一种L‑谷氨酸氧化酶‑CBD融合酶及其表达基因和应用的制作方法

本发明涉及一种L-谷氨酸氧化酶-CBD融合酶及其表达基因和应用，属于生物酶基因工程领域的蛋白质表达纯化工艺。

背景技术：

近年来，随着生命科学、医学、信息科学和材料科学的发展，生物传感器技术也相应的得到了快速的发展。由于生物传感器具有多功能化、便于多种信息的检测、微型化、便于携带、智能化、成本低、灵敏度高、稳定性好以及使用周期长等特点，必将在未来能涉及更加广泛的领域。就目前而言，生物传感器在医疗诊断市场上的销售额将带来超过130亿美元的价值。随着蛋白质工程、纳米材料和酶的固定化等技术的不断深入的研究，在酶的稳定性、活性方面有了较大的改进酶的灵敏度、以及纳米材料将酶固定化等技术，将会使测定灵敏度更高，电子传递链传递更加容易。因此，随着社会各领域的发展，尤其是生命健康科学相关领域的发展，也将会使生物传感器的发展进一步提高。

L-谷氨酸氧化酶（EC 1.4.3.11）作为一种工具酶，它是一种以黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）为辅基的黄素蛋白酶。它在不需要外源辅因子的条件下可以专一的将谷氨酸氧化脱氨基生成α-酮戊二酸，同时伴随着氨气和过氧化氢的产生。谷氨酸氧化酶广泛应用于食品、化学和医药等领域。它在谷氨酸的生产中可以对谷氨酸的生产发酵进行实时监测，在临床上可以对血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶和γ-谷氨酰基转移酶进行活性检测，可以诊断身体组织如心脏和肝脏的健康状况。因而L-谷氨酸氧化酶的传感器的应用方面将有更大的提高。

同时，由于L-谷氨酸氧化酶能将L-谷氨酸氧化脱氨基作用生成α-酮戊二酸，因此可以针对α-酮戊二酸进行酶法生产制备。α-酮戊二酸（α-Ketoglutaric acid, α-KG）作为一种重要的生物化合物，它是三羧酸循环的中间产物，在生物体内参与氨基酸、蛋白质、维生素的合成以及能量的代谢。由于它广泛应用于食品、医药、化工和化妆品等工业领域中，因而α-KG的需求量随着增大。α-KG的生产方法主要包括化学合成法、微生物发酵法和酶催化法。由于工业上主要采用有机合成法，涉及到复杂的反应程序，从而会引起污染严重，资源浪费等问题。但酶催化法生产α-酮戊二酸，具有生产条件温和、操作流程简便以及环境友好型等特点，引起了研究者们极大的关注。

技术实现要素：

本发明的目的在于解决上述的技术问题，提供一种L-谷氨酸氧化酶-CBD融合酶及其表达基因和应用。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：

一种L-谷氨酸氧化酶-CBD融合酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

表达所述的L-谷氨酸氧化酶-CBD融合酶的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。

以上所述的L-谷氨酸氧化酶-CBD融合酶的制备方法，包括如下步骤：

步骤一、以全基因合成的L-谷氨酸氧化酶基因SEQ ID NO.2为模板，P1、P2为引物进行PCR扩增，所述引物为：

P1：CATGCCATGGCTGCGGCCAAGACGTGTCAG，下划线为Nco I位点；

P2：CCCAAGCTTGCCTGCACCAGCGCTGGTAACAACGTCCTC，下划线为Hind III位点；

所述步骤一中的PCR扩增产物PCR反应程序为：95℃预变性2 min；95℃变性20 s，63℃退火20 s，72℃延伸90 s，30个循环；72℃延伸5 min。

