以维生素E为核心的重组高密度脂蛋白的制备的制作方法

本发明涉及以维生素E为核心的重组高密度脂蛋白的制备，特别是涉及以维生素E为核心的重组高密度脂蛋白调节血脂代谢的功能，及其在生产用于预防和治疗血脂代谢异常性疾病的药物中的应用。以维生素E为核心的重组高密度脂蛋白的主要特征是蛋白组分包括使用甲基营养酵母生产的重组人载脂蛋白A-I、重组人载脂蛋白E两种载脂蛋白；并以维生素E代替天然高密度脂蛋白中的胆固醇酯，作为以维生素E为核心的重组高密度脂蛋白的核心部分，使其具有更强的抗氧化活性。

背景技术：

动脉粥样硬化(As)是危害人类健康的重要疾病之一，其病理损害可累及全身各个器官，已经成为多种中老年常见疾病的基础病变。流行病学调查显示，血浆高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)水平与As等心血管疾病的危险性呈高度负相关，并不依赖于血浆低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)、其他的脂类参数(三酰甘油、总胆固醇)和非脂类危险因素。在调整了其他冠心病危险因素后，HDL-C水平每增加1mg/dL，冠心病危险性就减少2％～3％(Petraki MP,Mantani PT,Tselepis AD.Recent Advances on the Antiatherogenic Effects of HDL-Derived Proteins and Mimetic Peptides[J].Curr Pharm Des,2009,15(27):3146-3166.)。HDL的心血管保护作用主要体现在逆胆固醇转运(RCT)及抗炎、抗氧化功能，升高HDL己经成为针对As的一种疗效较为肯定的治疗方法(车兆义,宋清斌,张继文,等.大鼠动脉硬化闭塞模型两种构建方法的比较[J].中国组织工程研究与临床康复,2008,12(50):9841-9844.)。

目前国内外学者在升高血浆HDL-C水平方面进行了相关研究：烟酸可显著升高HDL-C水平，但因其存在主要的副作用(导致病人皮肤潮红)而使应用受限(BenyóZ,Gille A,Kero J,et al.GPr109A(PUMA-G/HM74A)mediates nicotinic acid-induced flushing[J].J Clin Invest,2005,115(12):3634–3640.)；Clark等的研究表明胆固醇酯转移蛋白(CETP)抑制剂可升高血浆HDL-C水平，但随后对CETP抑制剂——torcetrapib进行的大型临床试验却因其靶点外作用(使治疗组与安慰剂组相比死亡率升高)而被迫中止(Barter PJ,Caulfield M,Eriksson M,et al.Effects of torcetrapib in patients at high risk forcoronary events[J].N Engl J Med,2007,357(21):2109–2122.)；虽然卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)激活剂、肝X受体(LXRs)激活剂、过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)激活剂等有望为提高HDL-C水平作出贡献，但其是否具有防治As的功效尚未有报道(Santos-Gallego CG,Ibanez B,Badimon JJ.HDL-cholesterol:Is it really good？Differences between apoA-I and HDL[J].Biochem Pharmacol,2008,76(4):443-452.)。

以上资料显示，血清HDL-C水平并不能直接反映HDL的整体功能，那么如何升高HDL-C水平才能起到防治As的作用呢？

最近的研究显示，HDL亚类的组成和颗粒大小的异常与As、冠心病具有良好的相关性，是As及冠心病的独立危险因素。高脂血症作为As、冠心病的一个重要危险因素，患者除血脂异常外，其血清中HDL亚类组成也会发生一定变化：小颗粒的preβ-HDL及HDL₃含量显著增加，而大颗粒的HDL₂含量显著减少，表明患者HDL颗粒有变小趋势，HDL成熟代谢过程受阻(Miida T，Yamaguchi T，Tsuda T，et al.High prebeta1-HDL levels in hypercholesterolemia are maintained by probucol but reduced by a low-cholesterol diet[J].Atherosclerosis，1998，138(1)：129-134.)。因此，各种亚组分间比例的失调，可引起HDL功能的改变，导致其抗氧化、抗炎、抗凝血功能减弱，促进氧化应激。

