食源性溶血链球菌毒力基因cps2J的PCR检测引物及其试剂盒的制作方法

本发明属于溶血链球菌检测技术领域，尤其涉及一种食源性溶血链球菌毒力基因cps2J的PCR检测引物及其试剂盒。

背景技术：

动物源性食品的安全问题已成为大众关注的热点，而致病性病原菌引起的食源性疾病已是人们身边的“潜在杀手”。2005年7月中国四川资阳、内江等地发生重大公共卫生事件，有208人患链球菌病，死亡38例，涉及11个市，34个县，127个乡，197个村(镇、街道办事处)，2005年5～7月份，香港链球菌患者达11例，死1例。2014年4月在国际食品安全大会上，专家们表示全球最大的食品安全问题是食源性疾病问题。引起食源性疾病的如沙门氏菌、大肠埃希氏菌、霍乱弧菌、致病性链球菌等多种病原菌，其中链球菌广泛分布于自然界中，污染食品的机会较大，依据其在血琼脂平板的溶血作用可分为α、β、

型链球菌，引起食物中毒多数为α型溶血链球菌中的粪链球菌，而β型溶血链球菌的致病力比较强，常引起人和多种动物各种疾病，其中猪链球菌2型属于α型溶血链球菌是近年来国内外报道最多的一种猪链球菌病病原，也是世界范围内引致猪链球菌病最主要的病原，对猪的致病性最强。猪链球菌病作为人畜共患病病原，不仅能感染猪，还可以通过食品，尤其是肉类产品等途径感染人，引发食源性疾病的发生。近年来国内外多次发生人感染猪链球菌2型疫情，使之成为一个重要的公共安全卫生问题。各种链球菌菌株之间的致病力存在明显差异可能与所携带的毒力基因有很大的关系，其毒力因子主要包括荚膜多糖(cps2J)，溶菌酶释放蛋白(mrp)，胞外因子(ef)，溶血素(slf)等，其中致病力较强的为cps2J。而猪链球菌2型cps全长15401bp，共有cps 2Z、cps 2Y、cps 2X、cps 2A、cps 2B、cps 2C、cps 2D、cps 2E、cps 2F、cps 2G、cps 2H、cps 2I、cps 2J和cps 2K等14个开放阅读框架，其中cps 2J常用于PCR技术鉴别诊断猪链球菌2型的靶基因。cps2J多存在细菌的细胞壁上，主要成份是葡萄糖、N-乙酰葡萄糖胺、鼠李糖和唾液酸等，该毒力因子可使该菌株抵抗巨噬细胞的吞噬，在猪链球菌2型的致病过程中扮演着重要的作用。

致病病原菌的常规检测方法是通过对细菌的表型特征和生化指标进行鉴定，其中鉴定溶血链球菌的生化指标主要包括革兰氏染色、氧化酶实验、过氧化氧酶实验、CAMP实验、V-P反应(福格斯-普利斯考尔)产物实验、凝集实验、ELISA实验、Lancefield氏群特异性抗原群鉴定等，这些方法存在耗时费力、灵敏度不高、特异性差的特点。目前，有一些自动快速细菌鉴定系统用于链球菌鉴定，如RAPID Strep strip、API rapid strep 32、API 20E Vitek系统、ATB快速检测系统等，但细菌自动鉴定仪器检测海豚链球菌的结果不稳定，且由于细菌自动化鉴定的数据库中模版菌株数量有限，链球菌的关键数据尚在研究中，因此该方法的应用也受到限制。近年来，分子生物学技术的发展为链球菌检测的新途径提供了可能，特别是免疫学技术、分子生物学技术以及生物学传感器技术在生活中应用的越来越多。这类检测技术大多具有简便、快速、特异、敏感等优点。聚合酶链反应技术(PCR)是分子生物学方法中应用比较广泛的检测技术，具有敏感性高、特异性强、重复性好、易自动化操作，可及时提供快速、准确的病原学诊断。不仅可以检测出样品中的病原菌，还可以区分病原菌的血清型。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种快速、准确、灵敏并可实时定量的食源性溶血链球菌毒力基因cps2J的PCR检测引物及其试剂盒，为基层开展该病的临床监测提供条件，以简便、快捷、准确地检出。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