步骤二、验证回收PCR产物；

PCR完成，琼脂糖凝胶电泳，进行目的条带的验证。待检测到单一目的基因后，使用cycle-pure核酸一步纯化试剂盒将目的基因片段回收，得到完整的Gox基因片段。

步骤三、将步骤二所得的PCR扩增产物酶切

用Nco I和HindIII核酸内切酶对目的基因片段和载体pETM10-CBD进行酶切，37℃酶切1 h，使用cycle-pure核酸一步回收试剂盒回收目的基因片段，载体使用胶回收试剂盒回收，将目的基因片段和载体使用T4DNA连接酶连接，然后转化E.coli DH5α；

步骤四、对得到的克隆进行菌落PCR验证，将阳性克隆进行碱基序列测定，确定构建正确的基因序列，并命名为pETM10-Gox-CBD；

步骤五、将pETM10-Gox-CBD表达质粒转化至E.coli BL21（DE3）的宿主菌中，在含有硫酸卡那霉素（50mg/L）的LB固体培养基（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物（均购自OXOID）5 g/L，NaCl 10 g/L，1.5%的琼脂糖）中37℃倒置培养过夜，挑取转化子（含有pETM10-Gox-CBD的E.coliBL21（DE3））在液体LB培养基中培养过夜，然后按100:1的比例转接至2L的摇瓶中，待OD600约为0.6时加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG进行融合蛋白的表达。

本发明的有益效果是：本发明的融合酶可以经过一步纯化操作，只需要将大肠杆菌经过简单的破碎处理，然后将融合蛋白固定到微晶纤维素上，具有结合特异性好、纯度高等特性。本发明中融合蛋白结合至微晶纤维素，可以通过纯水或者乙二醇进行洗脱，从而获得目的蛋白。本发明的融合蛋白具有L-谷氨酸氧化酶的活性，其最适反应温度为40℃，最适反应pH 6.5。当在60℃条件下保温30min后，该酶酶活仍保存有70%的活性。该融合蛋白与微晶纤维素在4℃条件下充分结合约1h，其与微晶纤维素的结合量为9.0 mg/g，预期该融合蛋白具有α-酮戊二酸的生产制备及生物传感等方面。

附图说明

图1：L-谷氨酸氧化酶基因图谱。

图2：融合蛋白L-谷氨酸氧化酶-CBD分离纯化图谱。

图3：融合蛋白L-谷氨酸氧化酶-CBD结合微晶纤维素的测定。

图4：一步纯化操作纯化融合蛋白L-谷氨酸氧化酶-CBD（M：蛋白分子量；1：诱导前；2：诱导全菌；3：全菌破碎上清液；4：破碎形成包涵体部分；5：流穿；6：wash；7：结合到微晶纤维素上的融合蛋白L-谷氨酸氧化酶-CBD）

图5：本发明表达载体pETM10的基因图谱。

具体实施方式

本发明具体揭示了一种L-谷氨酸氧化酶-CBD融合酶及其表达基因和应用。具体的，

材料的准备

质粒pETM10-CBD由本实验室构建与保存，L-谷氨酸氧化酶由公司优化并进行全基因合成；菌株E.coliBL21（DE3）、E.coli DH5α购买自北京全式金生物科技有限公司。LB培养基（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物（均购自OXOID）5 g/L，NaCl 10 g/L）用于E.coli的培养。

所述表达载体pETM10图谱如5所示。所述质粒载体pETM10-CBD在构建时，以引物进行PCR扩增，所述引物为：

P3：ATGAAGCTTCCTCCGACGCCGACCCCGAC，下划线为HindIII位点；

P4:ATGCTCGAGTTAGCCGACCGTGCAGGGCGT ，下划线为XhoI位点。

抗生素和诱导剂的储存浓度：硫酸卡那霉素50mg/mL，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）为1mol/L。4-氨基安替比林和20种氨基酸购自Sigma，苯酚购自上海泰坦科技有限公司，过氧化氢标准液购自AlfaAesar公司，辣根过氧化物酶购自南京建成生物工程研究所。

