本发明涉及多肽合成、药物多肽等领域，具体涉及一种非天然氨基酸N-芴甲氧羰基-β-(2-噻吩基)-D-丙氨酸及其中间体的制备方法。
背景技术：
目前现有技术中，非天然氨基酸N-芴甲氧羰基-β-(2-噻吩基)-D-丙氨酸及其中间体的制备方法路线为：将2-噻吩甲醇通过羟基氯酰化做成2-氯甲基噻吩，再经过和金属钠和乙醇和乙酰氨基丙二酸二乙酯混合合成二乙酯，再加入D-酰化酶拆分得到h-d-thi-oh，再和fmoc-基团反应制得fmoc-d-thi-oh，这种方法操作过程看似简单，但是需要用到相对昂贵的D-酰化酶，且成本高，不适宜商业化生产。
技术实现要素：
本发明目的在于克服原工艺中的复杂性，成本高，收率低等技术问题，提供了一种非天然氨基酸N-芴甲氧羰基-β-(2-噻吩基)-D-丙氨酸及其中间体的制备方法，该方法简单易控制，成本低，适宜于规模化生产。
为了达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：一种非天然氨基酸N-芴甲氧羰基-β-(2-噻吩基)-D-丙氨酸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1），将2-噻吩甲醇加入二氯甲烷中，再加砒啶搅拌，冰浴并通入氯酰化剂进行反应，TLC跟踪检测进程，后经过萃取碱洗，水洗，盐水洗，得到2-氯甲基噻吩；
（2），将2-氯甲基噻吩、乙酰基丙二酸二乙酯和乙醇钠混合在无水乙醇中加热回流反应，冰浴结晶，将结晶物过滤水洗石油醚洗，烘干，得2-噻吩基丙二酸二乙酯；
（3），将2-噻吩基丙二酸二乙酯经过氢氧化钠皂化处理，并经过L-酰化酶的处理再加入fmoc-osu和的丙酮，并用碳酸钠水溶液调节体系pH值为8-9 反应，反应完成后处理好后得固体为fmoc-thi-oh，母液低温保存待用；
（4），将母液用乙酸乙酯洗涤，然后加入盐酸和甲醇等比例混合液，加热回流反应，TLC跟踪检测进程，并送NMR验证，至基本反应完成后，分批多次加入fmoc-osu的固体，并TLC跟踪检测进程，反应完成后抽滤，将体系用的醋酸乙酯和石油醚的混合溶剂多次洗涤，之后用盐酸酸化体系，并降温搅拌，得到褐色结晶，即为N-芴甲氧羰基-β-(2-噻吩基)-D-丙氨酸。
所述步骤（1），2-噻吩甲醇、吡啶和氯酰化剂的物质的量比为1:1.5:（1-2），反应的温度为：0-10℃，反应时间为3-5h，所述的氯酰化剂为氯化亚砜、三光气、光气，优选氯化亚砜。
所述步骤（2），2-氯甲基噻吩、乙酰基丙二酸二乙酯和乙醇钠的物质的量比为：1:（1-1.4）:（1-1.4），反应温度为40℃至回流，反应时间为4-7h。
所述步骤（4），母液和盐酸与甲醇的等比例混合溶液的体积比为1:（0.25-1），反应时间为：48-72h。
所述TLC跟踪检测进程的条件：1、醋酸乙酯:二氯甲烷体积比=1:3，2、三氯甲烷:甲醇:乙酸体积比=90:8:2。
本发明的有益效果：本发明制备方法通过用盐酸的有机溶液在加热回流而取代用昂贵的d-酰化酶来脱除乙酰基而制备成h-d-thi-oh，并最终制得N-芴甲氧羰基-β-(2-噻吩基)-D-丙氨酸，此方法简单易控制，大大简化了工艺，降低了成本，缩短了周期，适用于大规模生产，本发明制得N-芴甲氧羰基-β-(2-噻吩基)-D-丙氨酸收率高，质量也有明显的提高。
附图说明
图1为本发明产物的核磁图谱。
图2为本发明产物的质谱图谱。
具体实施方式
下面结合具体实例对本发明进行详细的描述，但他们不是对本发明的进一步限制。
实验所用主要检测仪器：
1、岛津20A
2、检验条件：色谱柱：4.6*250㎜，sinochrom ODS-BP 5μm
3、检测波长：220nm
