本发明为一种添加过氧化氢胁迫节杆菌Arthrobacter sp. LHM 7719发酵产过氧化氢酶的方法。通过研究过氧化氢对Arthrobacter sp. LHM 7719产酶的胁迫影响，达到过氧化氢酶高产的目的，属于微生物发酵产酶技术领域。
背景技术：
过氧化氢(H2O2)，俗称双氧水，是一种强氧化剂，主要应用于化学品合成、纸浆漂白、印染、冶金、半导体材料处理以及食品的生产和加工。在2006年，全世界消耗过氧化氢的量已接近220万吨；但过氧化氢在纺织和造纸行的残留会极大地影响印染效果；没有及时除去过氧化氢工业废水，会引起外环境污染。过氧化氢酶(CAT)可以将纺织漂洗工艺残留的过氧化氢催化分解为无毒的水和氧气，不影响下游的印染工艺,该反应不需要在高温高压的条件就能有效进行，避免了大量能源的消耗。CAT能够有效地清除食品工业中残余的H2O2,从而避免食品风味的破坏，并且该酶本身没有毒性。另在工业废水的处理中，添加了CAT的H2O2，对芳环化合物和脂族化合物的降解具有促进作用。因此极大的刺激了过氧化氢酶生产的研究。
目前国内外过氧化氢酶市场需求量日益增加，然而微生物发酵法产酶量较低从而导致成本较高仍然是当今人们在进行过氧化氢酶工业化生产过程中亟待解决的主要问题；本申请人已经获得授权的发明专利“ZL201310505522.2一种碱性过氧化氢酶高产菌及该菌株发酵法生产工艺”。该菌株(Arthrobacter sp. LHM7719)所生产的过氧化氢酶不仅具有产量高、耐碱等优点，而且所生产过程中所需要的主要原料为非粮食农产品，廉价易得且环保。采用一定浓度的H2O2添加胁迫Arthrobacter sp. LHM7719可以明显地提升该菌株发酵生产过氧化氢酶的潜力，进一步地降低了过氧化氢酶的生产成本。所添加的H2O2价格低廉，整个操作简便，适合工业化生产。
技术实现要素：
本发明研究出菌体对数中后期以后在产酶培养基中添加0.4%(v/v)～0.9%(v/v)过氧化氢作为诱导剂后，胁迫菌体产生过氧化氢酶，经过深层发酵，可明显提高过氧化氢酶的活力达1.15倍左右，相当于增加过氧化氢酶15%左右，且适用于工业化。
本发明的技术方案：以已经获批授权发明专利“ZL201310505522.2一种碱性过氧化氢酶高产菌及该菌株发酵法生产工艺”的一株高产过氧化氢酶的Arthrobactersp. LHM 7719为生产菌株，经种子培养和在产酶培养基中添加0.4%(v/v)～0.9%(v/v)过氧化氢作为诱导剂后，胁迫菌体产生过氧化氢酶，经过深层发酵，可明显提高过氧化氢酶的产量，且适用于工业化生产。
一种添加过氧化氢胁迫节杆菌发酵产过氧化氢酶的方法，按照下述步骤进行：
（1）种子培养基：
从斜面上挑取单菌落，划线于LB平板培养基，将平板倒置于30℃培养箱中培养24小时，再从平板上刮取一环菌种，接种到含有50mL种子培养基的250mL三角瓶中进行培养，培养条件：pH 7.2，培养时间16小时，温度30℃，摇床转速为160r/min，即发酵种子液；
其中LB平板培养基组成为：蛋白胨10g/L，酵母浸膏5g/L，氯化钠5g/L，琼脂25g/L,pH 7.2,121℃灭菌30min，冷却。
其中种子培养基是LB培养基，其组成为：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸膏5g/L，氯化钠5g/L，pH 7.2，121℃灭菌30min，冷却。
（2）发酵产酶
以体积比3.5%的接种量将培养好的种子液接种到含5L产酶培养基的7L发酵罐进行发酵产酶；发酵条件：pH为7.0～8.0，培养温度为30～40℃，发酵时间为35～55小时，转速350～500r/min，通气量1.2L/min～1.7L/min；
发酵过程中过氧化氢的添加方式为：在发酵开始后18小时，22小时，26小时，30小时，34小时，38小时分批添加培养基中，使培养基中的过氧化氢的体积浓度为0.4%～0.6%；42小时至52小时恒速流加过氧化氢，使得这一段时间培养基中过氧化氢的体积浓度维持在0.6%～0.9%区间的某一定值处；
其中产酶培养基组成为：木薯淀粉15～20g/L，豆粕粉50～70g/L，磷酸二氢钾 0.5g/L，消泡剂0.2～0.5g/L，121℃灭菌20min，冷却。
（3）过氧化氢酶提取
取2.5L发酵液，10000 转/分钟离心30分钟，获得菌泥，采用高压进行细胞破碎，破碎机压力控制在2000bar以上，加入磷酸缓冲液2.5L混匀后，10000 转/分钟离心30分钟，取上清液得到碱性过氧化氢酶。
然后按本篇所介绍的过氧化氢酶活力测定方法测定酶活力，并按照发酵液等体积计算过氧化氢酶产量（U/mL）；
本发明酶活的测定方法
反应总体积为3 mL，含0.1ml粗酶液和pH 7.0的1mol/L的K2HPO4-KH2PO4缓冲液2.4mL，新鲜配置的0.12mol/LH2O2溶液0.5mL，以去离子水替代H2O2溶液作为空白对照，以波长240nm体系下吸光度的下降来衡量过氧化氢的酶促降解速度，每隔10s读取一次吸光度值，一般持续1min后停止测定，以反应的线性范围计算酶活U/mL；一个标准酶活单位定义为:在最适温度下，1 min内分解1 µmol H2O2 (消光系数为39.4L/mol/cm)所需的酶量。
