表达载体及重组细胞的制作方法

本发明属于基因工程
技术领域：
，具体地，本发明涉及一种表达载体以及包括该表达载体的重组细胞，特别地，本发明尤其涉及IDS基因过表达慢病毒质粒表达载体。
背景技术：
：慢病毒载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的基因的效果。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的基因治疗效果。对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因的转导效率，且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因的长期、稳定表达。在体外实验及体内实验的研究中，慢病毒已经成为表达外源基因的常用载体形式之一，并且正在获得越来越广泛的应用。在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。粘多糖贮积症II型(Mucopo1ysaccharidosistypeII，MPSII，MIM309900)，又称Hunter综合征，是一种X连锁隐性遗传病，在人群中的发病率极低，属于一种“罕见病”。由于基因突变导致溶酶体酶艾杜糖-2-硫酸酯酶(iduronate-2-sulfatase，IDS)缺乏，以致粘多糖(mucop01ysaccharides，MPS)在体内大量沉积，尿中大量排出硫酸皮肤素(dermatinsulfateB，DS)、硫酸已酰肝素(heparitinsulfate，HS)。患者出生时表现一般正常，但随着越来越多的粘多糖贮积在体内，MPSII病程进行性加重，症状典型，预后甚差。IDS基因定位于Xq27.3-Xq28，MPSII与IDS基因发生突变高度相关。因此，开发一种可携带IDS基因的慢病毒载体，对于研究IDS基因的功能提供了良好的工具，且为Hunter综合征的慢病毒基因治疗提供了一种较为理想的手段，具有重要的现实意义。技术实现要素：针对现有技术中存在的缺陷，本发明提供了一种可携带IDS基因的慢病毒表达载体以及包括该表达载体的重组细胞。一方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包括EF1α-IDS序列。前述的表达载体，所述EF1α-IDS序列包括：强启动子EF1α或者其功能片段或序列变体；IDS基因；和增强子Kozak或者其功能片段或序列变体；其中，增强子Kozak或者其功能片段或序列变体插入到强启动子EF1α或者其功能片段或序列变体与IDS基因之间。前述的表达载体，所述EF1α-IDS序列包括：强启动子EF1α，IDS基因，和插入到强启动子EF1α与IDS基因之间的增强子Kozak。前述的表达载体，所述增强子Kozak的序列是CGCCACC。前述的表达载体，所述EF1α-IDS序列是SEQIDNo:1所示的序列。前述的表达载体，所述表达载体以慢病毒载体pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE为骨架载体，将PGK-GFP序列替换为EF1α-IDS序列。另一方面，本发明还提供了包括上述表达载体的重组细胞。相比于现有技术，本发明的技术方案至少具有如下有益效果：(1)本发明提供了一种IDS基因过表达慢病毒质粒表达载体，为研究IDS基因的功能提供了良好的工具。(2)本发明所述的启动子EF1α，是一种强表达的启动子，可使外源基因在哺乳动物细胞中广泛表达，甚至可在原代细胞和干细胞内表达。(3)本发明所述的增强子Kozak，是用来增强真核基因的翻译效率的，是最优化的ATG环境，避免核糖体出现leakyscan。附图说明图1是pRRLSIN.cPPT.EF1α-IDS.WPRE载体图谱。图2是pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE载体酶切结果。其中，1#:10kbMarker(条带自上而下依次为：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp)2#:载体酶切产物3#:未酶切载体(从细菌中提取的质粒因可能存在超螺旋，开环，线性等不同的构象而具有不同的迁移速率，在琼脂糖凝胶电泳中呈现大小不同的条带，故此时质粒的电泳条带只能作为质粒分子量大小判断的参考，不可作为准确判断依据。质粒经单酶切消化后，会呈现均一的电泳条带，此时可与Marker对比判断其分子量大小)。图3是EF1α片段胶回收电泳结果。其中，Marker自上而下依次为：5kb，3kb，2kb，1.5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp。图4是IDS片段胶回收电泳结果。其中，Marker自上而下依次为：5kb，3kb，2kb，1.5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp。图5是EF1α-IDS片段胶回收电泳结果。