由此可见，单纯的升高血浆HDL-C水平而不纠正HDL亚类比例及功能的异常，不一定能有效防治As，将HDL-C作为调节血脂代谢、防治As的靶点，要从增强HDL的功能入手。因此，本发明选用维生素E替代HDL核心部分的胆固醇酯(增强rhHDL抗氧化作用)，合成含有载脂蛋白A-I(ApoA-I)、载脂蛋白E(ApoE)的新型的以维生素E为核心的重组高密度脂蛋白(rhHDL)纳米颗粒。rhHDL颗粒包含两种主要的载脂蛋白成分——载脂蛋白A-I(ApoA-I)和载脂蛋白E(ApoE)。ApoA-I是天然HDL抗氧化活性的主要成份，可以通过清除低密度脂蛋白(LDL)、动脉壁细胞或两者中氧化的磷脂，抑制或延迟LDL氧化。ApoE的脂质转运功能和显著的抗氧化活性使其具有明确的抗动脉硬化活性。此外，ApoE作为受体识别标志能与低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)特异性结合，ApoE运载循环中的脂蛋白残体，与LRP结合后可以介导脂蛋白残体的清除。大量的研究已证实，人早期及进展型As斑块中平滑肌细胞、巨噬细胞均有LRP的高表达(Lupu F,Heim D,Bachmann F,Kruithof EK.Expression of LDL receptor-related protein/alpha 2-macroglobulin receptor in human normal and atherosclerotic arteries.rioscler Thromb,1994,14(9):1438-1444.)。新型rhHDL颗粒治疗As的创新之处就在于，通过rhApoE与患者As组织中高表达的LRP结合，实现rhHDL的靶向作用；ApoE-LRP特异性结合后，rhHDL颗粒的成分(ApoA-I、ApoE和维生素E)释放于血管局部，调节血脂转运及抵抗氧化应激作用双管齐下，从而减轻As患者血管损伤。

技术实现要素：

本发明涉及以维生素E为核心的重组高密度脂蛋白(rhHDL)，特别是涉及rhHDL调整血脂代谢异常、防治As的功能，及其在生产用于预防和治疗血脂代谢异常诱发相关疾病的药物中的应用。

本发明的一个目的是提供一种以维生素E为核心的重组高密度脂蛋白(rhHDL)的制备方法，特征在于它的蛋白组分包括使用甲基营养酵母生产的重组人载脂蛋白A-I和重组人载脂蛋白E两种载脂蛋白和维生素E。利用胆酸钠法制备rhHDL(Kato H，Nakano ST，Arai H，et al.Purification,micoheterogeneity，and stability of human lipid transfer protein[J].J Biol Chem，1989，264(7)：4082-4087.)，可得到稳定、大小适宜的颗粒。胆酸钠可促进载脂蛋白进入卵磷脂的酰基链。天然HDL载脂蛋白亲脂基团结合胆固醇酯，亲水基因暴露在表面突入周围水相，从而使HDL颗粒能稳定地分散在水相中；为提高rhHDL的抗氧化活性，我们利用脂溶性的维生素E为核心合成rhHDL，即利用脂溶性维生素E替代HDL核心部分的脂溶性胆固醇酯。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的重组人载脂蛋白A-I是使用甲基营养酵母生产的。该方法包括在以甲醇为碳源和能源的培养基中培养甲基营养酵母,其中所说的甲基营养酵母是用包括下列可操作连接的元件的DNA构建体转化的：(1)甲基可诱导的转录启动子；(2)编码载脂蛋白A-I的DNA片段；(3)转录终止子和(4)可选择标志，从而重组表达产生人载脂蛋白A-I。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的重组人载脂蛋白E是使用甲基营养酵母生产的。该方法包括在以甲醇为碳源和能源的培养基中培养甲基营养酵母,其中所说的甲基营养酵母是用包括下列可操作连接的元件的DNA构建体转化的：(1)甲基可诱导的转录启动子；(2)编码载脂蛋白E的DNA片段；(3)转录终止子和(4)可选择标志，从而重组表达人载脂蛋白E。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的甲基营养酵母是巴斯德毕赤酵母，并且所说的甲基可诱导的启动子和转录终止子均来自巴斯德毕赤酵母AOX1基因。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的以维生素E为核心的重组高密度脂蛋白是用胆酸钠法制备的。

本发明的另一个目的是提供一种新的以维生素E为核心的重组高密度脂蛋白(rhHDL)，其主要成分具有天然高密度脂蛋白不具有的维生素E，从而提高rhHDL的抗氧化活性。