4、流动相：A： 0.1%质量百分浓度三氟乙酸溶液
B： 0.1%质量百分浓度三氟乙酸乙腈混合溶液
5、流速：1.0ml/min
6、柱温：25℃。
实施例1：
1.1在2000ml的三口瓶中加入800ml二氯甲烷，之后加入100g 2-噻吩甲醇，再加入103g吡啶，充分搅拌，降温至0℃以下，滴加入104g氯化亚砜，在0℃下反应5小时，之后加入400ml冰水，用氢氧化钠调节体系pH值为7-8左右，分层后，二氯甲烷相再用4%质量百分浓度的氢氧化钠洗涤2次，水洗一次，饱和盐水洗涤一次，加入无水硫酸钠充分搅拌干燥，之后50℃浓缩至干得油83.6g，即为2-氯甲基噻吩。
1.2在1000ml的三口瓶中加入300ml无水乙醇，之后加入43g乙醇钠，充分搅拌至其全溶，全溶后加入191.5g乙酰氨基丙二酸二乙酯，并调节至40℃保温反应40分钟，之后缓慢加入83.6g的油，充分搅拌后加热回流反应4小时，反应好后加入4倍的冰水中，充分搅拌后抽滤，滤饼即为2-噻吩基丙二酸二乙酯。
1.3将2-噻吩基丙二酸二乙酯经过氢氧化钠皂化处理，并经过L-酰化酶的处理再加入fmoc-osu和的丙酮，并用碳酸钠水溶液调节体系pH值为8-9 反应，反应完成后处理好后得固体为fmoc-thi-oh（保存另用），母液低温保存待用。
1.4将所得母液约2L加入5L三口瓶中，之后加入500ml的盐酸和甲醇的等比例混合液，并加热回流48h，TLC跟踪检测，并送NMR验证，至基本反应完成后，分批多次加入fmoc-osu的固体，并TLC跟踪监测反应进程，反应完成后抽滤，将体系用500ml的醋酸乙酯和石油醚的混合溶剂洗4次，之后用盐酸酸化体系pH值为1左右，并降温搅拌，产生褐色结晶，得固体39.5g。
通过MS、旋光、hplc、NMR对固体进行分析，即为N-芴甲氧羰基-β-(2-噻吩基)-D-丙氨酸，hplc：98.54%，旋光+29º、MS、NMR符合实际，见图1、2。
实施例2：
2.1在2000ml的三口瓶中加入800ml二氯甲烷，之后加入100g 2-噻吩甲醇，再加入103g吡啶，充分搅拌，降温至0℃以下，滴加入155g氯化亚砜，在5℃下反应4小时，之后加入400ml冰水，用氢氧化钠调节体系pH值为7-8左右，分层后，二氯甲烷相再用4%质量百分浓度的氢氧化钠洗涤2次，水洗一次，饱和盐水洗涤一次，加入无水硫酸钠充分搅拌干燥，之后50℃浓缩至干得油99.4g，即为2-氯甲基噻吩。
2.2在1000ml的三口瓶中加入300ml无水乙醇，之后加入61g乙醇钠，充分搅拌至其全溶，全溶后加入195.3g乙酰氨基丙二酸二乙酯，并调节至40℃保温反应40分钟，之后缓慢加入99.4g的油，充分搅拌后加热回流反应5小时，反应好后加入4倍的冰水中，充分搅拌后抽滤，滤饼即为2-噻吩基丙二酸二乙酯。
2.3将2-噻吩基丙二酸二乙酯经过氢氧化钠皂化处理，并经过L-酰化酶的处理再加入fmoc-osu和的丙酮，并用碳酸钠水溶液调节体系pH值为8-9 反应，反应完成后处理好后得固体为fmoc-thi-oh（保存另用），母液低温保存。
2.4将所得母液约2L加入5L三口瓶中，之后加入1L的盐酸和甲醇的等比例混合液，并加热回流60h，TLC跟踪检测，并送NMR验证，至基本反应完成后，分批多次加入fmoc-osu的固体，并TLC跟踪监测反应进程，反应完成后抽滤，将体系用500ml的醋酸乙酯和石油醚的混合溶剂洗4次，之后用盐酸酸化体系pH值为1左右，并降温搅拌，产生褐色结晶48g。
通过MS、旋光、hplc对固体进行分析，即为N-芴甲氧羰基-β-(2-噻吩基)-D-丙氨酸，hplc：99.34%，旋光+30º、MS、NMR符合实际，见图1、2。
实施例3：