其中，Marker自上而下依次为：5kb，3kb，2kb，1.5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp图6是转化子PCR产物电泳图。其中，1#：阴性对照(ddH2O)；2#：阴性对照(空载自连对照组)；3#：阳性对照(GAPDH)；4#：Marker自上而下依次为5kb，3kb，2kb，1.5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp；5#-12#：IDS1-8号转化子。图7是阳性克隆测序结果。图8是质粒表达检测流程图。图9是Real-timePCR实验数据统计结果。具体实施方式为充分了解本发明之目的、特征及功效，借由下述具体的实施方式，对本发明做详细说明，但本发明并不仅仅限于此。下述具体实施方式中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。下述具体实施方式中所涉及的物质均为常规市购得到。在此应当说明的是，除非另有说明，否则本发明中所涉及的术语具有本领域技术人通常理解的含义。I.表达载体本发明的一个方面提供了一种表达载体，该表达载体是IDS基因过表达慢病毒质粒表达载体，该表达载体包括EF1α-IDS序列。其中，EF1α-IDS序列包括：强启动子EF1α或者其功能片段或序列变体；IDS基因；和增强子Kozak或者其功能片段或序列变体；其中，增强子Kozak或者其功能片段或序列变体插入到强启动子EF1α或者其功能片段或序列变体与IDS基因之间。在一种具体实施方式中，EF1α-IDS序列包括强启动子EF1α，IDS基因，和插入到强启动子EF1α与IDS基因之间的增强子Kozak。其中增强子Kozak的序列是CGCCACC。在另一种具体实施方式中，EF1α-IDS序列是序列表中SEQIDNo:1所示的序列：在一种特别优选的具体实施方式中，本发明的表达载体是IDS基因过表达慢病毒质粒表达载体pRRLSIN.cPPT.EF1α-IDS.WPRE，如图1所示，其是以慢病毒载体pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE为骨架载体，将PGK-GFP序列替换为EF1α-IDS序列(序列表中SEQIDNo:1所示的序列)，即pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE中原有的PGK启动子替换为强启动子EF1α，将原有的GFP基因替换为IDS基因，并在强启动子EF1α和目的基因IDS之间插入增强子Kozak(CGCCACC)。II.表达载体的构建本发明表达载体的构建方法主要包括骨架载体线性化、EF1α-IDS的获取和重组载体的构建。具体如下：1.pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE载体线性化使用限制性核酸内切酶EcoRV和SalI，对pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE载体进行双酶切，随后胶回收约6Kb的酶切产物。2.EF1α-IDS片段的获取EF1α片段的获取：设计一对引物，以pMD18-EF1α载体为模板，PCR扩增EF1α片段并胶回收。IDS片段的获取：设计一对引物，以pMD18-IDS载体为模板，PCR扩增IDS片段并胶回收。EF1α-IDS片段的拼接：以胶回收的EF1α片段和IDS片段为模板，设计一对引物，进行两个片段的重叠PCR，拼接获得EF1α-IDS片段。3.pRRLSIN.cPPT.EF1α-IDS.WPRE重组质粒的构建EF1α-IDS片段通过同源重组构建到线性化骨架载体。在一种具体实施方式中，本发明的IDS基因过表达慢病毒质粒表达载体pRRLSIN.cPPT.EF1α-IDS.WPRE的构建方法如下：1.pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE载体线性化将慢病毒载体pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE(购自美国Addgege公司)进行EcoRV和SalI双酶切，并胶回收约6Kb酶切产物，酶切体系(ThermoScientific公司)如下：将上述混合液于37℃，反应30min。酶切结果如图2所示。2.EF1α-IDS片段的获取A、EF1α片段的获取以pMD18-EF1α(序列是SEQIDNo:2所示的序列)为模板，PCR扩增EF1α片段，胶回收约1301bp片段。采用IDS-P1和IDS-P2引物对，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列如下表：ID序列IDS-P1GCCTCGAGAAGCTTGATATCAAGCTTTGCAAAGATGGATAAAGIDS-P2TGGCGGCATGGTGGCGTCACGACACCTGAAATGGAAGPCR反应体系如下：PCR反应体系50μL(PCR反应相关试剂购自天根生化科技(北京)有限公司)。