。
1.5摇床培养：25±1℃恒温振荡培养箱中振荡培养60h，待长成粘稠菌丝体后即为绿僵菌菌丝发酵液。
2菌块的接种培养
2.1营养液的制备方法：按每1000g水中加300g麦麸，煮沸10min过滤取滤液，所得滤液加水补至1000g得所述麦麸汁，将所述麦麸汁1000份、米粉20份和白砂糖40份混合得所述营养液，，每个500mL的三角瓶装入200mL所述营养液，于121℃下蒸汽高温灭菌30min，冷却后备用。
2.2布块或海绵块灭菌处理：将长度为4cm，宽度为2cm，高度为0.3cm的土工织物布块或高密度吸水海绵块装入聚丙烯塑料袋(可耐湿热灭菌)，于121℃条件下蒸汽高温灭菌30min。
2.3接种：在预先进行空间灭菌的密闭房间内，将所述绿僵菌菌丝发酵液与经蒸汽高温灭菌并冷却室温的营养液按1：1的比例混合、搅拌得混合液，即接种量为50％，将10块上述经蒸汽高温灭菌处理的布块或海绵块放入100mL混合液，每5S翻动一次混合液中的布块或海绵块，20S后，待布块或海绵块吸收饱和后，取出得所述浸有混合液的布块或所述浸有混合液的海绵块。
2.4培养：将所述浸有混合液的布块或所述浸有混合液的海绵块装入已经过表面消毒的底部具有通孔且可堆叠的塑料发酵箱中(外尺寸：480×355×170mm，内尺寸：445×320×165mm)，随即转入发酵室培养，置于温度为25-28℃的发酵室中进行发酵5天。
3培养结果
待所述浸有混合液的布块或所述浸有混合液的海绵块的表面长满绿僵菌分生孢子，将发酵产物置于阴凉通风处自然晾干即成粗粉剂(或在28-30℃烘箱中烘12-24h，含水率≤10％)，然后使用200目振动筛进行筛分，筛分时将振动筛的出料口封闭，待培养基上的孢子粉筛分完后打开出料口，制得绿僵菌高孢粉；随机称取制得的绿僵菌高孢粉剂5g，用0.03％吐温-80溶液进行稀释，血球计数板计数，所述绿僵菌高孢粉的平均含孢量为5.0×1010孢子/g。
实施例二
本实施例的绿僵菌高孢粉的制备方法，包括如下步骤：
1绿僵菌菌丝发酵液的培养
1.1菌种：绿僵菌(MaYTTR-04)菌株，福建省林业科学研究院森林保护研究所保存，为公知菌株。
1.2斜面菌种：预先将绿僵菌菌种用试管斜面在25±1℃条件下传代培养、活化，当斜面表面长满孢子时即可使用。斜面培养基为微生物培养中所通用的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基。
1.3液体培养基：按重量份玉米粉20份，米粉20份及白砂糖40份，混合均匀后，加入水1000份，得液体培养基，配制该液体培养基4L，每个500mL三角瓶中装入200mL培养基，121℃下蒸汽高温灭菌50min，冷却后备用。
1.4接种：于无菌操作台中，从菌种斜面上挑取少量孢子及菌苔接入上述液体培养基中。
1.5摇床培养：25±1℃恒温振荡培养箱中振荡培养72h，待长成粘稠菌丝体后即为绿僵菌菌丝发酵液。
2菌块的接种培养
2.1营养液的制备方法：按每1000g水中加300g麦麸，煮沸10min过滤取滤液，所得滤液加水补至1000g得所述麦麸汁，将所述麦麸汁1000份、米粉20份和白砂糖40份混合得所述营养液，每个500mL的三角瓶装入200mL所述营养液，于121℃下蒸汽高温灭菌50min，冷却后备用。
2.2布块或海绵块灭菌处理：将长度为6cm，宽度为4cm，高度为0.5cm的土工织物布块或高密度吸水海绵块装入聚丙烯塑料袋(可耐湿热灭菌)，于121℃条件下蒸汽高温灭菌50min。
2.3接种：在预先进行空间灭菌的密闭房间内，将所述绿僵菌菌丝发酵液与经蒸汽高温灭菌并冷却室温的营养液按1：3的比例混合、搅拌得混合液，即接种量为25％，将15块上述经蒸汽高温灭菌处理的布块或海绵块放入100mL混合液，每5S翻动一次混合液中的布块或海绵块，60S后，待布块或海绵块吸收饱和后，取出得所述浸有混合液的布块或所述浸有混合液的海绵块，
2.4培养：将所述浸有混合液的布块或所述浸有混合液的海绵块装入已经过表面消毒的底部具有通孔且可堆叠的塑料发酵箱中(外尺寸：480×355×170mm，内尺寸：445×320×165mm)，随即转入发酵室培养，置于温度为25-28℃的发酵室中进行发酵6天。
3培养结果