本发明的有益效果:
本发明的方法可以明显地提升该菌株Arthrobacter sp. LHM7719发酵生产过氧化氢酶的潜力，进一步地降低了过氧化氢酶的生产成本。所添加的H2O2价格低廉，整个操作简便，适合工业化生产，所生产的过氧化氢酶可用于纺织印染行业、食品工业、工业废水处理、造纸等领域。因此本发明有广泛的工业使用价值和较好的经济效益前景。
具体实施方式
对照实施例1：
从斜面上挑取单菌落，划线于LB平板培养基，将平板倒置于30℃培养箱中培养24小时，再从平板上刮取一环菌种，接种到含有40mL种子培养基的250mL三角瓶中进行培养。培养条件：pH 7.2，培养时间16小时，温度30℃，摇床转速为160r/min，再以3.5%的接种量将培养好的种子液接种到含5L产酶培养基的7L发酵罐进行发酵产酶试验，整个发酵过程不添加过氧化氢。发酵条件：pH为7.2，培养温度为30℃，发酵时间为42小时，转速400r/min，通气量1.7L/min，最终获得的发酵液酶活力达45100U/mL。
其中LB平板培养基组成为：蛋白胨10g/L，酵母浸膏5g/L，氯化钠5g/L，琼脂25g/L,pH 7.2,121℃灭菌30min，冷却。
其中种子培养基是LB培养基，其组成为：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸膏5g/L，氯化钠5g/L，pH 7.2，121℃灭菌30min，冷却。
其中产酶培养基组成为：木薯淀粉15～20g/L，豆粕粉50～70g/L，磷酸二氢钾 0.5g/L，消泡剂0.2～0.5g/L，121℃灭菌20min，冷却。
实施例1
从斜面上挑取单菌落，划线于LB平板培养基，将平板倒置于30℃培养箱中培养24小时，再从平板上刮取一环菌种，接种到含有40mL种子培养基的250mL三角瓶中进行培养。培养条件：pH 7.2，培养时间16小时，温度30℃，摇床转速为160r/min，再以3.5%的接种量将培养好的种子液接种到含5L产酶培养基的7L发酵罐进行发酵产酶试验。产酶发酵过程中添加H2O2的方式为：在发酵开始后18小时，22小时，26小时，30小时，34小时，38小时，42小时分批添加培养基中体积浓度为0.55%的过氧化氢。发酵条件：pH为7.2，培养温度为30℃，发酵时间为46小时，转速400r/min，通气量1.7L/min，最终获得的发酵液酶活力达48230U/mL，酶活力较对照实施例1提高了1.0694倍，相当于过氧化氢酶产量提高了6.94%。其中LB平板培养基组成为：蛋白胨10g/L，酵母浸膏5g/L，氯化钠5g/L，琼脂25g/L,pH 7.2,121℃灭菌30min，冷却。
其中种子培养基是LB培养基，其组成为：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸膏5g/L，氯化钠5g/L，pH 7.2，121℃灭菌30min，冷却。
其中产酶培养基组成为：木薯淀粉15～20g/L，豆粕粉50～70g/L，磷酸二氢钾 0.5g/L，消泡剂0.2～0.5g/L，121℃灭菌20min，冷却。
实施例2
从斜面上挑取单菌落，划线于LB平板培养基，将平板倒置于30℃培养箱中培养24小时，再从平板上刮取一环菌种，接种到含有40mL种子培养基的250mL三角瓶中进行培养。培养条件：pH 7.2，培养时间16小时，温度30℃，摇床转速为160r/min，再以3.5%的接种量将培养好的种子液接种到含5L产酶培养基的7L发酵罐进行发酵产酶试验。产酶发酵过程中添加H2O2的方式为：发酵过程中过氧化氢的添加方式为：在发酵开始后18小时，22小时，26小时，30小时，34小时，38小时分批添加培养基中体积浓度为0.55%的过氧化氢；42小时至52小时恒速流加过氧化氢，使得这一段时间培养基中过氧化氢的体积浓度维持在0.82%。发酵条件：pH为7.2，培养温度为30℃，发酵时间为52小时，转速400r/min，通气量1.7L/min，最终获得的发酵液酶活力达51870U/mL，酶活力较对照实施例1提高了1.15倍，相当于过氧化氢酶产量提高了15.01%。其中LB平板培养基组成为：蛋白胨10g/L，酵母浸膏5g/L，氯化钠5g/L，琼脂25g/L,pH 7.2,121℃灭菌30min，冷却。
其中种子培养基是LB培养基，其组成为：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸膏5g/L，氯化钠5g/L，pH 7.2，121℃灭菌30min，冷却。
其中产酶培养基组成为：木薯淀粉15～20g/L，豆粕粉50～70g/L，磷酸二氢钾 0.5g/L，消泡剂0.2～0.5g/L，121℃灭菌20min，冷却。