PCR扩增引物合成和DNA测序由金唯智生物技术有限公司完成。

谷氨酸氧化酶-CBD的表达载体的构建

以全基因合成的L-谷氨酸氧化酶的基因为模板，使用PCR扩增引物（P1和P2）扩增Gox基因片段。所述L-谷氨酸氧化酶来源于Streptomyces platensisNTU3304，其基因图谱如图1所示。

P1：CATGCCATGGCTGCGGCCAAGACGTGTCAG，下划线表示Nco I位点；

P2：CCCAAGCTTGCCTGCACCAGCGCTGGTAACAACGTCCTC，下划线为Hind III位点；

PCR反应程序为：95℃预变性2 min；95℃变性20 s，63℃退火20 s，72℃延伸1 min 30 s，30个循环；72℃延伸5 min。PCR完成，进行琼脂糖凝胶电泳，检测目的条带。检测到目的条带以后，使用cycle-pure核酸一步纯化试剂盒将目的基因片段回收，得到完整的Gox基因片段。用Nco I和HindIII核酸内切酶对目的基因片段和载体pETM10-CBD进行酶切，37℃酶切1 h。使用cycle-pure核酸一步回收试剂盒回收目的基因片段，载体使用胶回收试剂盒回收。将片段和载体使用T4DNA连接酶连接，然后转化E.coli DH5α。

表达载体pETM10-Gox-CBD大肠杆菌转化和重组筛选验证

将构建的表达载体进行菌落PCR验证，将阳性克隆进行DNA序列测定，确定构建正确的碱基序列，并命名为pETM10-Gox-CBD。然后，将阳性克隆pETM10-Gox-CBD转化至大肠杆菌中，在含有50mg/L的硫酸卡那霉素培养基中37℃过夜培养。并对质粒及对菌落进行保存。

融合蛋白L-谷氨酸氧化酶-CBD的表达与纯化

将pETM10-Gox-CBD表达质粒转化至E.coli BL21（DE3）中，对目的蛋白的表达情况进行研究。而异源蛋白可溶性表达是由多因素决定的，它与基因序列、载体、蛋白结构、宿主及培养条件等密切相关，为了增加表达蛋白的可溶性，融合蛋白L-谷氨酸氧化酶-CBD的表达采用16℃，IPTG浓度为0.1mmol/L培养12 h的表达条件进行表达。

根据蛋白表达条件进行菌体的培养，然后用缓冲液A（50mmol/L Tris/HCl pH 7.4, 100mmol/L NaCl）悬浮充分，加入终浓度为1mmol/L的苯甲基磺酰氟（PMSF），高压匀浆破碎仪破碎3-4遍，低温离心（4℃，15000r/min离心1h），收集上清，然后用0.45µm的滤膜过滤除杂。由于融合表达蛋白带有His标签，因而在实验阶段采用Ni柱亲合层析柱纯化蛋白，用缓冲液B（50mmol/LTris/HCl pH 7.4, 100mmol/LNaCl 500 mmol/L咪唑）梯度洗脱，根据峰图收集有活性洗脱液，经SDS-PAGE检测，获得较为纯净的蛋白，如图2所示。

酶活测定方法

通过4-氨基安替吡啉苯酚法来测定过氧化氢的增加量。将1ml的反应液在30℃反应10min，测定其在505nm下每分钟吸光值的增加量。Gox一个酶活单位的定义为：30℃下每分钟释放1µmol过氧化氢所需的酶量。1mL的反应液体系包括10U/mL的过氧化物酶，25 mmol/L L-谷氨酸、2mmol/L的4-氨基安替吡啉、10 mmol/L的苯酚和适量的酶于pH 7.4的磷酸盐缓冲液中。

融合蛋白结合量的测定

称取1.0g微晶纤维素（MCC）于15ml离心管中，先用去离子水洗2遍（5000r/min离心5 min），然后使用缓冲液C（20mmol/L KPB 100 mmol/LNaCl pH 7.4）平衡MCC，离心并倒去上清液。将纯化的蛋白（蛋白浓度约为1.5mg/mL）10ml与MCC 4℃孵育4h，期间取样（10 min、20 min、25 min、30 min、60 min、90 min、120 min和240min）测定结合量。结合完成后，4℃离心，倒去并保留上清液，然后使用含有1mol/LNaCl的缓冲液D（20mmol/L KPB 1mol/LNaClpH 7.4）对非特异结合蛋白进行洗脱。将各部分收集，测定蛋白浓度。

