一种重组蝎神经毒素LqhIT2蛋白的制备方法与流程

本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及一种蝎神经毒素LqhIT2优化基因及其重组蛋白的制备方法与应用。
背景技术：
：昆虫神经毒素是一类只作用于昆虫神经系统，有毒杀作用的多肽类神经毒素，主要来自蝎子、蜘蛛、螨虫、胡蜂、蚂蚁等动物毒腺分泌的毒液。到目前为止，已分离纯化和命名的昆虫神经毒素有近百种，主要来自于蜘蛛子，其次来自蜘蛛。蝎昆虫神经毒素LqhIT2是一种从以色列黄蝎Leiurusquinquestriatushebraeus(Ehrenberg)的毒液中分离得到的昆虫长链神经毒素，成熟毒素由61个氨基酸组成，含有4对链内二硫键，其作用位点是昆虫的钠离子通道，该毒素具有较强的抗昆虫活性。昆虫神经毒素具有控制农业害虫的重要潜在价值，但天然昆虫神经毒素在毒腺中的含量低且提取困难的，并且往往只能得到非常少量的纯品，这就给我们进一步研究这些毒素的特性带来了很大的困难。因此，通过分离少量昆虫毒素，测定其氨基酸组成，再得到其成熟基因全长，通过体外大量表达，成为研究这些毒素的一条重要途径。目前，人们已经开发了很多表达系统如：杆状病毒表达系统、原核表达系统、酵母表达系统、丝状真菌表达系统、昆虫细胞表达系统、植物表达系统、哺乳动物表达系统等，为大量制备该类神经毒素提供了有效手段。甲醇酵母表达系统是应用最广泛的酵母表达系统，以Pichiapastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主的外源基因表达系统近年来发展最为迅速，应用也最为广泛。毕赤酵母系统的广泛应用，原因在于该系统除了具有一般酵母所具有的特点外，还具其它很多显著优点，如易操作、高密度发酵放大容易、成本低且可以高水平分泌。目前，还没有利用毕赤酵母表达系统高效表达并纯化活性LqhIT2重组蛋白的相关报告，极大影响了LqhIT2活性测定、杀虫谱分析及其在抗农业害虫中的应用，因此开发出一种利用毕赤酵母高水平分泌表达大量LqhIT2蛋白并快速、低成本的制备具有生物活性的昆虫神毒素LqhIT2蛋白是十分必要的。技术实现要素：针对现有技术中的缺陷，本发明目的之一在于提供一种蝎神经毒素LqhIT2优化重组基因。本发明提供基因，为编码蝎神经毒素LqhIT2蛋白的基因，为序列表中序列1所示的DNA分子。其中，序列表中的序列1由204个脱氧核苷酸组成，该序列为包含6个组氨酸标签(18个脱氧核苷酸)的LqhIT2基因读码框(183个脱氧核苷酸)和终止密码子(3个脱氧核苷酸)，编码具有序列表中序列2的由67个氨基酸残基序列组成的蛋白质。由上述序列表中的序列1编码得到的蛋白属于本发明的保护范围。含有上述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。所述重组载体具体为将上述基因插入表达载体中，得到表达上述蛋白的重组载体。所述重组载体具体优选为将上述基因插入表达载体pPICZαA的XhoⅠ和XbaⅠ酶切位点间，得到表达上述蛋白的重组载体。扩增所述基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。上述引物对中的一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列3，所述引物对中的另一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列4，利用序列3和序列4的引物扩增的目标基因同样可以进行相关的酶切和连接操作。本发明的第二个目的是提供一种制备重组LqhIT2蛋白的方法及应用，包括以下步骤：S1：将权利要求1所述的基因和表达载体pPICZα分别用XhoⅠ和XbaⅠ双酶切并纯化回收，然后利用连接酶在16°C连接，得重组载体pPICZαA-LqhIT2；S2：将所述重组载体pPICZαA-LqhIT2用SacⅠ单酶切线性化，并用氯化锂转化法转化到毕赤酵母宿主菌中，再经过Zeocin筛选得到阳性克隆；S3：将所述阳性克隆转接至含有不同浓度Zeocin的YPD平板，筛选得到高Zeocin抗性的转化子，将所述高抗性转化子用BMGY培养基培养至OD600为10~12，离心收集细胞沉淀，用BMMY培养基重悬细胞，加入甲醇并使其质量分数为1~2%，诱导3d，收集发酵的上清液；在诱导表达之前，优选地将高Zeocin抗性的转化子用BMMY小量诱导表达，筛选得到高水平分泌表达目标蛋白的转化子。