本发明涉及属于细菌冷冻真空干燥保存技术领域，特别涉及一种假单胞菌干粉及其制备方法。
背景技术：
革兰氏阴性菌对温度、pH、营养环境的应变能力较强，具有生长速度快、环境适应能力强等优点。假单胞菌属于革兰氏阴性菌，是自然界分布最广的微生物之一，多定殖于土壤、水和植物根系中，其生物降解与生物转化能力强，因此在环境修复、生物防治、生物转化等方面有广阔的应用前景。然而，革兰氏阴性菌，无芽孢休眠体，对极端环境(缺水、饥饿、高温、低温)的抵抗能力较差，干燥及保藏存活率低。
由于假单胞菌广阔的应用前景和出色的污染物降解效果，因此，对污染物降解效果出色的菌株进行长期保存是非常有必要的。
真空冷冻干燥技术在微生物保藏方面得到了广泛的应用，是目前适应性最广的菌剂制备技术，在低温、真空条件下，微生物的生理活动停止，细胞活力不易受损，特别适合热敏性、氧敏性的微生物干燥制备，且菌剂保藏中不易受污染，易于分装运输。然而，由于各类微生物菌株的生境条件、营养需求、培养方法等存在较大差异，造成了不同微生物菌株的冻干保护剂和冻干方法也不尽相同。
技术实现要素：
本发明旨在克服现有技术的缺陷，解决现有技术中假单胞菌的冻干保护的问题，提供一种假单胞菌干粉及其制备方法。本发明提供一种无毒、安全、使用方便的假单胞菌属细菌的冻干保护剂和冻干方法，用于真空冷冻干燥保存，能够实现假单胞菌在常温下的长期保藏并保存活力，为深入开展假单胞菌属菌株的相关研究提供技术支撑。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种假单胞菌干粉，包括假单胞菌和保护剂，所述保护剂包括脱脂奶粉、甘露醇、谷氨酸钠或甘氨酸、玉米淀粉、海藻糖。海藻糖在冻结过程和脱水过程中能提供有效的保护作用，有效防止活性组分发生变性；甘露醇防止有效组分随水蒸气一起升华逸散，并使有效组分成形；由于氨基酸离子具有酸、碱两性，因此能够在生物制品的低温保存和冷冻干燥过程中能抑制溶液的pH变化，谷氨酸钠或甘氨酸能将生物制品的pH值调整到活性物质的最稳定区域，从而达到保护活性组分的目的。脱脂奶粉在细胞外部，使溶液呈过冷状态，即可在特定温度下降低溶质浓度，从而起到保护作用。
优选地，本发明提供的假单胞菌干粉中，所述保护剂还包括酵母粉和/或司班60。酵母粉、司班60提高菌粉活菌收率，其中，司班60利于提高假单胞菌干粉菌粉的货架期。
优选地，本发明提供的假单胞菌干粉中，以所述假单胞菌干粉的总重量为基准(可以下文所述的活菌悬液的总重量为基准)，包括：5wt％～25wt％脱脂奶粉、0.1wt％～10wt％甘露醇、1wt％～15wt％谷氨酸钠或甘氨酸、0.1wt％～3wt％玉米淀粉、1wt％～10wt％海藻糖、0～15wt％酵母粉、0-2wt％司班60。
优选地，本发明提供的假单胞菌干粉中，以所述假单胞菌干粉的总重量为基准(可以下文所述的活菌悬液的总重量为基准)，包括：8wt％～20wt％脱脂奶粉、2wt％～8wt％甘露醇、2wt％～12wt％谷氨酸钠或甘氨酸、0.5wt％～2.5wt％玉米淀粉、2wt％～8wt％海藻糖、1～12wt％酵母粉、0.1-1.5wt％司班60。
另一方面，本发明还提供了一种假单胞菌干粉的制备方法，包括步骤：S1、将假单胞菌发酵液离心，弃上清，得第一菌泥；S2、用生理盐水洗涤第一菌泥，离心，弃上清，得第二菌泥；S3、用无菌水将上述第二菌泥配制成活菌悬液；S4：将上述活菌悬液与权利要求1-4中任一项所述的保护剂假单胞菌制剂中的保护剂混合后，冷冻，再放入预冷的真空冷冻干燥机中冻干，得到假单胞菌干粉。
优选地，所述步骤S1中：转速为2000～10000rpm，离心处理5～30min。
优选地，所述步骤S2中：转速为2000～10000rpm，离心处理5～30min。
