本发明涉及选择具有肿瘤的受试者用于用fgfr抑制剂治疗，以及涉及用这种抑制剂治疗这种受试者。
背景技术：
成纤维细胞生长因子及其受体(fgfr)驱动影响细胞增殖、迁移和存活的重要发育信号传导途径。异常的fgf信号传导在许多癌症中起作用。turner,n.和grose,r.(2010)nat.rev.cancer10:116-29。fgfr家族由fgfr1、fgfr2、fgfr3和fgfr4组成。fgfr是在一部分肿瘤中通过基因扩增、突变或染色体易位或重排激活的酪氨酸激酶。fgfr1的扩增发生在鳞状细胞肺癌和雌激素受体阳性乳腺癌中。fgfr2还在胃癌和乳腺癌中扩增。在子宫内膜癌中观察到fgfr2突变，并在膀胱癌中观察到fgfr3突变。thecancergenomeatlasnetwork(2012)nature489:519-25；elbauomyelsheikh,s.等人(2007)breastcancerres.9:r23；turner,n.等人(2010)cancerres.70:2085-94；peng,d.f.等人(2003)j.pathol.201:439-50；matsumoto,k.等人(2012)br.j.cancer106:727-32；byron,s.a.等人(2008)cancerres.68:6902-7；cappellen,d.等人(1999)nat.genet.23:18-20；al-ahmadie,h.a.等人(2011)j.pathol.224:270-9.在多种癌症中报道了fgfr1、fgfr2和fgfr3的染色体易位和重排。parker,b.c.等人(2014)j.pathol.232:4-15.
fgfr融合基因也在多种血液和实体瘤型癌症中被报道。例如，乳腺癌中的fgfr1-erlin2，鳞状细胞肺癌中的fgfr2-kiaa1967，多发性骨髓瘤中的fgfr3易位t(4,14)。注意到，一些融合发生在不同的癌症中。例如，fgfr3-tacc3融合发生在胶质母细胞瘤、膀胱癌和鳞状细胞癌中。已知融合基因的综合列表见于例如annala等人(2013)或于shaw,a.t.等人(2013)naturereviewscancer13:772-87中。
为了满足明确的需求，开发了一些或多或少特异性的fgfr抑制剂。它们包括pd173074(mohammadi等人(1998)emboj.17:5896-904)、帕唑帕尼(pazopanib)(harris等人(2009)j.med.chem.51:4632-40；keisner和shah(2011)drugs71:443-54)、azd4547(gavine等人(2012)cancerres.72:2045-56)、普纳替尼(ponatinib)(或ap24534)(huang等人(2010)j.med.chem.53:4701-19)、多韦替尼(dovitinib)(trudel等人(2005)blood105:2941-8；man等人(2014)j.cell.mol.med.18:143-55)、bgj398(guagnano等人(2011)j.med.chem.54:7066-83)、e-3810也称为德立替尼(lucitanib)(bello等人(2011)cancerres.71:1396-405)、jnj-42756493(squires等人(2008)aacrabstract1545)、arq087(yu等人(2011)cancerres.71(增刊1)3671)、ly2874455(zhao等人(2011)molcancerther.10:2200-10)、bay1163877(heroult等人(2014)cancerres.74(增刊19)-abstract1739)、asp5878(73rdannualmeetingofthejapanesecancerassociation(2014)-abstract/poster1411)、e7090(saoriwatanabemiyano等人(2015)aacrabstract770)、odm-203(
现在有几种fgfr抑制剂正在对人类受试者施用，因此产生了关于用于确定是否应该用特定抑制剂治疗特定受试者的恰当标准的问题。该问题涉及针对携带突变激活的fgfr的肿瘤、表达fgfr融合蛋白的肿瘤和/或含有扩增的、未突变或突变的fgfr基因的肿瘤，抑制剂是否具有活性。一个相关的问题涉及对于特定fgfr家族成员的特异性。这些问题的答案可能是抑制剂特异性的。目前的实践似乎是用优选的fgfr抑制剂治疗含有fgfr基因中的任意上述遗传学改变的任意肿瘤。显然，恰当的选择标准还不得而知。
技术实现要素：