3.1在2000ml的三口瓶中加入800ml二氯甲烷，之后加入100g 2-噻吩甲醇，再加入103g吡啶，充分搅拌，降温至-5℃以下，滴加入206g氯化亚砜，在10℃下反应3小时，之后加入400ml冰水，用氢氧化钠调节体系pH值为7-8左右，分层后，二氯甲烷相再用4%质量百分浓度的氢氧化钠洗涤2次，水洗一次，饱和盐水洗涤一次，加入无水硫酸钠充分搅拌干燥，之后50℃浓缩至干得油94.9g，即为2-氯甲基噻吩。
3.2在1000ml的三口瓶中加入300ml无水乙醇，之后加入68g乙醇钠，充分搅拌至其全溶，全溶后加入155.3g乙酰氨基丙二酸二乙酯，并调节至40℃保温反应40分钟，之后缓慢加入94.9g的油，充分搅拌后加热回流反应6小时，反应好后加入4倍的冰水中，充分搅拌后抽滤，滤饼即为2-噻吩基丙二酸二乙酯。
3.3将2-噻吩基丙二酸二乙酯经过氢氧化钠皂化处理，并经过L-酰化酶的处理再加入fmoc-osu和的丙酮，并用碳酸钠水溶液调节体系pH值为8-9 反应，反应完成后处理好后得固体为fmoc-thi-oh（保存另用），母液低温保存。
3.4将所得母液约2L加入5L三口瓶中，之后加入2L的盐酸和甲醇的等比例混合液，并加热回流反应72小时，TLC跟踪检测，并送NMR验证，至基本反应完成后，分批多次加入fmoc-osu的固体，并TLC跟踪监测反应进程，反应完成后抽滤，将体系用500ml的醋酸乙酯和石油醚的混合溶剂洗4次，之后用盐酸酸化体系pH值为1左右，并降温搅拌，产生褐色结晶43g， 通过MS、旋光、hplc对固体进行分析，即为：N-芴甲氧羰基-β-(2-噻吩基)-D-丙氨酸，hplc：98.64%，旋光+30º、MS、NMR符合实际，见图1、2。
实施例4：
4.1在2000ml的三口瓶中加入800ml二氯甲烷，之后加入100g 2-噻吩甲醇，再加入103g吡啶，充分搅拌，降温至-5℃以下，滴加入389.9g三光气，在10℃下反应3小时，之后加入400ml冰水，用碳酸钠调节体系pH值为7-8左右，分层后，二氯甲烷相再用4%质量百分浓度的氢氧化钠洗涤2次，水洗一次，饱和盐水洗涤一次，加入无水硫酸钠充分搅拌干燥，之后50℃浓缩至干得油90.9g，即为2-氯甲基噻吩。
4.2在1000ml的三口瓶中加入300ml无水乙醇，之后加入46.9g乙醇钠，充分搅拌至其全溶，全溶后加入149.4g乙酰氨基丙二酸二乙酯，并调节至40℃保温反应40分钟，之后缓慢加入90.9g的油，充分搅拌后加热回流反应8小时，反应好后加入4倍的冰水中，充分搅拌后抽滤，滤饼即为2-噻吩基丙二酸二乙酯。
4.3将2-噻吩基丙二酸二乙酯经过氢氧化钠皂化处理，并经过L-酰化酶的处理再加入fmoc-osu和的丙酮，并用碳酸钠水溶液调节体系pH值为8-9 反应，反应完成后处理好后得固体为fmoc-thi-oh（保存另用），母液低温保存。
4.4将所得母液约2L加入5L三口瓶中，之后加入2L的盐酸和甲醇的等比例混合液，并加热回流反应72小时，TLC跟踪检测，并送NMR验证，至基本反应完成后，分批多次加入fmoc-osu的固体，并TLC跟踪监测反应进程，反应完成后抽滤，将体系用500ml的醋酸乙酯和石油醚的混合溶剂洗4次，之后用盐酸酸化体系pH值为1左右，并降温搅拌，产生褐色结晶38.5g， 通过MS、旋光、hplc对固体进行分析，即为：N-芴甲氧羰基-β-(2-噻吩基)-D-丙氨酸，hplc：97.64%，旋光+32º、MS、NMR符合实际，见图1、2。
实施例5：
