用于针对高致病性禽流感H5病毒的不同分支诱导广泛抗体应答的嵌合病毒样颗粒疫苗的制作方法

本发明涉及用于针对高致病性禽流感H5病毒的不同分支诱导广泛抗体应答的嵌合病毒样颗粒疫苗。

背景技术：

1996年中国首先出现了高致病性禽流感(HPAI)亚洲H5N1病毒，这导致了动物疾病的爆发并被认为是近百年来世界范围内最大的流行性疾病。继而，亚洲H5N1病毒蔓延到亚洲、中东、欧洲和非洲，并由此致使超过4亿家禽死亡或对其进行强制性处理。

HPAI H5病毒已经独立地演化为各种各样的从基因学角度和抗原学角度分类的分支(Donis,R.O.,和G.J.Smith.2015.Nomenclature updates resulting from the evolution of avian influenza A(H5)virus clades 2.1.3.2a,2.2.1,and 2.3.4 during 2013-2014.Influenza and other respiratory viruses.doi 10.1111/irv.12324)，并由此已变得难以根除。此外，HPAI H5N1的持续性人类感染会引起人类流行性疾病的可能性。

为了降低经济损失和人类感染的风险，家禽业需要一种针对HPAI H5的新策略。

HPAI H5的疫苗接种已经被广泛应用于各个领域。然而，目前可获得的疫苗是受限的，因为这些疫苗没有展现出针对HPAI H5病毒的许多不同分支的广泛保护性作用(Grund,C.,S.M.Abdelwhab el,A.S.Arafa,M.Ziller,M.K.Hassan,M.M.Aly,H.M.Hafez,T.C.Harder,和M.Beer.2011.Vaccine 29:5567-5573.doi 10.1016/j.vaccine.2011.01.006)。

已经将病毒样颗粒(以下简称为“VLP”)推荐作为新型的替代疫苗。在病毒学领域被认为是非常重要的VLP是采用免疫原性蛋白质制备的，并且VLP疫苗已经表现出针对各种病毒性疾病的强保护性作用(Lee DH,Park JK,Song CS.2014.Clin Exp Vaccine Res 3:133-139；Li TC,Yamakawa Y,Suzuki K,Tatsumi M,Razak MA,Uchida T,Takeda N,Miyamura T.1997.J Virol 71:7207-7213；Buonaguro L,Tornesello ML,Tagliamonte M,Gallo RC,Wang LX,Kamin-Lewis R,Abdelwahab S,Lewis GK,Buonaguro FM.2006.J Virol 80:9134-91438-10)。

然而，尚未进行对用于针对HPAI H5病毒的各种分支诱导广泛免疫应答的VLP的研究。

技术实现要素：

由此，本发明已经在考虑到相关技术中遇到的上述问题，并且本发明意图提供用于针对HPAI H5病毒的不同分支诱导广泛免疫应答的VLP。

本发明提供了嵌合VLP，其含有H5N1病毒分支1的血细胞凝集素基因(HA)、H5N1病毒分支2的血细胞凝集素基因(HA)和流感M1基因。

在本发明的一个实施方案中，所述H5N1病毒分支1的血细胞凝集素基因具有SEQ ID NO:1的碱基序列，所述H5N1病毒分支2的血细胞凝集素基因具有SEQ ID NO:2的碱基序列，以及所述流感M1基因具有SEQ ID NO:3的碱基序列，但本发明并不局限于此。

此外，本发明提供了抗原制剂，包含本发明所述的嵌合病毒样颗粒和助剂或免疫刺激剂。

此外，本发明提供了包含本发明所述的嵌合病毒样颗粒的疫苗。

在本发明的一个实施方案中，所述疫苗优选具有对禽流感病毒性感染的保护性作用，但本发明并不局限于此。

在本发明的另一个实施方案中，优选地将所述疫苗与佐剂或免疫刺激剂一起配制，但本发明并不局限于此。

此外，本发明提供了针对非人动物体内的禽流感感染诱导传染免疫的方法，包含向所述非人动物体给予本发明所述的抗原制剂。

此外，本发明提供了针对非人动物体内的禽流感病毒性感染诱导传染免疫的方法，包含向所述非人动物给予本发明所述的疫苗。

此外，本发明提供了产生本发明所述的嵌合病毒样颗粒的方法，包含：提供含有H5N1病毒分支1的血细胞凝集素基因和H5N1病毒分支2的血细胞凝集素基因的载体以及含有流感M1基因的载体，从而利用杆状病毒表达体系分别制备出编码所述分支1的血细胞凝集素基因和所述分支2的血细胞凝集素基因的重组杆状病毒以及编码所述流感M1基因的重组杆状病毒；以及用所述重组杆状病毒对昆虫细胞进行共感染。