血脂异常是促成动脉粥样硬化的重要致病因素，也可以是糖尿病、肾脏疾病、甲状腺功能减低的表现。为了深入研究rhHDL对血脂代谢的调节作用，我们在细胞水平研究了rhHDL对巨噬细胞氧化应激的调控作用；观察了rhHDL对活体动物(小鼠)动脉粥样硬化动物模型血清中总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)水平，同时对各实验组动物的主动脉进行了病理学观察。在使用小鼠巨噬细胞完成的细胞水平研究中发现，rhHDL可降低氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)引起的巨噬细胞泡沫化和巨噬细胞凋亡，降低氧化应激，从而起到保护病变部位巨噬细胞的作用(详见实施例2)。在使用动脉粥样硬化动物模型完成的试验研究中发现，rhHDL治疗的实验组动物血清TC、TG和LDL-C明显降低，HDL-C升高，且与模型对照组有显著性差异。说明rhHDL可通过调节血浆中HDL水平、提高机体抗氧化能力，预防As的发生及发展。另外，通过病理组织学检查结果可见，rhHDL治疗组主动脉的动脉粥样硬化程度有所减轻，且有随剂量的增大而作用效果更明显的趋势。由此可见，rhHDL对动脉粥样硬化具有治疗作用(详见实施例3)。

本发明的研究结果表明，rhHDL可减低巨噬细胞氧化应激，有效地调节血脂代谢和改善主动脉的动脉粥样硬化斑块形成，从而起到治疗动脉粥样硬化等血脂异常性疾病的作用。进而可以初步认定，rhHDL有可能作为一种新的调节血脂的药物，用于治疗血脂异常性疾病。

因此，本发明的一个目的是提供以维生素E为核心的重组高密度脂蛋白在生产用于预防和治疗血脂代谢异常性疾病的药物中的应用。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的血脂代谢异常性疾病选自高脂血症和动脉粥样硬化。

附图说明

图1以维生素E为核心的重组高密度脂蛋白(rhHDL)颗粒合成原理图。

图2显示透射电镜下观察以维生素E为核心的重组高密度脂蛋白(rhHDL)的形态(放大10000倍的电镜观察)。

图3显示以维生素E为核心的重组高密度脂蛋白(rhHDL)对巨噬细胞内脂肪堆积的影响(油红O染色，所有标本均使用放大200倍的普通光学显微镜观察)。其中3a为空白对照组；3b为模型对照组；3c为小剂量rhHDL组(25mg/L)；3d为中剂量rhHDL组(50mg/L)；3e为中剂量rhHDL组(100mg/L)。

图4显示以维生素E为核心的重组高密度脂蛋白(rhHDL)对动脉粥样硬化小鼠主动脉病理组织学改变的影响(所有组织切片均使用放大100倍的普通光学显微镜观察)。其中4a为空白对照组；4b为模型对照组；4c为小剂量rhHDL组(10mg/kg)；4d为大剂量rhHDL组(20mg/kg)。

具体实施方式

以下借助实施例描述本发明的最佳实施方式。这些实施例旨在进一步举例阐明本发明，而不是以任何方式限制本发明待批权利要求的范围。

实施例1：以维生素E为核心的高密度脂蛋白(rhHDL)的制备

a.取卵磷脂4mg，维生素E10mg，溶于0.5ml无水乙醇。用皮试注射器吸入后快速注入12.1ml PBS中，N₂下搅拌15min；

b.5.4mg胆酸钠溶于0.5ml PBS；取10mg rhApoA-I和5mg rhApoE溶于0.8ml PBS中。在搅拌下加入上述液体中；

c.室温放置30min；移至4℃孵育12h，各组分聚合形成rhHDL；

d.将液体加入孔径为10kD的蛋白透析袋中，4℃对透析液(PBS)充分透析，去除胆酸钠。rhHDL合成的主要原理及步骤见附图1。

e.rhHDL的透射电镜观察(见附图2)。

透射电镜结果显示，通过胆酸钠法处理，维生素E、各种载脂蛋白成分、卵磷脂、胆固醇等成功聚合为球形的rhHDL。该复合物在透射电镜下较为均匀圆整，粒径为150nm～200nm(见附图2)。利用胆酸钠法制备rhHDL，可得到稳定、大小适宜的颗粒。胆酸可促进载脂蛋白进入卵磷脂的酰基链，当胆酸钠与卵磷脂的比例在1/2～2/1范围内，可产生稳定的rhHDL。

实施例2：rhHDL对巨噬细胞氧化应激的调控作用

1)不同剂量rhHDL对巨噬细胞泡沫化的影响：

巨噬细胞Raw264.7分为对照组与实验组，其中对照组分别设空白对照组(RPMI-1640)、模型对照组，实验组细胞首先与80mg/L ox-LDL共孵育24h，再加入不同浓度(25mg/L，50mg/L，100mg/L)的rhHDL干预24h；模型对照组细胞首先与80mg/L ox-LDL共孵育24h，再更换RPMI-1640培养液培养24h；以RPMI-1640培养的巨噬细胞作为空白对照。采用胆固醇酯测定酶法测定细胞内总胆固醇(TC)、游离胆固醇(FC)及胆固醇酯(CE)，同时测定细胞内的蛋白含量(Pro)，确定rhHDL降低细胞内TC/Pro比值的最佳浓度。通过油红O染色，观察rhHDL对巨噬细胞内脂质堆积的影响。