食源性溶血链球菌毒力基因cps2J的PCR检测引物，包括上游引物cps2J-Fi和下游引物cps2J-Ri，它们具有以下碱基序列：

上游引物cps2J-Fi：5’-TGATACCAAAGCAAGTTACG-3’，

下游引物cps2J-Ri：5’-CTACCCTCATTCACCAGAAG-3’。

上述PCR检测引物在PCR扩增溶血链球菌毒力基因cps2J方面的应用。

PCR扩增的反应程序为：95℃3min；随后进行35个循环，每个循环包括95℃30s，56℃30s，72℃90s；最后72℃延伸10min。

食源性溶血链球菌毒力基因cps2J的PCR检测试剂盒，该试剂盒包含A液、B液、C液和PCR反应管；

A液为PCR反应液，含2×Taq MasterMix(Dye)、上游引物cps2J-Fi和下游引物cps2J-Ri和去离子水；

B液为含溶血链球菌毒力基因cps2J的DNA，作为阳性对照；

C液为去离子水，作为阴性对照；

上游引物cps2J-Fi和下游引物cps2J-Ri具有以下碱基序列：

上游引物cps2J-Fi：5’-TGATACCAAAGCAAGTTACG-3’，

下游引物cps2J-Ri：5’-CTACCCTCATTCACCAGAAG-3’。

上述PCR检测试剂盒在PCR扩增溶血链球菌毒力基因cps2J方面的应用。

PCR扩增的反应程序为：95℃3min；随后进行35个循环，每个循环包括95℃30s，56℃30s，72℃90s；最后72℃延伸10min。

针对现有食源性溶血链球菌检测存在的问题，发明人以猪链球菌2型的主要毒力基因cps 2J研究对象结合PCR检测技术，设计了食源性溶血链球菌毒力基因cps2J的PCR检测引物，包括上游引物cps2J-Fi和下游引物cps2J-Ri，扩增产物1152bp。据此，发明人还组装了相应检测试剂盒并建立了相应检测方法。特异性检测和敏感性检测证实，本发明提供的PCR检测方法特异性强，能够快速准确从多种不同的肠道细菌中检测出携带毒力基因cps2J的食源性溶血链球菌；且该法灵敏度高，能够检测出3.2×10^-1ng/ml。由于试剂盒中各试剂组分经过多次试验确定，反应过程中重复性好，这不仅大大缩减了检测过程中的时间以及成本，而且为临床大批量快速、简便地检测中提供了新的技术手段。

相对于现有技术，本发明的突出优点具体在于：

1)特异性强

本发明的PCR反应试剂盒能特异性检测出携带毒力基因cps2J的食源性溶血链球菌，所检测的阴性对照细菌和水对照均无阳性结果出来。

2)灵敏度高

本发明的PCR检测方法旨在检测食源性溶血链球菌，最低检测限约为3.2×10^-1ng/ml，具有很高的灵敏度。

3)简便快捷，易操作；

相较于常规检测技术，该PCR反应在反应结束后，采用琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像来判定结果，并且该方法中的细菌DNA提取技术采用的是煮沸法，仅需要简单的加热装置30min内就能提取样品DNA，整个过程在3小时左右就能得出结果。

附图说明

图1是cps2J基因的PCR退火温度优化的PCR电泳图，图中：M是Marker 1，1-6分别对应退火温度52℃、54℃、56℃、58℃、60℃和62℃。

图2是cps2J基因的PCR特异性试验的PCR电泳图，图中：M是Marker 1，1-11分别对应大肠杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌、副溶血性弧菌、藤黄微球菌、非01霍乱弧菌、粪球杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、链球菌和携带毒力基因cps2J的溶血链球菌，12泳道为阴性对照组，13是Marker。

图3是cps2J基因的PCR敏感性试验的PCR电泳图，图中：M是Marker 1，1是3.2×10³ng/ml，2是3.2×10²ng/ml，3是3.2×10¹ng/ml，4是3.2×10⁰ng/ml，5是3.2×10^-1ng/ml，6是3.2×10^-2ng/ml。

图4是检测cps2J基因的本发明PCR试剂盒保存期试验结果，图中：M是Marker1，1-10泳道为阳性样品，11泳道为阴性组。

具体实施方式

1材料与方法

1.1菌株

非01霍乱弧菌、副溶血性弧菌、大肠杆菌0157：H7、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、链球菌均采购自广东环凯微生物科技有限公司。

绿脓杆菌、变形杆菌、粪球杆菌、藤黄微球菌为广西大学药理实验室提供。

猪链球菌标准菌株是由南京农业大学赠送的HA9801.菌株。

1.2主要仪器和试剂

美国Bio-rad公司PCR仪，美国Bio-rad公司凝胶成像系统，美国Bio-rad公司超微量紫外分光光度计。PCR试剂、DNA Marker 1购自康为世纪生物科技有限公司；细菌培养基购自北京陆桥技术责任有限公司。

1.3引物设计与合成

根据GenBank收录的溶血链球菌毒力基因cps2J基因序列，由南宁科迪生物技术有限公司设计合成，引物位于cps2J基因的1152bp，特异性引物对如下：

上游引物cps2J-Fi：5’-TGATACCAAAGCAAGTTACG-3’

下游引物cps2J-Ri：5’-CTACCCTCATTCACCAGAAG-3’

cps2J扩增序列(1152bp)。

1.4细菌基因组DNA提取

接种单个菌落于含有1ml营养肉汤的EP管中，37℃培养18-24h，然后12000r离心10min，弃去上清液，加入200μl去离子水用封口膜密封后混匀，于100℃沸水中煮沸10min，最后12000r离心10min，取上清液-20℃保存备用。