在本发明中，VLP被用于配制成免疫原性组合物或药物组合物。为此，将VLP调整至适当的浓度并与适当的助剂、稀释剂或载体一起提供为制剂的形式。可以将生理上可接受的培养基用作载体或稀释剂。其包含但不限于适当的各向同性培养基、甘油、乙醇和其它典型溶剂，磷酸盐缓冲盐水等。适当的助剂的示例可以包含磷酸铝；氢氧化铝；MPLTM(3-O- 脱酰单磷酰脂A；RIBI免疫化学研究有限公司，汉密尔顿，MT，购自Corixa公司)；合成脂质A类似物，诸如529(Corixa公司)；刺激子TM QS-21(拉奎拉生物制药，弗雷明汉，MA)；IL-12(遗传学研究所，剑桥，MA)；合成多核苷酸，诸如含有CpG基序的寡核苷酸(美国专利号6,207,646(28))；大肠杆菌的热不稳定毒素以及霍乱毒素(野生型或突变形式，例如，其中依据国际专利公开号WO 00/18434(29)谷氨酸的第29位氨基酸被另一氨基酸(优选组氨酸)所代替)，但本发明并不局限于此。

在本发明的另一方面，将含有VLP的制剂用作免疫原组合物。可以将病毒与蛋白质(例如白蛋白、明胶)、葡萄糖(例如蔗糖、乳糖、山梨醇)、氨基酸(例如谷氨酸钠)、生理盐水或低温保护添加剂(诸如一些其它保护剂或稳定剂)混合。该混合物被保持在液体状态，或对该混合物进行干燥或冻干以便运输和保存并在给药前立即与水混合。

以下会给出本发明的详细描述。

本发明的发明人还开发了采用杆状病毒表达载体体系(BEVS)用于共表达来自HPAIH5病毒分支1和分支2的HA的嵌合VLP，并且在两种主要畜禽物种(即鸡和鸭)体内对H5病毒的四种不同分支的免疫力进行了评估。

根据本发明，已经证明了相对于传统VLP疫苗，嵌合VLP疫苗可以针对H5病毒的不同分支诱导出广泛抗体应答，从而可以提供用于开发更好地控制家禽物种体内亚洲HPAIH5病毒的改进疫苗的策略。

附图说明

图1A至1E显示了含有来源于HPAI H5病毒不同分支的HA蛋白质的H5VLP疫苗的产生和特性。其中图1A展示了编码分支1HA基因的重组杆状病毒(rBV)、编码分支2HA基因的重组杆状病毒(rBV)、一起编码分支1HA基因和分支2HA基因的重组杆状病毒(rBV)、编码流感M1基因的重组杆状病毒(rBV)，这些重组杆状病毒(rBV)用于感染草地夜蛾(Sf9)细胞；图1B展示了通过用编码HA基因的重组杆状病毒(rBV)的任一个和编码流感M1基因的重组杆状病毒(rBV)对Sf9细胞进行共感染而产生分支1VLP、分支2VLP和分支1+2VLP；图1C展示了具有抗流感M1抗体的抗分支1单克隆抗体；图1D展示了具有抗流感M1抗体的抗分支2单克隆抗体，其中通过利用图1C的抗分支1单克隆抗体或图1D的抗分支2单克隆抗体的免疫印记鉴定出了4微克的分支1VLP(泳道1)、分支2VLP(泳道2)和分支1+2VLP(泳道3)；以及图1E展示了阴性染色的分支1+2H5VLP的透射型电子显微镜(TEM)图像，标尺指定100nm。

图2A至2C显示了在6周龄SPF鸡(每组n＝10)体内交叉分支HI测试结果，图2A展示了使用分支1H5VLP疫苗的免疫，图2B展示了使用分支2H5VLP疫苗的免疫，以及图2C展示了使用嵌合H5VLP疫苗的免疫(每0.5微升剂量中40微克的VLP)，其中在单次免疫后3周获取血清样本并且利用分支1、2.1、2.3.2.1和2.5H5N1病毒确定HPAI H5N1病毒的不同分支的HI效价，以10只鸡的平均HI抗体效价(Log2)计。

图3A至3C显示了5周龄SPF鸭(每组n＝10)体内交叉分支HI测试结果，图3A展示了使用分支1H5VLP疫苗的免疫，图3B展示了使用分支2H5VLP疫苗的免疫，以及图3C展示了使用嵌合H5VLP疫苗的免疫(每0.5微升剂量中40微克的VLP)，其中在单次免疫后3周获取血清样本，继而以RDE进行处理以去除非特异性HI因子，其中利用分支1、2.1、2.3.2.1和2.5H5N1病毒确定HPAI H5N1病毒的不同分支的HI效价，以10只鸭的平均HI抗体效价(Log2)计。