优选地，所述步骤S3包括：用无菌水将上述第二菌泥配制成1.0×109cfu/g～1.0×1011cfu/g活菌悬液。
优选地，所述步骤S4包括：将上述活菌悬液与本发明提供的假单胞菌制剂中的保护剂充分混合均匀后，快速冷冻3～4h，再放入预冷的真空冷冻干燥机冻干舱中冻干，得到假单胞菌干粉。例如，所述步骤S4包括：将上述活菌悬液与本发明提供的假单胞菌制剂中的保护剂充分混合均匀后，先置于-80℃条件下快速冷冻3～4h，再放入预冷的真空冷冻干燥机冻干舱中，在真空度0.1mbar，冻干舱-83℃条件下冻干48h后，得到假单胞菌干粉。
本发明的有益效果在于：本发明提供的假单胞菌活菌收率高达70％，与现有技术相比，本发明的假单胞菌菌粉活菌存活率高。
本发明的发明人经过大量的实验发现：待真空冷冻干燥的假单胞菌通过加入本发明提供的保护剂处理后，能够提高假单胞菌对干燥、低温的防护能力，有效减少假单胞菌在真空冷冻干燥过程中的活性损失，并且在恢复过程中加快假单胞菌复苏。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，而不构成对本发明的限制。
本发明实施例1-4中，配制假单胞菌培养基：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L。
下表1为实施例1-4中所用到的保护剂P1-P4的组分及含量(以保护剂的总重量为基准)(含量wt％)：
表1
本发明实施例1-4菌种存活率的计算采用如下方式进行：将假单胞菌干粉D1-D4复水，30～35℃下水浴30-60min，混匀后连续稀释计数，计算保护剂对于菌种的存活率，即冻干前后相同体积活菌数之比。
实施例1
1、在常规条件下培养各待保藏或冷冻干燥的菌株，挑取纯培养的假单胞菌属单菌落接种于LB液体培养基中，置于生化培养箱中在30℃、150rpm条件下培养12h后，将假单胞菌发酵液离心(转速为2000rpm，离心处理30min)，弃上清，得第一菌泥。
2、用生理盐水洗涤第一菌泥，离心(转速为1800rpm，离心处理25min)，弃上清，得第二菌泥。
3、用无菌水将上述第二菌泥配制成1.0×109cfu/g活菌悬液。
4、将上述活菌悬液与保护剂P1混合均匀，待用。设置对照组1(不添加保护剂P1)。真空冷冻干燥条件为：先置于-80℃条件下快速冷冻3～4h，再放入预冷的真空冷冻干燥机冻干舱中，在真空度0.1mbar，冻干舱-83℃条件下冻干48h后，得到假单胞菌干粉D1。
通过平板计数法检测假单胞菌干粉D1的活菌数。本实施例1的假单胞菌真空冷冻干燥保护剂P1对假单胞菌的保护效果如下表2所示：
表2
添加本实施例1的假单胞菌真空冷冻干燥保护剂P1，所得干粉活菌数为1.18×109cfu/g，对照组1不加保护剂的活菌数为3.74×108cfu/g。结果表明添加保护剂P1能够显著提高真空冷冻干燥后假单胞菌菌粉的活菌数。
采用脱脂奶粉10wt％、谷氨酸钠5wt％、海藻糖5wt％为冻干保护剂制备菌粉，37℃20d存活率为38％，采用实施例1中的保护剂P1制备的干粉37℃20d存活率为70％，对照组干粉37℃20d存活率为20％。
实施例2
1、在常规条件下培养各待保藏或冷冻干燥的菌株，挑取纯培养的假单胞菌属单菌落接种于LB液体培养基中，置于生化培养箱中在30℃、150rpm条件下培养12h后，将假单胞菌发酵液离心(转速为10000rpm，离心处理5min)，弃上清，得第一菌泥.
2、用生理盐水洗涤第一菌泥，离心(转速为5000rpm，离心处理20min)，弃上清，得第二菌泥.
3、用无菌水将上述第二菌泥配制成1.0×1011cfu/g活菌悬液.
