一组用于羊源性的实时荧光PCR检测的特异性引物和探针的制作方法

文档序号:12412792阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一组用于羊源性的实时荧光PCR检测的特异性引物和探针,其特征在于:所述特异性引物和探针的核苷酸序列为(1)或(2)中的一种:

(1)、上游引物:5'- TTTGCGACAATAGCCACAGC -3'

下游引物:5'- ATCGGGTGAGGGTAGCTTTGT -3'

探针:5'- TCATTCTGAGGAGCAACAGTTATTACCAA -3'

所述引物和探针扩增的目标核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.3;

(2)、与(1)所述序列互补的序列。

2.根据权利要求1所述的引物和探针,其特征在于:所述探针的5’端荧光报告基团是FAM,3’端标记的是荧光淬灭基团TAMRA。

3.羊源性的PCR检测试剂盒,所述试剂盒为羊源性的定性或定量检测试剂盒;其特征在于:所述试剂盒包括权利要求1所述的引物和探针;

作为优选,所述定量检测试剂盒还包括标准品,所述标准品的制备方法为:将羊源性保守基因片段插入到载体pMD18-T中,转化至大肠杆菌中进行诱导表达,获得含有羊源性保守基因片段的重组质粒,以此作为标准品;所述羊源性保守基因片段为序列表中SEQ ID No.2;

作为进一步优选,所述羊源性保守基因片段是以序列表中SEQ ID No.1的核苷酸序列为模板,使用下述引物进行PCR扩增获得的:

上游引物:5'- CTAGAAACATGAAACATCGGAGTA -3'

下游引物:5'- AATGGTGTAATAAGGGTGGAA -3';

作为优选,所述PCR扩增的条件为:94℃预变性5min;94℃ 30s、55℃ 30s、72℃30s,35个循环;72℃ 10min。

4.权利要求1或2所述的特异性引物和探针在制备定性或定量检测羊源性的试剂盒中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于:所述应用是分别以标准品和待测样品DNA为模板,利用特异性引物和探针进行实时荧光定量PCR,通过标准曲线和待测样品的Ct值判定结果。

6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于:所述实时荧光定量PCR的反应条件为:94℃ 预变性2分钟,94℃ 15秒、60℃ 40s并收集荧光信号,40个循环。

7.羊源性的实时荧光定量PCR检测方法,所述检测方法不以有生命的人体或动物体为直接实施对象,其特征在于:步骤如下:

(1)制备标准品:将羊源性保守基因片段插入到载体pMD18-T中,转化至大肠杆菌中进行诱导表达,获得含有羊源性保守基因片段的重组质粒,以此作为标准品;所述羊源性保守基因片段为序列表中SEQ ID No.2;

(2)使用权利要求1所述的特异性引物和探针对待测样品和标准品采用相同的反应体系进行实时荧光PCR扩增;

(3)标准曲线绘制;

(4)通过标准曲线和待测样品的Ct值进行羊源性的快速定量检测。

8.根据权利要求7所述的检测方法,其特征在于:步骤(1)中所述羊源性保守基因片段是通过以下引物扩增得到的:

上游引物为5'- CTAGAAACATGAAACATCGGAGTA -3';

下游引物为5'- AATGGTGTAATAAGGGTGGAA -3';

作为优选,PCR扩增所述羊源性保守基因片段的条件为:94℃预变性5min;94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 30s,35个循环;72℃ 10min;

作为优选,步骤(2)中所述引物和探针的用量均为1.6μl;

作为优选,步骤(2)中所述实时荧光PCR扩增的反应条件为:94℃ 预变性2分钟,94℃ 15秒、60℃ 40s并收集荧光信号,40个循环。

9.羊源性的定性PCR检测方法,所述检测方法不以有生命的人体或动物体为直接实施对象,其特征在于:步骤如下:

(1)使用权利要求1所述的特异性引物和探针对待测样品进行实时荧光PCR扩增;

(2)通过待测样品的Ct值对羊源性进行定性检测:当Ct值小于38时,为阳性;否则,为阴性;

作为优选,步骤(1)中所述引物和探针的用量均为1.6μl;

作为优选,步骤(1)中所述实时荧光PCR扩增的反应条件为:94℃ 预变性2分钟,94℃ 15秒、60℃ 40s并收集荧光信号,40个循环。

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