将筛选得到的高水平分泌表达目标蛋白的转化子利用BMMY扩大诱导表达，用于大量分泌LqhIT2蛋白。优选地，在步骤S3的扩大诱导之后且收集发酵的上清液之前，为提高目标蛋白的表达水平，还包括甲醇添加诱导表达的如下步骤：S4：在28°C继续诱导培养3d，每24小时补加甲醇使其质量分数保持在1~2%。优选地，在步骤S3之后，还包括纯化蛋白的如下步骤：S5：将所述上清液利用Tris碱调节pH至7.4~7.6，以大于或等于15000g的转速离心10~20分钟，将获得的上清液加入到经pH7.4~7.6Tris-HCl缓冲液平衡后的镍亲合层析柱中，用8~10倍层析柱体积的pH7.4~7.6的含10mMTris-HCl和40mM咪唑的缓冲液漂洗所述镍亲合层析柱；S6：用含10mMTris-HCl和100~400mM咪唑的缓冲液洗脱所述镍亲合层析柱，将得到的洗脱液利用分子量为3kDa的透析袋于10mMTris-HCl缓冲液中透析，然后超滤浓缩。优选地，在步骤S6之后，还包括保存蛋白的如下步骤：S7：将所述超滤浓缩得到的产品在-80°C下速冻，然后冷冻干燥。根据上述任一种制备蛋白的方法制备得到的蛋白也属于本发明的保护范围。通过步骤S3筛选得到的稳定且能高水平分泌表达蝎昆虫神经毒素LqhIT2的酵母转化子也属于本发明保护的范围。上述蛋白、上述基因或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在抗虫领域中的应用也是本发明保护的范围。本发明提供的技术方案具有以下优点：一是根据本技术方案所述的表达方法分泌表达和纯化得到的具有生物活性的重组蝎昆虫神经毒素LqhIT2能够有效防止宿主菌对表达产物的降解，减轻宿主细胞代谢的负荷和表达产物对宿主的毒性作用；二是利用酵母载体pPICZαA-LqhIT2上的分泌信号α-因子信号肽引导目的蛋白的基因分泌表达，目的蛋白会大量分泌到培养液中，且能形成准确的空间结构，从而保持蝎昆虫神经毒素LqhIT2的天然活性；三是通过筛选得到了稳定且能高水平分泌表达得蝎昆虫神经毒素LqhIT2的酵母转化子；四是摸索出用真核宿主毕赤酵母来表达昆虫神毒素LqhIT2的方法和快速高效纯化蝎昆虫神经毒素LqhIT2的方法，可以降低成本且实现大量生产；五是纯化的带组氨酸标签的重组蛋白对昆虫细胞具有毒性。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。附图说明图1为本发明实施例中表达载体pPICZαA-LqhIT2构建示意图；图2为本发明实施例中不同水平分泌表达LqhIT2重组蛋白的转化子上清液中目标蛋白的斑点杂交检测结果图；图3为本发明实施例中在甲醇诱导下不同时间点目标蛋白表达情况的SDS-PAGE检测结果图；图4为本发明实施例中不同浓度的咪唑洗脱纯化得到的LqhIT2蛋白的SDS-PAGE检测结果图；图5为本发明实施例中重组LqhIT2蛋白的生物学活性检测结果。具体实施方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中的%，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。本发明选用毕赤酵母菌株和整合性表达质粒pPICZαA均购自美国Invritrogen公司。本发明中的引物具体序列如序列表中的序列3和序列4所示，利用序列3和序列4的引物扩增的目标基因同样可以进行相关的酶切和连接操作。所用培养基配方如下：1）酵母生长培养基（BMGY）完全溶解10g酵母提取物，20g蛋白胨，定容到800mL。121℃蒸气高压灭菌15-20min，冷却到室温，加入100mL1M磷酸钾溶液，100mIYNB，2mL500×生物素，20mL50%灭菌甘油；2）酵母诱导培养基（BMMY）完全溶解10g酵母提取物，20g蛋白胨，定容到800mL。