1.5 PCR反应体系建立

按照试剂盒说明书，按20μl体系配置：

1.6 PCR条件和反应体系的优化

对不同退火温度(52～62℃)和PCR反应液各成分在PCR仪上进行PCR扩增，摸索PCR的最佳反应条件和反应体系。

1.7 PCR特异性和敏感性试验

1)特异性检测

分别以金黄色葡萄球菌球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、绿脓杆菌、变形杆菌、粪肠杆菌、藤黄微球菌以及不携带cps2J的链球菌的基因组DNA作为PCR反应的模板，检验PCR方法的特异性。

2)灵敏性检测

提取分离的食源性溶血链球菌基因组DNA，测定其浓度，连续10倍倍比稀释成6个稀释度，浓度分别为3.2×10⁴ng/ml、3.2×10³ng/ml、3.2×10²ng/ml、3.2×10¹ng/ml、3.2ng/ml、3.2×10^-1ng/ml，取各稀释度DNA 3μL作为模板进行PCR扩增，检测其灵敏性。

PCR反应结束后，取10μL PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，漂洗，在紫外透射仪下观察结果。

1.8目的基因的扩增、克隆和测序

采用设计的特异性引物对提取的食源性溶血链球菌基因组DNA进行PCR扩增，如图1所示，PCR产物电泳后出现与预期扩增长度相同的片段。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳和回收后，与PMD18-T Simple Vector载体过夜连接并转化。获得的阳性质粒经PCR和双酶切鉴定后送北京六合华大基因科技有限公司测序。

2.结果

2.1细菌DNA模板制备的比较

直接菌液法、煮沸法提DNA和试剂盒法提DNA所提供的DNA模版均能达到预期的扩增效果，在DNA模板制备过程中试剂盒提取法提取细菌DNA需要1-2h，煮沸法提取DNA需要30min，节省了试验经费的同时大大减少了检测的时间。相较于直接菌液加入法，煮沸法提取DNA在反应中灵敏度更高。

2.2目的基因的扩增、克隆和测序

采用设计的特异性引物对提取的食源性溶血链球菌基因组DNA进行PCR扩增，如图1所示，PCR产物电泳后出现与预期扩增长度相同的片段。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳和回收后，与PMD18-T Simple Vector载体过夜连接并转化。获得的阳性质粒经PCR和双酶切鉴定后送北京六合华大基因科技有限公司测测序。测序结果与参考序列完全一致，证实引物可特异性扩增出食源性溶血链球菌毒力基因cps2J。

2.3 PCR反应条件及反应体系中退火温度的优化

如图1所示，对PCR退火温度进行优化，获得了食源性溶血链球菌PCR最佳反应条件和退火温度56℃。反应条件为：95℃3min；随后进行35个循环，每个循环包括95℃30s，56℃30s，72℃90s；然后72℃延伸10min。

2.4 PCR特异性和敏感性试验

如图2所示，用该PCR方法分别检测12种病原菌，且结果只有携带毒力基因cps2J的链球菌在1152bp处有扩增产物，表明建立的方法特异性强。

如图3所示，该PCR方法分别对梯度为3.2×10³ng/ml～3.2×10^-2ng/ml的细菌DNA进行检测，电泳结果表明方法最低检测极限是3.2×10-1ng/ml的细菌DNA。

3.检测试剂盒

3.1试剂盒组装

根据以上研究结果，组装检测试剂盒以方便使用。

试剂盒包含A液、B液、C液和PCR反应管；

A液为PCR反应液，含2×Taq MasterMix(Dye)(北京康为世纪生物科技有限公司，规格：5ml，型号：CW0690M)、上游引物cps2J-Fi和下游引物cps2J-Ri和去离子水；

B液为含溶血链球菌毒力基因cps2J的DNA，作为阳性对照；

C液为去离子水，作为阴性对照；

3.2试剂盒的使用方法

PCR反应：在加有17μl试剂A液的反应管中，分别加入3μl样品模板B液和C液，混匀后在PCR仪中进行以下反应：95℃3min；随后进行35个循环，每个循环包括95℃30s，56℃30s，72℃90s；然后72℃延伸10min。

PCR反应结束后，经电泳、染色、漂洗，最后在紫外透射仪下观察结果。

3.3检测试剂盒保存期试验

将检测试剂盒共3批次保存-20℃冰箱中。分别于保存后1、3和6个月，用保存的试剂盒分别对10份食源性溶血链球菌阳性样品和阴性样品检测，每批检测试剂盒的保存期都重复检测3次，观察检测结果，同时每批检测试剂盒的每个保存期都进行保存后的敏感性测定。

试验结果：配制好的5批检测试剂盒在-20℃条件下保存，每3个月取出对样品重复进行3次检测，结果5批检测试剂盒在保存1、3、6、9和12个月后，其敏感性都没有发生改变，均能检测到64pg的食源性溶血链球菌DNA模板，对10份阳性样品的检测均为阳性，结果如图4，这表明试剂盒在-20℃条件下保存12个月仍具有良好的稳定性和重复性。

SEQUENCE LISTING

<110> 广西大学

<120> 食源性溶血链球菌毒力基因cps2J的PCR检测引物及其试剂盒

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