图4A至4D显示了以各种VLP疫苗免疫的鸡的HI效价之间的统计分析结果，其中在免疫后3周分别针对图4A、4B、4C和4D的分支1、分支2.1、分支2.3.2和分支2.5H5N1病毒测量了由分支1、分支2和嵌合VLP疫苗诱导的HI效价，以10只鸡的平均HI抗体效价(Log2)计，其中*P<0.05并且***P<0.001(以Tukey-Kramer事后检验进行方差分析)。

图5A至5D显示了以各种VLP疫苗免疫的鸭的HI效价之间的统计分析结果，其中在免疫后3周分别针对图5A、5B、5C和5D的分支1、分支2.1、分支2.3.2和分支2.5H5N1病毒测量了由分支1、分支2和嵌合VLP疫苗诱导的HI效价，以10只鸭的平均HI抗体效价(Log2)计，其中**P<0.01并且***P<0.001(以Tukey-Kramer事后检验进行方差分析)。

【保藏信息】

保藏单位：韩国典型培养物保藏中心；保藏地址：韩国生命工学研究院；保藏编号：KCTC12845BP；保藏日期：20150612。分类命名：苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus。

具体实施方式

对本发明更好的理解可以通过以下非限制性示例而获得，这些非限定性示例用于说明，而不能将其理解为限制本发明的范围。

示例1：重组杆状病毒的产生

为了克隆H5N1病毒分支1的完整长度的HA基因，不采用MBCS(多碱基裂解位点)(Bioneer，韩国)以化学方式合成A/越南/1194/2004(H5N1)的HA基因。为了克隆H5N1病毒分支2的完整长度的HA基因，从A/鸳鸯/K10-483/2010(H5N1,分支2.3.2.1)提取病毒RNA以扩增HA基因(Hoffmann,E.,J.Stech,Y.Guan,R.G.Webster,和D.R.Perez.2001.Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses.Archives of virology 146:2275-2289)，然后去除MBCS，如Heckman,K.L.,和L.R.Pease.2007.Nature protocols 2:924-932.doi 10.1038/nprot.2007.132中所描述的。

将从病毒分支1或病毒分支2扩增的HA基因克隆至pFastBac1载体中(Invitrogen公司,USA)，并将所获得的质粒称为pFast_分支1和pFast_分支2。通过将pFast_分支2-来源的SnaBI-/HpaI-消化的片段克隆至pFast_分支1的HpaI-消化的位点而构建含有来源于H5N1病毒分支1和分支2的HA基因的pFastBac1载体，并将所获得的质粒称为pFast_分支1+2。通过将A/波多黎各/8/1934(H1N1)的完整长度的M1基因克隆至pFastBac1载体而构建含有流感基质(M1)基因的pFastBac1载体(Park,J.K.等人,2014.Clinical and vaccine immunology:CVI 21:360-365.doi 10.1128/CVI.00636-13)，并将所获得的质粒称为pFast_M1。

采用Bac-to-Bac杆状病毒表达体系(Invitrogen公司)利用pFast_分支1、pFast_分支2、pFast_分支1+2和pFast_M1产生编码分支1HA基因、编码分支2HA基因、共同编码分支1和分支2HA基因和编码流感M1病毒的各个重组杆状病毒(rBV)，并继而称为rBV_分支1、rBV_分支2、rBV_分支1+2和rBV_M1。通过采用草地夜蛾(Sf9)昆虫细胞的标准噬菌斑测定来测量rBV的效价。rBV_分支1+2于2015年6月12日保藏于坐落在南韩大田市儒城区的韩国人类基因库，保藏编号KCTC 12845BP。

示例2：H5VLP的产生和特性以及VLP疫苗的产生

为了产生分支1H5VLP，用rBV_分支1和rBV_M1以5MOI(感染倍数)对Sf9细胞进行共感染。为了产生分支2H5VLP，用rBV_分支2和rBV_M1以5MOI(感染倍数)对Sf9细胞进行共感染。