121℃蒸气高压灭菌15-20min，冷却到室温，加入100mL1M磷酸钾溶液，100mLYNB，2mL500×生物素，10mL甲醇；3）YPD培养基完全溶解10g酵母提取物，20g蛋白胨，定容到900mL，121℃蒸气高压灭菌15-20min，冷却至70℃左右再加入100mL20%灭菌葡萄糖溶液。在其中加入1.6-1.8%的琼脂可制得YPD固体培养基。实施例一本实施例提供了一种优化的人工合成的C-端带有6×His标签的LqhIT2基因及其酵母转化子，具体序列如序列表中的序列1所示，该基因所对应的蛋白质序列如序列表中的序列2所示。本实施例的优化前的序列是根据NCBI数据库提供的DNA序列，是合成LqhIT2神经毒素的天然DNA，然后根据毒素基因和毕赤酵母密码子表达特点，优化并合成优化后的DNA。优化后的DNA序列在NCBI等数据库中找不到同源性基因。将优化的LqhIT2神经毒素的C-端带有6×His标签的DNA分别连接至毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA上，得到重组载体，然后利用Invitrogen公司操作手册提供的氯化锂转化法分别将重组载体转化到毕赤酵母宿主菌X-33中，转化后分别用含有100µg/mLZeocin抗生素的YPD平板进行筛选，利用PCR对转化子进行验证，将PCR验证后的毕赤酵母转化子划线分别接种至含有不同浓度的Zeocin抗生素的YPD平板，然后分别用BMMY小量诱导表达，再进行斑点杂交检测分析。分析结果显示优化后的人工合成的C-端带有6×His标签的DNA构建得到的毕赤酵母转化子能表达并大量分泌目标蛋白。实施例二本实施例提供一种制备蛋白的方法，具体包括如下步骤：S1：构建表达载体及转化：将实施例一的优化后的人工合成的C-端带有6×His标签的DNA连接至毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA，得到重组载体pPICZαA-LqhIT2，载体构建如图1所示，图1为本发明实施例中的真核表达载体pPICZαA-LqhIT2构建示意图。主要的载体构建步骤优选如下：（1）用XhoⅠ和XbaⅠ双酶切含合成的LqhIT2基因的质粒，获得目的片断，反应体系如下（所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司）：含合成的LqhIT2基因的质粒15μL10×M缓冲液5μLXhoⅠ5UXbaⅠ5U无菌水至50μL（2）用XhoⅠ和XbaⅠ双酶切pPICZαA，获得载体片断，反应体系如下（所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司）：质粒pPICZαA15μL10×M缓冲液5μLXhoⅠ5UXbaⅠ5U无菌水至50μL（3）将步骤（1）和（2）得到的目的片断和载体片断用DNA凝胶收回试剂盒回收，该试剂盒购自大连TAKARA公司，具体操作按试剂盒说明书进行；（4）将步骤（3）回收得到的目的片断和载体用T4DNA连接酶（购自大连TAKARA公司）进行连接反应，目的基因准确插入到含有分泌信号α-因子的分泌型载体读码框内，反应体系如下：载体pPICZαA片段1μL目的片段落3μL10×缓冲液1μLT4连接酶0.5μL无菌水至10μLS2：重组质粒的转化：将所述重组载体pPICZαA-LqhIT2用SacⅠ单酶切线性化，按照Invitrogen公司操作手册提供的氯化锂转化法，将重组载体转化到毕赤酵母宿主菌中，本实施例选用的是X-33。转化后用含有100µg/mLZeocin抗生素的YPD平板进行筛选，利用PCR对转化子进行验证。S3：高水平分泌表达酵母转化子的筛选和蛋白的表达：将PCR验证后的毕赤酵母转化子划线接种至含有不同Zeocin抗生素的YPD平板，筛选得到高Zeocin抗性的转化子，将高抗性的转化子用BMMY小量诱导表达，并筛选得到高水平分泌表达目标蛋白的转化子。