5.1在2000ml的三口瓶中加入800ml二氯甲烷，之后加入100g 2-噻吩甲醇，再加入103g吡啶，充分搅拌，降温至-5℃以下，通入130.1g光气，在10℃下反应3小时，之后加入400ml冰水，用碳酸钠调节体系pH值为7-8左右，分层后，二氯甲烷相再用4%质量百分浓度的氢氧化钠洗涤2次，水洗一次，饱和盐水洗涤一次，加入无水硫酸钠充分搅拌干燥，之后50℃浓缩至干得油.84.3g，即为2-氯甲基噻吩。
5.2在1000ml的三口瓶中加入300ml无水乙醇，之后加入43.5g乙醇钠，充分搅拌至其全溶，全溶后加入207.9g乙酰氨基丙二酸二乙酯，并调节至40℃保温反应40分钟，之后缓慢加入84.3g的油，充分搅拌后加热回流反应6小时，反应好后加入4倍的冰水中，充分搅拌后抽滤，滤饼即为2-噻吩基丙二酸二乙酯。
5.3将2-噻吩基丙二酸二乙酯经过氢氧化钠皂化处理，并经过L-酰化酶的处理再加入fmoc-osu和的丙酮，并用碳酸钠水溶液调节体系pH值为8-9 反应，反应完成后处理好后得固体为fmoc-thi-oh（保存另用），母液低温保存。
5.4将所得母液约2L加入5L三口瓶中，之后加入2L的盐酸和甲醇的等比例混合液，并加热回流反应72小时，TLC跟踪检测，并送NMR验证，至基本反应完成后，分批多次加入fmoc-osu的固体，并TLC跟踪监测反应进程，反应完成后抽滤，将体系用500ml的醋酸乙酯和石油醚的混合溶剂洗4次，之后用盐酸酸化体系pH值为1左右，并降温搅拌，产生褐色结晶33g， 通过MS、旋光、hplc对固体进行分析，即为：N-芴甲氧羰基-β-(2-噻吩基)-D-丙氨酸，hplc：96.4%，旋光+31.3º、MS、NMR符合实际，见图1、2。
比较例
6.1在2000ml的三口瓶中加入800ml二氯甲烷，之后加入100g 2-噻吩甲醇，再加入103g吡啶，充分搅拌，降温至0℃以下，滴加入104g氯化亚砜，在0℃下反应5小时，之后加入400ml冰水，用氢氧化钠调节体系pH值为7-8左右，分层后，二氯甲烷相再用4%质量百分浓度的氢氧化钠洗涤2次，水洗一次，饱和盐水洗涤一次，加入无水硫酸钠充分搅拌干燥，之后50℃浓缩至干得油83.6g，即为2-氯甲基噻吩。
6.2在1000ml的三口瓶中加入300ml无水乙醇，之后加入43g乙醇钠，充分搅拌至其全溶，全溶后加入191.5g乙酰氨基丙二酸二乙酯，并调节至40℃保温反应40分钟，之后缓慢加入83.6g的油，充分搅拌后加热回流反应4小时，反应好后加入4倍的冰水中，充分搅拌后抽滤，滤饼即为2-噻吩基丙二酸二乙酯。
6.3将2-噻吩基丙二酸二乙酯经过氢氧化钠皂化处理，并经过D-酰化酶的处理再加入fmoc-osu和的丙酮，并用碳酸钠水溶液调节体系pH值为8-9 反应，反应完成后处理好后加盐酸酸化，剧烈搅拌得深褐色凝胶状残留物，浓缩除去水层，之后加醋酸乙酯溶解，再用酸水洗涤，水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩得白色固体，经MS、旋光、hplc、NMR对固体进行分析， hplc：98.84%，旋光+30.7º、MS、NMR符合实际，见图1、2，即为N-芴甲氧羰基-β-(2-噻吩基)-D-丙氨酸。比较例直接用非常昂贵的D-酰化酶的方法，这样可以直接得到h-d-thi-oh并最终得到其衍生物，看是步骤简单了点，但是ac-L-thi-oh还在母液里没有得到,（如果放弃母液就产生浪费），如果想要得到L-型的衍生物就必须要加L-酰化酶，这样若和实施例1-5比较，成本增加了很多。
本发明所使用的缩写或英文全称的含义如下：
h-l-thi-oh: 3-L-（2-噻吩基）丙氨酸
Fmoc-osu：芴甲氧羰基琥珀酰亚胺
Fmoc-thi-oh: N-芴甲氧羰基-3-L-(2-噻吩基)-丙氨酸
HPLC: 高效液相色谱
Socl2：氯化亚砜
NMR：核磁。