本发明涉及一种用于鉴定和选择可能对治疗方案有响应的、被诊断患有癌症的一组受试者的方法，所述治疗方案包括施用包含有效量的化合物a的药物组合物。所述方法包括从患有癌症的受试者中获取肿瘤或液体活检组织(biopsy)，确定fgfr1、fgfr2和fgfr3的表达水平，并且如果所确定的fgfr1、fgfr2和fgfr3中至少一种的表达水平超过那种fgfr的预先设定的阈值水平，则认为或宣告所述受试者适宜接受所述治疗方案。
在特定实施方案中，上述方法在信使rna(mrna)水平下确定fgfr1、fgfr2和fgfr3的表达水平。可以通过任意合适的方法来评估信使rna水平。优选为通过数字方法的fgfrmrna分子的检测。这种类型的具体方法是本文使用的nanostring的ncounter基因表达测定。另一种合适的方法是反转录和定量pcr。
为了给fgfr1、fgfr2和fgfr3中的每一个设定阈值水平，汇编了一个均衡的患者衍生的肿瘤异种移植物(pdx)模型集，该模型分为四种不同的类别，其在所述集中类似地表示为：
(i)fgfr基因的拷贝数增加并且fgfr过表达，(ii)fgfr基因的拷贝数增加而fgfr不过表达，(iii)fgfr基因的拷贝数不增加，但fgfr过表达，以及(iv)fgfr融合基因产物表达。
测量fgfr1、fgfr2和fgfr3的表达水平和用化合物a治疗的功效。这些数据确立了响应率和fgfr百分比临界表达水平之间的关系。参见表1。“响应率”(有时缩写为“rr”)是指其肿瘤被化合物a有效治疗(即满足所需的最小治疗功效δt/δc(这里为0))的模型的百分比。fgfr的百分比临界表达水平是指这样的水平：在该水平下，百分比的模型具有相同或更低的fgfr表达水平。例如，关于fgfr的75th百分比临界表达水平标识了这样的fgfr水平(阈值水平)，其对应于在75％的具有最低水平的fgfr的模型中测量的最高水平。要注意的是，尽管表1提供了某些百分比临界表达水平的阈值水平，但是可以容易地确定其他百分比临界水平的阈值水平。这种确定所需的数据在下表2中提供。
可以选择对应于约44％至约73％的临界水平的fgfr阈值水平，因为该阈值水平范围不排除任何以下模型：该模型能够响应化合物a，同时与在所有模型中观察到的响应率相比，显著增加在被认为过表达的模型内观察到的响应率(例如超过10％)。对应的响应率为从约36.2％至约52.5％。更优选的是对应于从60％至约73％的临界水平的fgfr阈值水平。对应的响应率为从约39.6％至约52.5％。甚至更优选的是对应于从65％至约73％的临界水平的fgfr阈值水平。对应的响应率为从约42.9％至约52.5％。最优选的是对应于从70％至约73％的临界水平的fgfr阈值水平。较不优选的阈值——由于较低的响应率——是对应于低于约44％的临界水平的阈值。因为排除了一小部分可治疗的受试者，还较不优选的是对应于超过73％的临界水平的那些。
应注意的是，为了本文所讨论的不依赖于适应症的诊断方法的目的，在每个模型的计算中考虑了fgfr1、2和3，即，如果fgfr1、fgfr2或fgfr3中至少一种的表达水平超过所选百分比临界水平的对应阈值水平，则认为模型过表达。
表1：百分比临界值、响应率和fgfr阈值
*fgfr外显子14的相对于16种参考(持家)基因(actb，alas1，cltc，mrpl19，rpl19，rplp0，sf3a1，tbp，tubb，c1orf43外显子1，c1orf43外显子2，chmp2a外显子3，emc7外显子5，emc7外显子3，gpi外显子4和gpi外显子6)的mrna表达水平的中值(其由ncounter基因表达测定确定)的mrna表达水平。“响应率”(“rr”)是指所选择的其肿瘤被化合物a有效治疗(即满足所需的最小治疗功效δt/δc(本文为0))的模型的百分比。
在上述方法的其他特定实施方案中，在蛋白质水平上评估fgfr1、fgfr2和fgfr3的表达水平。合适的方法包括western印迹、斑点印迹、elisa、免疫层析、免疫组织化学、质谱分析和流式细胞术。
上述方法不区分癌症适应症，即不依赖适应症。本发明还涵盖用于鉴定和选择可能对治疗方案有响应的、被诊断患有具体类型的癌症，例如食道癌、肺癌(例如鳞状nsclc)或膀胱癌的一组受试者的方法，所述治疗方案包括施用包含有效量的化合物a的药物组合物。所述方法包括从患有晚期类型癌症的受试者中获取肿瘤或液体活检组织，确定fgfr(或多种fgfr)的表达水平，已知所述fgfr(或多种fgfr)的表达水平在一部分患有此类癌症的受试者的肿瘤中升高，并且如果所确定的fgfr的表达水平超过预先设定的阈值水平，则认为或宣告所述受试者适宜接受所述治疗方案。