待所述浸有混合液的布块或所述浸有混合液的海绵块的表面长满绿僵菌分生孢子，将发酵产物置于阴凉通风处自然晾干即成粗粉剂(或在28-30℃烘箱中烘12-24h，含水率≤10％)，然后使用200目振动筛进行筛分，筛分时将振动筛的出料口封闭，待培养基上的孢子粉筛分完后打开出料口，制得绿僵菌高孢粉；随机称取制得的绿僵菌高孢粉剂5g，用0.03％吐温-80溶液进行稀释，血球计数板计数，所述绿僵菌高孢粉的平均含孢量为4.5×1010孢子/g。
实施例三
本实施例的绿僵菌高孢粉的制备方法，包括如下步骤：
1绿僵菌菌丝发酵液的培养
1.1菌种：绿僵菌(MaFZ-01)菌株，福建省林业科学研究院森林保护研究所保存，为公知菌株。
1.2斜面菌种：预先将绿僵菌菌种用试管斜面在25±1℃条件下传代培养、活化，当斜面表面长满孢子时即可使用。斜面培养基为微生物培养中所通用的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基。
1.3液体培养基：按重量份玉米粉20份，米粉20份及白砂糖40份，混合均匀后，加入水1000份，得液体培养基，配制该液体培养基3L，每个500mL三角瓶中装入200mL培养基，121℃下蒸汽高温灭菌40min，冷却后备用。
1.4接种：于无菌操作台中，从菌种斜面上挑取少量孢子及菌苔接入上述液体培养基中。
1.5摇床培养：25±1℃恒温振荡培养箱中振荡培养66h，待长成粘稠菌丝体后即为绿僵菌菌丝发酵液。
2菌块的接种培养
2.1营养液的制备方法：按每1000g水中加300g麦麸，煮沸10min过滤取滤液，所得滤液加水补至1000g得所述麦麸汁，将所述麦麸汁1000份、米粉20份和白砂糖40份混合得所述营养液，每个500mL的三角瓶装入200mL所述营养液，于121℃下蒸汽高温灭菌40min，冷却后备用。
2.2布块或海绵块灭菌处理：将长度为5cm，宽度为3cm，高度为0.4cm的土工织物布块或高密度吸水海绵块装入聚丙烯塑料袋(可耐湿热灭菌)，于121℃条件下蒸汽高温灭菌40min。
2.3接种：在预先进行空间灭菌的密闭房间内，将所述绿僵菌菌丝发酵液与经蒸汽高温灭菌并冷却室温的营养液按1：2的比例混合、搅拌得混合液，即接种量为33.3％，将12块上述经蒸汽高温灭菌处理的布块或海绵块放入100mL混合液，每5S翻动一次混合液中的布块或海绵块，40S后，待布块或海绵块吸收饱和后，取出得所述浸有混合液的布块或所述浸有混合液的海绵块，
2.4培养：将所述浸有混合液的布块或所述浸有混合液的海绵块装入已经过表面消毒的底部具有通孔且可堆叠的塑料发酵箱中(外尺寸：480×355×170mm，内尺寸：445×320×165mm)，随即转入发酵室培养，置于温度为25-28℃的发酵室中进行发酵5.5天。
3培养结果
待所述浸有混合液的布块或所述浸有混合液的海绵块的表面长满绿僵菌分生孢子，将发酵产物置于阴凉通风处自然晾干即成粗粉剂(或在30-35℃烘箱中烘12-24h，含水率≤10％)，然后使用200目振动筛进行筛分，筛分时将振动筛的出料口封闭，待培养基上的孢子粉筛分完后打开出料口，制得绿僵菌高孢粉；随机称取制得的绿僵菌高孢粉剂5g，用0.03％吐温-80溶液进行稀释，血球计数板计数，所述绿僵菌高孢粉的平均含孢量为4.8×1010孢子/g。
综上所述，本发明提供的绿僵菌高孢粉的制备方法，通过采用浸有混合液的布块或海绵块作为绿僵菌生产和产孢的固定载体，与传统大米、麦麸、玉米粉等营养基质相比，干燥速度快、孢子易分离，且由于布块或海绵块的体积小，表面积大使得其接种量大(其接种量为传统等体积培养基接种量的2.5-5倍)，平均发酵周期为5-6天，较传统固体基质培养的7-10天，大大缩短了培养时间，因此，大大提高了绿僵菌高孢粉的生产效率且产品质量稳定；由于绿僵菌分生孢子为气生孢子，培养过程中，由于发酵容器中间层有通孔，保持中间层的通气效果好，加之基质高度≤3cm，有利于孢子产生，培养过程中整个发酵容器密闭，布块或海绵块内的水分几乎不会散失，所以无需调控环境湿度也能保证绿僵菌菌丝生长过程中所需的高湿度，简化了生产工艺；采用布块或海绵块作为绿僵菌生产和产孢的固定载体，方便收集孢子时操作；在绿僵菌菌丝发酵液加入上述营养液，确保接种到布块或海绵块上的菌丝再生长和产孢的营养，同时增加布块或海绵块上的绿僵菌分生孢子的产量。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。