一种酶法高效合成苄氧羰基阿斯巴甜的工艺的制作方法【
技术领域：
】[0001]本发明设及基因工程和生物催化工程研究领域，具体设及一种酶法高效合成节氧幾基阿斯己甜的工艺。【
背景技术：
】[0002]近年来蛋白酶催化合成小分子化合物越来越受到人们的关注，其可进行小肤合成、糖辆合物、水凝胶分子自组装、转醋反应W及手性醇动力学拆分等，在医药中间体、化妆品、日用品、生物材料等领域具有广泛的应用前景。然而大多数耐有机溶剂蛋白酶的催化效率不是很高，所W，筛选出具有高催化效率的蛋白酶的对于蛋白酶在非水相或者水相催化在工业上的发展与应用具有突出的意义。[0003]阿斯己甜是由L型天冬氨酸和L型苯丙氨酸甲醋缩合而成的一种二肤甲醋化合物，是一种人工合成的甜味剂。阿斯己甜的甜味大约是庶糖的200倍，在甜味剂的添加方面具有很广的应用范围。Ma即usonBA等（CriticalReviewsinToxicological37(8);629-727)研究了阿斯己甜的药理学毒性，研究表明在目前的食品添加范围内阿斯己甜对人体是非常安全的。[0004]目前报道的阿斯己甜主要通过两种方法来合成，化学法、酶与化学法混合。在化学法的合成中具有很大的弊端，需要对天冬氨酸的氨基和0-駿基进行保护，并且还需要对a-駿基进行活化处理，反应的过程中伴随着少量的0位副产物W及由化学反应条件导致的少量消旋作用产生的D型副产物，由于D型阿斯己甜具有苦味，所W在后期还需要对副产物进行分离。在进行氨基酸保护和脱保护的过程中影响产物的总收率，整个过程步骤繁琐，污水排放严重。[0005]采用嗜热蛋白酶或者嗜热蛋白酶与化学法结合的方法生产阿斯己甜，能够利用0位未保护的节氧幾基天冬氨酸高产率的生产出不含0型副产物的a型阿斯己甜，并且没有消旋作用产生的D型产物。由于蛋白酶具有特殊的催化位点选择性，所W能生产出完全不含0型副产物的阿斯己甜。然而酶法该项技术也有很大的缺点，日本专利JP60118190在使用嗜热蛋白酶合成阿斯己甜的过程中，反应体系采用双相法高效的合成阿斯己甜前体，将反应生成的产物相转移至有机相。该一反应工艺在底物和产物在两相中的分配难W把握，而且转移至有机相中的产物的后分离复杂。在合成阿斯己甜前体(节氧幾基阿斯己甜）的过程中，底物对酶的抑制性明显，底物的浓度相对较低，合成效率较低。HiroyasuOgino等（"Enhancementoftheaspartameprecursorsyntheticactivityofanorganicsolvent-stableprotease"，ProteinEngineering,Design&Selectionvol.23no.3pp.147-152，2010)开发的耐有机溶剂蛋白酶PST-01在催化合成阿斯己甜前体时节氧幾基天冬氨酸（Cbz-Asp)的最佳浓度为30mM，苯丙氨酸甲醋（PheOMe)的最佳浓度为500mM，节氧幾基阿斯己甜（Cbz-AP^O的产率达到83%，此工艺反应体系中的节氧幾基天冬氨酸的浓度低，而且底物的摩尔比不经济，并且在反应体系中使用了百分之五十的DMS0,产物与底物均溶于溶液中导致繁杂的后分离等步骤，该工艺的制备成本高。[0006]美国专利US2012/0295294采用耐有机溶剂蛋白酶PT121合成阿斯己甜，该专利在合成阿斯己甜的过程中使用非保护天冬氨酸，两底物的摩尔比为1:20,但是其收率仅为30.8%，形成了底物的大量浪费，产物在有机相中分离难度大，经济价值低。[0007]有鉴于现有工艺的不足，特提出本发明。【