蛋白结合量即为结合前的蛋白总量减去离心上清液与wash上清液的蛋白总和。

融合蛋白的酶学性质测定

最适反应温度：

按照酶活测定方法，将等量的纯酶分别于20～80℃的条件下测定酶活，以所测的不同反应温度下的最高酶活为100%，研究不同温度对酶的影响，发现最适反应温度为40℃。

热稳定性测定：

按照酶活测定方法，将等量的酶置于20～80℃条件下，在不同温度下孵育30min，然后测定剩余酶的酶活，以最高酶活为100%，研究其热稳定性，研究发现当在60℃条件下保温30min后，该酶酶活仍保存有70%的活性。

最适反应pH：

按照酶活测定方法，将纯化的酶置于pH 4.5～8.5（pH 4.5～5.5为0.1 mol/L的柠檬酸缓冲液；pH 6.0～8.0为0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液；pH 8.0～9.0为含有0.1mol/L NaCl的50mmol/LTris/HCl）范围内，在最适反应温度下测定酶活，以所测的最高酶活为100%，其最适pH为6.5。

金属离子的影响：

按照酶活测定方法，在反应液中加入不同的金属离子，以对照组不含金属离子为100%，研究金属离子对其的影响，发现Cu²⁺和Hg²⁺有明显抑制融合蛋白的酶活性。

融合蛋白结合稳定性测定

将固定化的Gox进行结合稳定性研究，纤维素结合域有可能会被双蒸水、低盐（<5mmol/L）或pH>9的缓冲液等洗脱掉，为了使纤维素结合域能够牢固的结合在纤维素，通过测定这些条件对结合蛋白的影响，并确定Gox结合到MCC上稳定性的参数，以便为以后的应用提供参考。结合图3所示，发现融合蛋白可以在纯水的作用下从微晶纤维素上洗脱下来；只要pH≤10,皆可以稳定结合在纤维素上。

一步纯化融合蛋白L-谷氨酸氧化酶-CBD

将菌体破碎离心上清液与微晶纤维素4℃孵育4h，结合完成后，将结合液通过重力柱，然后使用含有1mol/LNaCl的缓冲液D（20mmol/L KPB 1 mol/LNaCl pH 7.4）对非特异结合蛋白进行洗脱。并检测结合到微晶纤维素上的融合蛋白L-谷氨酸氧化酶-CBD，如图4所示，发现其操作简便，纯度较好，为蛋白酶纯化及其酶的固定化提供的新的研究理论基础。

本发明基于纤维素结合区域（Cellulose Binding Domain，CBD）是纤维素酶的组成部分，其来源广泛，价格低廉且能和纤维素载体牢固的结合，但不起催化作用。利用基因工程的方法将该纤维素结合域与蛋白融合表达，然后将融合表达的蛋白置于纤维素基质上，它具有结合能力强，特异性好等特点。

L-谷氨酸氧化酶作为氨基酸氧化酶的一种，它的应用较为广泛，通过融合表达L-谷氨酸氧化酶的方法，可以得到有活性的酶蛋白。通过一步纯化操作，可以将融合有纤维素结合域的L-谷氨酸氧化酶结合到微晶纤维素上，其操作方便，特异性强，并且经济实惠。本发明通过融合表达L-谷氨酸氧化酶的方法，并对固定到纤维素上的L-谷氨酸氧化酶酶学特性进行了初步的探索，为后续的生物传感器的应用、α-酮酸的制备等方面提供了理论基础。

本发明尚有多种具体的实施方式。凡采用等同替换或者等效变换而形成的所有技术方案，均落在本发明要求保护的范围之内。