4、将上述活菌悬液与保护剂P2混合均匀，待用。设置对照组2(不添加保护剂P2)。真空冷冻干燥条件为：-80℃条件下快速冷冻3.5h，再放入预冷的真空冷冻干燥机冻干舱中，在真空度0.2mbar，冻干舱-85℃条件下冻干43h后，得到假单胞菌干粉D2。
通过平板计数法检测假单胞菌干粉D2的活菌数。本实施例2的假单胞菌真空冷冻干燥保护剂P2对假单胞菌的保护效果如下表3所示：
表3
添加本实施例2的假单胞菌真空冷冻干燥保护剂P2，所得干粉活菌数为8.70×1010cfu/g，对照组2不加保护剂的活菌数为3.27×1010cfu/g。结果表明添加保护剂P2能够显著提高真空冷冻干燥后假单胞菌菌粉D2的活菌数。
采用脱脂奶粉5wt％、甘氨酸5wt％、海藻糖6wt％为冻干保护剂制备菌粉，37℃20d存活率为36％，采用实施例1中的保护剂P2制备的干粉37℃20d存活率为75％，对照组干粉37℃20d存活率为20％。
实施例3
1、在常规条件下培养各待保藏或冷冻干燥的菌株，挑取纯培养的假单胞菌属单菌落接种于LB液体培养基中，置于生化培养箱中在30℃、150rpm条件下培养12h后，将假单胞菌发酵液离心(转速为6000rpm，离心处理20min)，弃上清，得第一菌泥。
2、用生理盐水洗涤第一菌泥，离心(转速为10000rpm，离心处理5min)，弃上清，得第二菌泥。
3、用无菌水将上述第二菌泥配制成1.0×1010cfu/g活菌悬液。
4、将上述活菌悬液与保护剂P3混合均匀，待用。设置对照组3(不添加保护剂P3)。真空冷冻干燥条件为：-78℃条件下快速冷冻4h，再放入预冷的真空冷冻干燥机冻干舱中，在真空度0.1mbar，冻干舱-83℃条件下冻干48h后，得到假单胞菌干粉D3。
通过平板计数法检测活菌数。本实施例3的假单胞菌真空冷冻干燥保护剂P3对假单胞菌的保护效果如下表4所示：
表4
添加本实施例3的假单胞菌真空冷冻干燥保护剂P3，所得干粉活菌数为1.75×1010cfu/g，不加保护剂的活菌数为4.21×109cfu/g。结果表明添加保护剂能够显著提高真空冷冻干燥后假单胞菌菌粉的活菌数。
采用脱脂奶粉5wt％、谷氨酸钠3wt％、海藻糖10wt％为冻干保护剂制备菌粉，37℃20d存活率为42％，采用本实施例3的保护剂P3制备的干粉37℃20d存活为78％，对照组干粉37℃20d存活率为20％。
实施例4
1、在常规条件下培养各待保藏或冷冻干燥的菌株，将假单胞菌发酵液离心(转速为11000rpm，离心处理7min)，弃上清，得第一菌泥；
2、用生理盐水洗涤第一菌泥，离心(转速为2000rpm，离心处理35min)，弃上清，得第二菌泥；
3、用无菌水将上述第二菌泥配制成1.0×108cfu/g活菌悬液；
4、将上述活菌悬液与保护剂P4混合均匀，待用。设置对照组4(不添加保护剂P4)。真空冷冻干燥条件为：-85℃条件下快速冷冻3h，再放入预冷的真空冷冻干燥机冻干舱中，在真空度0.1mbar，冻干舱-83℃条件下冻干46h后，得到假单胞菌干粉D4。
通过平板计数法检测活菌数。本实施例4的假单胞菌真空冷冻干燥保护剂P4对假单胞菌的保护效果如下表5所示：
表5
添加本发明的假单胞菌真空冷冻干燥保护剂，所得干粉活菌数为1.35×108cfu/g，不加保护剂的活菌数为4.67×107cfu/g。结果表明添加保护剂能够显著提高真空冷冻干燥后假单胞菌菌粉的活菌数。
采用脱脂奶粉5wt％、谷氨酸钠3wt％、海藻糖10wt％为冻干保护剂制备菌粉，37℃20d存活率为42％，采用本实施例4的保护剂P4制备的干粉37℃20d存活为78％，对照组4干粉37℃20d存活率为20％。
通过表2-表5可以看出，本发明的假单胞菌菌粉的活菌率高，且具有较好的稳定性，在干燥和存储过程中稳定。
以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所作出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。