为了产生嵌合H5VLP，用rBV_分支1+2和rBV_M1以5MOI(感染倍数)对Sf9细胞进行共感染。感染72小时后，通过在低RPM(2000×g，30分钟，4℃)离心收集含有VLP的培养基并进行清洗以去除大细胞碎片，然后使干净的来源于上清液的VLP沉淀(30,000×g，1.5小时，4℃)。将沉淀物重新悬浮在以20至50％(w/v)不连续蔗糖密度梯度加载的磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液(pH 7.2)中，然后以非常高的RPM(150,000×g，1.5小时，4℃)离心并由此被纯化。采用透射型电子显微镜(TEM，Tecnai G2Spirit,FEI,荷兰,韩国基础科学研究院)观察到了VLP的存在。

在各个VLP中，通过免疫印记利用鼠抗分支1H5单克隆抗体(Median diagnostics公司，韩国)、抗分支2H5单克隆抗体(Bionote公司，韩国)和兔抗M1多克隆抗体(免疫科技公司，美国)继而通过HRP(辣根过氧化物酶)标记的羊抗鼠或抗兔IgG(AbD Serotec公司，英国)对HA蛋白质和M1蛋白质的表达进行检测。

通过Bradford蛋白检测(Pierce，美国)根据制造商的说明书对各个H5VLP的最终蛋白浓度进行定量。

为了产生H5VLP疫苗，以30:70(v/v)的比例将各个H5VLP乳化于油乳佐剂Montanide ISA70(SEPPIC，法国)，由此产生0.5毫升剂量中40微克的VLP。

示例3：动物免疫和血清免疫应答的测定

将总共30只6周龄的SPF白来亨鸡(Namduck Sanitec，韩国)分成3组(每组10只鸡)。将总共30只5周龄的北京鸭(莫兰食品育种公司，韩国)分成3组(每组10只鸭)。使用分支1、分支2或嵌合H5VLP疫苗使各组的鸡或鸭经受肌肉内免疫(0.5mL/每只动物)。

为了测定免疫后的血清免疫应答，在免疫后3周从接种了VLP疫苗的鸡或鸭采集血清以用于采用H5N1病毒的不同分支进行的交叉分支HI(血凝抑制)测试。

如Lee,D.H.等人2013.PloS one 8:e58186.doi 10.1371/journal.pone.0058186中所描述的，采用RG(反向遗传学)制备含有A/越南/1194/2004(分支1)，A/印度尼西亚/5/2005(分支2.1)，A/鸳鸯/K10-483/2010(分支2.3.2.1)或A/鸡/韩国/ES/2003(分支2.5)的无MBCS的HA基因的H5N1病毒。根据OIE标准方法采用4个HA单元的H5N1病毒进行HI测试。为了去除非特异性HI因子，用3个体积的受体破坏酶(Denka Seiken Co.，日本)在37℃对1体积的鸭血清处理16小时。

在设计本发明的过程中进行的所有动物试验是在建国大学动物伦理委员会的审查、批准和监督下进行的。

进行Tukey-Kramer事后检验的方差分析(ANOVA)以比较组间的血清抗体效价。具有P<0.05的结果视为统计学显著的。

示例的结果如下。

嵌合H5VLP的表达和特性

采用BEV在Sf9细胞中生产含有分支1HA、分支2HA或分支1+HA的H5VLP(图1A至1E)。在通过以非常高RPM离心的浓缩过程后，采用蔗糖密度梯度离心进行纯化。通过免疫印记显示位于50％蔗糖密度梯度顶部的条带同时含有HA蛋白和M1蛋白(图1B)，并且所鉴定出的条带为约68kDa和28kDa，其分别指流感HA蛋白和流感M1蛋白。如所预期的，从分支1特异性单克隆抗体和分支2特异性单克隆抗体均可以检测到来源于嵌合H5VLP的HA。

在对以TEM的阴性染色的制剂进行观察中，观察到了直径约100nm的嵌合H5VLP的存在(图1D)，指示出具有典型大小的流感VLP。

嵌合H5VLP疫苗接种后的广泛抗体应答

免疫后3周，对H5N1病毒的四种不同分支进行交叉分支HI检测。如图2A至2C和4A至4D所显示的，以嵌合H5VLP免疫的鸡显示出针对H5N1病毒分支1和分支2显著广泛的免疫应答。鸭血清的HI检测结果显示出更显著广泛的免疫应答。如图3A至3C和5A至5D所显示的，以含有分支1HA或分支2HA的标准VLP疫苗免疫的鸭能够诱发针对H5N1病毒的不同分支最低水平的抗体应答。然而，以嵌合VLP疫苗对鸭进行的免疫能够诱发针对H5N1病毒的不同分支的广泛抗体应答。

尽管已经公开了本发明的优选实施方案以用于说明目的，本领域技术人员将理解在不脱离如所附权利要求书公开的本发明范围和精神的情况下，可以做出各种修改、增加和替换。