需要说明的是，将高Zeocin抗性的转化子用BMMY小量诱导表达，其分泌表达的上清液以6×His兔单抗为一抗，以HRP标记的山亲抗兔IgG为二抗，斑点杂志法。从88株高抗性转化子中筛选得到一株稳定且最高水平分泌表达昆虫神毒素LqhIT2的酵母转化子，部分转化子筛选的结果如图2所示。从结果可看出，高抗生转化子之间存在较大的分泌目标蛋白差异，但有2-3株转化子具有显著更高水平的分泌表达LqhIT2，其中最高水平分泌表达的转化子如图中箭头所示。取高水平分泌表达的转化子酵母转化子单菌落，接种至装有50mLYPD液体培养基的250mL三角瓶中，在28℃，300rpm培养条件下培养至菌体OD600=6.0，取上述菌液，接种至含500mLBMGY培养基的2000mL摇瓶中，每甁接种5mL，于28℃，250rpm培养至OD600=12；室温下2500g离心5min，收集菌体，用1/10原培养体积的BMMY重悬菌体，在28°C继续诱导培养4d，每24小时补加甲醇使其质量分数保持在1~2%，收集发酵的上清液。用SDS-PAGE检测甲醇诱导下不同时间目标蛋白表达情况分析，电泳结果如图3所示，图3为本发明实施例中在甲醇诱导下不同时间点目标蛋白表达情况的SDS-PAGE检测和蛋白印迹（6×His兔单抗为一抗，以HRP标记的山亲抗兔IgG为二抗）结果图（目标蛋白如箭头所示）。经诱导1~4d，在10kDa左右均有明显目的蛋白表达，且通过继续补加甲醇，在一定时间内诱导得到的目的蛋白含量更高，具体目的蛋白占发酵液上清蛋白的质量结果如下表1所示。表1不同诱导时间得到的每100毫升上清液中LqhIT2蛋白的毫克数。诱导时间1天2天3天4天目标蛋白质量12283933SDS-PAGE、蛋白印迹和目标蛋白含量检测结果表明，经3d的诱导，目标蛋白即达到最高水平的分泌表达，延长诱导时间会导致目标蛋白的降解。高水平分泌表达的转化子扩大培养，高水平分泌表达的酵母转化子用BMGY培养基培养至OD600为10~12，离心收集细胞沉淀，用1/10原培养体积的BMMY重悬菌体，共诱导培养1L。向BMMY是加入甲醇并使其质量分数为1~2%，诱导3d时，收集发酵的上清液。需要要说明的是，为了保持目标蛋白的高水平表达和减低生产成本，甲醇添加的方式和浓度应包括以下步骤：S4：在28°C继续诱导培养3d，每24小时补加甲醇使其质量分数保持在1~2%。S5：将S3经诱导表害所得到的发酵液于4℃离心，收集离心后的上清液，利用Tris碱调节pH至7.4~7.6，以15000g的转速离心15分钟，将获得的上清液加入到经pH7.4~7.6Tris-HCl缓冲液平衡后的镍亲合层析柱中，用8~10倍层析柱体积的pH7.4~7.6的含10mMTris-HCl和40mM咪唑的缓冲液漂洗镍亲合层析柱。S6：用含10mMTris-HCl的100、200和400mM咪唑缓冲液洗脱镍亲合层析柱并收集洗脱液，SDS-PAGE分析目标蛋白，将洗脱液利用分子量3kDa的透析袋于10mMTris-HCl缓冲液中透析后利用截留分子量3kDa的15mL超滤管将样品浓缩20倍。S7：浓缩产品于-80°C冰箱中速冻后冷冻干燥，即得高纯度的重组LqhIT2蛋白冻干粉，通过比例换算，可以从每升BMMY诱导液上清中可以纯化得到330毫克的纯化重组蛋白。需要说明的是，将步骤S6洗脱下来的纯化蛋白进行SDS-PAGE分析，结果如图4所示，图4为本发明实施例中不同浓度的咪唑洗脱纯化得到的LqhIT2蛋白的SDS-PAGE检测结果图。从结果可以看出，先利用40mM咪唑的漂洗液可以将大量杂蛋白去除，再利用100、200和400mM咪唑的缓冲液洗脱层析柱时均能洗脱得到高纯度的目标蛋白，且在100mM时目标蛋白已经被大量洗脱，合并100、200和400mM咪唑的洗脱液用于后续的透析和超滤浓缩操作。对比例本发明的发明人先前也人工合成并优化蝎神经毒素LqhIT2的DNA，将其连接至pET-30a(+)载体中，经IPTG诱导表达和镍亲合纯化，得到了少量的融合蛋白，仅在银染条件下可看清目标蛋白条带，但该蛋白经注射和饲喂蝗虫和德国小蠊均未检测到生物活性。以上结果说明，原优化的基因和pET-30a(+)载体并不适合表达该杀虫活性蛋白。