发明内容】[0008]本发明的第一目的在于提供一种酶法高效率合成节氧幾基阿斯己甜的工艺，采用自行筛选开发的来自于的耐有机溶剂蛋白酶WQ9-2或其突变体催化合成节氧幾基阿斯己甜（Cbz-AP^O的反应分离禪合工艺，能够很好地解决底物抑制性，底物的利用率及产物的后期分离等问题，合成效率高。[0009]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种酶法高效率合成节氧幾基阿斯己甜的工艺，具体W耐有机溶剂蛋白酶WQ9-2或其突变体催化节氧幾基天冬氨酸和苯丙氨酸甲醋或其盐酸盐酶法合成节氧幾基阿斯己甜。[0010]其中，所述耐有机溶剂蛋白酶WQ9-2的突变体为氨基酸序列具有95%W上同源性的突变体，突变发生包括一个或者多个氨基酸残基被替换或减少或增加。如WQ9-2-4F和WQ9-2-7K、WQ9-2-13D和WQ9-2-20C、WQ9-2-27H和WQ9-2-33G等。[0011]本发明所述的工艺，所述酶法合成的反应体系中抑值为4-8,优选抑值为6。[0012]其中，所述节氧幾基天冬氨酸和苯丙氨酸甲醋或其盐酸盐的反应摩尔比为1:10-1:1，优选1:3~1:6;所述耐有机溶剂蛋白酶WQ9-2及其突变体的用量为200-5000U/mU优选1000-2000U/mL。[0013]其中，更优选首次投料两底物(节氧幾基天冬氨酸：苯丙氨酸甲醋）的摩尔比为1:5,后续投料摩尔比为1:1，其过量底物的循环利用可达到首次投料摩尔比为1:5的同样的反应效率，多次循环后能够达到实际的底物比为1:1，避免了过量苯丙氨酸甲醋盐酸盐(苯丙氨酸甲醋）损失。[0014]本发明所述的工艺，节氧幾基天冬氨酸（Cbz-Asp)浓度为30-200mM为宜，反应效率较高的浓度为lOOmM，苯丙氨酸甲醋盐酸盐（PheOMe.肥1)或苯丙氨酸甲醋（PheOMe)浓度为150-600mM，较经济且反应效率较高的浓度为500mM。[0015]本发明所述的工艺，所述酶法合成在有机溶剂和/或水相中进行，所述有机溶剂选自己醇、DMS0、甲醇、DMF、己酸己醋或甘油中的一种，优选DMS0、己醇或者甲醇；当酶法合成在有机溶剂和水相的混合液中进行时，有机溶剂在混合液中的体积浓度（v/v)为0%-30%;优选0%-10%。[0016]本发明所述的工艺，所述酶法合成的反应温度为20-45°C，优选30°C。[0017]本发明所述的工艺，酶法合成的反应体系中加入O-lOmM的Ca"，优选5ml的Ca"。[0018]本发明所述的工艺，产物从反应体系中直接析出；优选析出后采用抽滤的方法分离产物，并将溶于反应液中过剩的原料用于循环在母液中再添加摩尔浓度比为1:1的原料，即可实现批次节氧幾基阿斯己甜的合成。[0019]本发明所述的工艺，合成后的节氧幾基阿斯己甜采用pH9~10的水溶液溶解，然后用稀盐酸调节体系的抑5.5~5.0,或者采用抑5.5~5.0的水溶液洗漆，进一步纯化生成的产物，真空干燥即得纯度为99%W上的节氧幾基阿斯己甜。[0020]本发明的有益效果在于使用来自于公cer併wWQ9-2(CCTCCNO;2010010)的耐有机溶剂蛋白酶WQ9-2或其95%同源性突变体高效催化节氧幾基保护的天冬氨酸和苯丙氨酸甲醋合成阿斯己甜前体节氧幾基保护的阿斯己甜（Cbz-APM)。