结果显示，rhHDL可以显著降低泡沫细胞中TC和CE含量，降低CE/TC比值，作用效果随rhHDL浓度升高而增强(表1)。

表1不同剂量rhHDL对巨噬细胞泡沫化的影响

与正常对照组比较，***P<0.001；与模型对照组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01

油红O染色结果显示，与对照组相比，模型组细胞内有大量的红色脂滴颗粒存在，不同浓度的rhHDL(25、50、100mg/L)作用后，脂质堆积情况减轻，以100mg/L组作用最为明显(附图3)。

2)不同作用时间下rhHDL对巨噬细胞泡沫化的影响

巨噬细胞Raw264.7首先与80mg/L ox-LDL共孵育24h，再加入100mg/L的rhHDL共孵育不同时间(即0h、6h、12h、24h)检测细胞内总胆固醇(TC)、游离胆固醇(FC)及胆固醇酯(CE)，同时测定测定细胞内的蛋白含量(Pro)，确定rhHDL降低细胞内TC/Pro比值的最佳时间。结果显示，rhHDL可介导细胞内胆固醇外流，且作用效果具随着作用时间延长而增强(表2)。

细胞内胆固醇流出率(％)＝(对照组TC-rhHDL组TC)/对照组TC×100％

表2 rhHDL不同作用时间对巨噬细胞泡沫化的影响

3)rhHDL对ox-LDL所诱导巨噬细胞氧化应激的影响

超氧化物歧化酶(SOD)是生物体内一种重要的抗氧化酶，能够催化超氧化阴离子发生歧化作用，生成过氧化氢和氧气。生物体内SOD的含量和活性反映了该生物体的抗氧化能力。巨噬细胞发生氧化应激时会发生脂质氧化反应。脂肪酸被氧化后逐渐分解为一系列的复杂化合物，丙二醛(MDA)就是众多产物之一。因此，巨噬细胞中MDA的含量表明巨噬细胞的氧化应激的强度。rhHDL能够有效的提升巨噬细胞内SOD的含量，降低MDA的含量，显著的抑制ox-LDL诱导巨噬细胞产生的氧化应激反应(见表3)。

表3不同剂量rhHDL对巨噬细胞SOD和MDA的影响

与正常对照组比较，**P<0.01,***P<0.001；与模型对照组比较，^▲▲P<0.01,^▲▲▲P<0.001

实施例3：rhHDL对ApoE基因敲除(ApoE^-/-)小鼠动脉粥样硬化的影响

1)ApoE^-/-小鼠动脉粥样硬化模型的复制

8～10周龄健康雄性ApoE基因敲除(APOE^-/-)小鼠30只，按体重随机分成3组，每组10只。分别为模型对照组、rhHDL小、大剂量组，均给予高脂饲料。同时选取相同遗传背景的同龄正常C57BL/6J雄性小鼠为正常对照组，给予普通饲料。按照表4尾静脉给药，每周2次，共8周。高脂饲料配方为21％猪油、0.15％胆固醇。

表4动物分组、给药方法

2)血脂检测

动物处死前禁食12h，1％戊巴比妥钠经腹腔注射麻醉小鼠，眼球摘除法获得血液标本，分离血清。按照试剂盒说明书测定血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、HDL-C、LDL-C。结果显示，给予高脂饮食后ApoE^-/-小鼠血清TC、TG、LDL-C均显著升高，HDL-C水平下降。给予rhHDL治疗后清TC、TG、LDL-C均显著降低，HDL-C水平上升。

表5 rhHDL对ApoE^-/-小鼠血脂代谢的影响

与正常对照组比较，**P<0.01,***P<0.001；与模型对照组比较，^▲▲P<0.01,^▲▲▲P<0.001

3)主动脉斑块的病理检查

小鼠处死后从左心室灌流PBS，自主动脉根部至腹主动脉末端离断整个主动脉。首先将主动脉近心端1cm切下，置10％甲醛溶液中固定，制备石蜡切片用于HE染色观察斑块面积。

对各组小鼠主动脉进行病理观察，结果如下：正常对照组血管壁光滑，结构正常，中膜主要由平滑肌组成，外膜主要由结缔组织组成；模型对照组有附壁斑块形成，斑块由胆固醇结晶和泡沫细胞形成；rhHDL小剂量组和大剂量组均可减轻主动脉斑块的形成(见附图4)。