同样，将该基因连接至毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K后转化毕赤酵母，经诱导表达，虽然获得到较高水平的分泌表达，但由于其在酵母中分泌表达的杂蛋白太多，因而导至分离纯化困难，最终未获得纯化的重组蛋白，仅对诱导后的上清液混合蛋白进行了活性测试。本实施例提供的技术方案目的蛋白LqhIT2的表达量显著提高，从S3收集发酵的上清液，经过步骤S5和S6纯化，从1L的培养液中可以纯度在95%以上的LqhIT2蛋白330mg，而对比例中，1L的培养液中纯化前的目标蛋白也仅仅有20mg且没能获得纯化产品，由此可见经过优化和筛选后可显著提高目标蛋白的表达水平且组氨酸标签能让目标蛋白得到高效纯化。将实施例二经过纯化步骤S5和S6得到的纯化后的LqhIT2蛋白进行生物学活性分析，具体分析方法和结果如下。实验方法：在10cm培养皿中将昆虫细胞SF9于昆虫细胞培养基中培养至90%生长密度，胰酶消化并将细胞浓度调整至5×105cell/mL，向96孔细胞培养板中每孔加入100μl的昆虫SF9细胞悬液，培养过夜后，向各培养孔分别加入不同终浓度的LqhIT2蛋白(0、2、5、10、20、100ng/ml)，每个浓度3个平行孔，将上述细胞于标准条件下培养48小时，显微镜下测定细胞的生长情况。实验结果：图5为本发明实施例中优化后的重组LqhIT2蛋白的生物学活性结果图。2ng/ml的重组LqhIT2蛋白就能抑制昆虫细胞SF9的生长，在该浓度下细胞的生长密度明显低于不加重组蛋白的对照，且已经有少量细胞开始萎缩死亡，死亡细胞如箭头所示。当浓度达到5ng/ml时细胞已经大量死亡；当浓度达到20ng/ml时细胞密度已经很低且更多是萎缩死亡的细胞；当浓度达到100ng/ml时细胞所有待测细胞全部死亡。细胞活性测定结果如表2所示，本发明所采用的方法制备的LqhIT2重组蛋白具有很高的生物学活性。表2生物学活性分析结果（n=3）。蛋白浓度(ng/ml)细胞死亡率（%）0023255410782094100100在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型，而并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。SEQUENCELISTING<110>怀化学院<120>一种重组蝎神经毒素LqhIT2蛋白的制备方法<130>6<160>4<170>PatentInversion3.3<210>1<211>210<212>DNA<213>人工序列<400>1gacggttacatcaaaagaagagacggttgtaaagttgcttgtttgatcggaaacgaaggt60tgtgataaagaatgcaaagcatacggtggatcttacggttactgttggacttggggtttg120gcttgttggtgtgaaggtttgcctgacgacaagacttggaaatcagaaactaacacttgt180ggtcatcaccatcaccatcactaa204<210>2<211>67<212>PRT<213>人工序列<400>2AspGlyTyrIleLysArgArgAspGlyCysLysValAlaCysLeuIle151015GlyAsnGluGlyCysAspLysGluCysLysAlaTyrGlyGlySerTyr202530GlyTyrCysTrpThrTrpGlyLeuAlaCysTrpCysGluGlyLeuPro354045AspAspLysThrTrpLysSerGluThrAsnThrCysGlyHisHisHis505560HisHisHis65<210>3<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>3gcggatccgacggttacatcaaaagaag28<210>4<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>4gcaagcttttaaccacaagtgttagtttc29当前第1页1 2 3