并对其各个条件进行了优化，并筛选出了较适合于使用酶法生产节氧幾基阿斯己甜生产的条件。【附图说明】[0021]图1为耐有机洛剂蛋白酶重组体蛋白电泳图；图2为阿斯己甜合成反应路线示意图；图3为耐有机溶剂蛋白酶WQ9-2重组体或其突变体催化合成产物阿斯己甜前体节氧幾基阿斯己甜的HPLC图谱；图4为节氧幾基阿斯己甜（Cbz-AP^O标准品的质谱图，由上海吉尔生化试剂有限公司提供，纯度为99.8%;图5为本发明节氧幾基阿斯己甜（Cbz-AP^O实验产物的质谱图。【具体实施方式】[0022]W下结合【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明：本发明采用化学和生物相结合的方法合成阿斯己甜，采用领域内大家公知的化学法从天冬氨酸和苯丙氨酸出发合成节氧幾基天冬氨酸和苯丙氨酸甲醋或其盐酸盐，在酶催化的过程中采用节氧幾基天冬氨酸和苯丙氨酸甲醋或其盐酸盐在有机溶剂或者非有机溶剂中酶法催化合成节氧幾基保护的阿斯己甜（Cbz-APM)，由于实现了反应分离禪合，反应效率高，过剩原料存在于溶液中可循环使用，高纯度产物从体系中析出产品单一，无副产物。[0023]本发明所述的耐有机溶剂蛋白酶WQ9-2来自于公化?cere化?，并且该耐有机溶剂蛋白酶WQ9-2已经公开在同一发明人的在先授权专利(授权公告号；CN102021125B)，利用克隆表达技术，对其进行重组表达。[0024]本发明可利用公?所产耐有机溶剂蛋白酶WQ9-2、或者蛋白酶WQ9-2突变体基因的克隆表达产物，蛋白酶WQ9-2具有SEQIDNO;1所示的核巧酸序列，其氨基酸序列示于SEQIDNO;2。该耐有机溶剂蛋白酶WQ9-2基因全长1701个核巧酸，编码567个氨基酸，其中成熟肤为317个氨基酸。该基因与公寸如叹来源的嗜热蛋白酶基因（Accessionnumber720316A)同源性为69.6%，其中成熟肤部分氨基酸序列同源性为72%。上述序列表见授权公告号；CN102021125B的中国专利，本发明在此不再寶述。[00巧]此外，本发明还设及到耐有机溶剂蛋白酶WQ9-2突变体的应用，利用PCR技术对耐有机溶剂蛋白酶WQ9-2的部分氨基酸进行突变，获得具有催化活性的蛋白酶突变体，突变方法包含一个或者多个氨基酸残基的替换、删除和添加。根据本领域人员的公知常识可知，具有与SEQIDNO;2表示的氨基酸序列具有95%W上同源性的氨基酸序列及其突变体，应当视为与本发明保护的耐有机溶剂蛋白酶WQ9-2等同的同种功能的蛋白酶。[0026]本发明将上述突变后的蛋白酶WQ9-2进行了酶学性质的研究，发现同原有未突变的蛋白酶WQ9-2的酶学性质基本一致。检测其催化合成节氧幾基阿斯己甜（Cbz-APM)的能力，发现突变后的耐有机溶剂蛋白酶WQ9-2在催化合成节氧幾基阿斯己甜时，在相同的条件下，依然可W达到同未突变蛋白酶WQ9-2相近的合成能力。[0027]使用本发明所述的蜡样芽抱杆菌WQ9-2所产的耐有机溶剂蛋白酶WQ9-2及突变体，在枯草杆菌或大肠杆菌及酵母重组表达酶能高效催化合成节氧幾基阿斯己甜，降低了在生产阿斯己甜的过程中生物催化剂的成本，实现了底物与反应体系的分离，并通过母液的循环实现了底物的全利用，为酶法工业化生产阿斯己甜提供了高效的酶源，为实现绿色生产阿斯己甜提供了关键性的技术与催化剂。[0028]本发明使用所述的耐有机溶剂蛋白酶WQ9-2或当前第1页1 2