反应条件：95℃预变性5min；(95℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸45s)，30个循环；72℃延伸10min；产物在4℃保存。扩增片段大小1301bp。用PCR纯化试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)纯化PCR产物。PCR琼脂糖电泳结果如图3所示。B、IDS片段的获取以pMD18-IDS(序列是SEQIDNo:3所示的序列)为模板，PCR扩增IDS片段，胶回收约1697bp片段。采用IDS-P3和IDS-P4引物对，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列如下表：ID序列IDS-P3CTTCCATTTCAGGTGTCGTGACGCCACCATGCCGCCAIDS-P4TCCAGAGGTTGATTGTCGACGCGGCCGCTTTAAGGCATCAACAACTGGAAAAGATCPCR反应体系如下：PCR反应体系50μL(PCR反应相关试剂购自天根生化科技(北京)有限公司)。反应条件：95℃预变性5min；(95℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸60s)，30个循环；72℃延伸10min；产物在4℃保存。扩增片段大小1697bp。用PCR纯化试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)纯化PCR产物。PCR琼脂糖电泳结果如图4所示。C、EF1α-IDS片段的拼接以胶回收的EF1α片段和IDS片段为模板，以IDS-P1和IDS-P4为引物进行两个片段的重叠PCR，PCR反应体系如下：PCR反应体系50μL(PCR反应相关试剂购自天根生化科技(北京)有限公司)。反应条件：95℃预变性5min；(95℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸60s)，30个循环；72℃延伸10min；产物在4℃保存。扩增片段大小2947bp。用PCR纯化试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)纯化PCR产物。PCR琼脂糖电泳结果如图5所示。3.pRRLSIN.cPPT.EF1α-IDS.WPRE重组质粒的构建EF1α-IDS片段通过同源重组构建到线性化载体，重组反应体系(购自天根生化科技(北京)有限公司)如下：EF1α-IDS片段2ul线性化载体2ul2×EasyGenoAssemblyMix5ulH2O1ul将上述混合液于50℃，反应15min。然后42℃热击转化入DH5α感受态细胞，涂布含氨苄青霉素的LB平板，筛选阳性转化子，对阳性转化子进行PCR鉴定(结果如图6所示)，鉴定引物如下：ID序列IDS-P5CTTGAGTGCTTTGGACGATIDS-P6AGCGTAAAAGGAGCAACATAG阳性转化子PCR产物大小约为798bp，将阳性克隆进行测序(测序结果如图7所示)，通过阳性克隆测序结果及结果分析，证明获得pRRLSIN.cPPT.EF1α-IDS.WPRE重组质粒(质粒图谱如图1所示)。III.表达检测以293T为目的细胞(293细胞是转染腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞系，293T细胞由293细胞派生，同时表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区的质粒可以复制)，以DMEM培养基(含10％胎牛血清)为培养基，具体操作过程参考《质粒转染细胞操作手册》和《RealtimePCR操作手册》(上海吉凯基因生物科技有限公司)，其流程如图8所示。引物序列如下：Real-timePCR实验数据如下：实验分组内参基因Ct值目的基因Ct值ΔCt-ΔΔCt2-ΔΔCtCON14.2620.536.270.0831.059CON14.1820.516.330.0231.016CON14.1220.586.46-0.1070.929OE14.1410.88-3.269.613783.252OE13.9910.91-3.089.433691.379OE14.0110.85-3.169.513730.800Real-timePCR实验数据统计结果如下(如图9所示)：注：1、CON：为293T细胞样品(对照组)OE：为目的基因质粒转染293T后样品2、2-ΔΔCt法计算说明：ΔCt＝目的基因Ct值-内参基因Ct值，-ΔΔCt＝NC组ΔCt平均值-各样品ΔCt值。2-ΔΔCt反映各样品相对对照组样品目的基因的相对表达水平结论：经RealtimePCR检测，结果说明：从定量PCR结果可以看出，293T细胞中，OE组IDS表达丰度是CON组的735.144倍(p<0.05)。当前第1页1 2 3