为了给所讨论的fgfr(或多种fgfr)设定阈值水平，可以为所关注的具体类型的癌症汇编一个均衡的肿瘤异种移植物(pdx)模型集，由此这些模型通常符合四种不同的类别，其在组中类似地表示为：
(i)fgfr基因的拷贝数增加并且fgfr过表达，(ii)fgfr基因的拷贝数增加而fgfr不过表达，(iii)fgfr基因的拷贝数不增加，但fgfr过表达，以及(iv)fgfr融合基因产物表达。
测量所讨论的fgfr的表达水平以及用化合物a治疗的功效。这些数据确立了响应率和fgfr百分比临界表达水平之间的关系。可以选择对应于临界水平或临界水平范围的fgfr阈值水平，其尽可能升高而不排除任意能够响应化合物a的模型(参见上述关于不依赖适应症的方法的讨论)。根据选择目标，可以选择更高或更低的百分比临界水平。
本发明还涉及一种个体化的癌症治疗方法，其包括上述方法：从患有癌症的受试者中获取肿瘤或液体活检组织，确定fgfr1、fgfr2和fgfr3中任意或全部的表达水平，并且，如果所确定的fgfr1、fgfr2和fgfr3中至少一个的表达水平超过预先设定的阈值水平，则认为或宣告所述受试者适宜接受所述治疗方案，并且增加了另一步骤：使受试者接受治疗方案，所述治疗方案包括施用包含有效量的化合物a的药物组合物。在更具体的实施方案中，个体化癌症治疗的后一方法可以通过癌症适应症进行分层(stratify)。
本发明还涉及一种选择患有癌症的受试者用于用化合物a治疗的方法，所述方法包括确定来自受试者的肿瘤或液体活检组织中fgfr1、fgfr2和fgfr3的表达水平，并且如果所确定的fgfr1、fgfr2和fgfr3中至少一个的表达水平超过预先设定的阈值水平，则认为所述受试者适宜接受所述治疗。
本发明还涉及化合物a在制备用于治疗需要其的受试者中的癌症的药物中的用途，或涉及用于治疗受试者中的癌症的化合物a，其中如在来自受试者的肿瘤或液体活检组织中测定的fgfr1、fgfr2和fgfr3中至少一种的表达水平超过预先设定的阈值水平。
在上述方法和用途的具体实施方式中，在信使rna水平测量fgfr1、fgfr2和fgfr3的表达水平，并且预先设定的至少一种fgfr的阈值表达水平对应于所述至少一种fgfr的自44％至73％的临界表达水平的任意水平，对应于相对于由ncounter基因表达测定法测量的16种参考基因的集的mrna表达水平的中值的表达水平，对于fgfr1，其为从0.104至0.641，对于fgfr2为从0.257至1.094，对于fgfr3为从0.128至0.815，16种参考基因为actb，alas1，cltc，mrpl19，rpl19，rplp0，sf3a1，tbp，tubb，c1orf43外显子1，c1orf43外显子2，chmp2a外显子3，emc7外显子5，emc7外显子3，gpi外显子4和gpi外显子6。
在又一个更具体的实施方案中，预先设定的至少一种fgfr的阈值水平对应于所述至少一种fgfr的自60％至73％的临界表达水平的任意水平，对应于相对于通过ncounter基因表达测定法测量的上述定义的16种参考基因的集的mrna表达水平的中值的表达水平，对于fgfr1，其为从0.301至0.641，对于fgfr2为从0.669至1.094，对于fgfr3为从0.289至0.815。在又一个更具体的实施方案中，预先设定的至少一种fgfr的阈值水平对应于所述至少一种fgfr的自65％至73％临界表达水平的任意水平，对应于相对于通过ncounter基因表达测定法测量的上述定义的16种参考基因的集的mrna表达水平的中值的表达水平，对于fgfr1，其为从0.484至0.641，对于fgfr2为从0.884至1.094，对于fgfr3为从0.490至0.815。在又一个更具体的实施方案中，预先设定的至少一种fgfr的阈值水平对应于所述至少一种fgfr的自70％至73％临界表达水平的任意水平，对应于相对于通过ncounter基因表达测定法测量的上述定义的16种参考基因的集的mrna表达水平的中值的表达水平，对于fgfr1，其为从0.558至0.641，对于fgfr2为从0.984至1.094，对于fgfr3为从0.671至0.815。
在本发明的另一个具体的实施方案中，所述癌症是胃癌，并且预先设定的fgfr2的阈值表达水平对应于fgfr2自44％至83％临界表达水平的任意水平，其对应于fgfr2的相对于通过ncounter基因表达测定法测量的上述定义的16种参考基因的集的mrna表达水平的中值的表达水平为从0.257至1.610。在这种实施方案中，更优选的是对应于自约60％至约83％的临界水平的fgfr2阈值水平(0.669-1.610)。甚至更优选的是对应于自约70％至约83％的临界水平的fgfr2阈值水平(0.984-1.610)。最优选的是对应于自80％至约83％的临界水平的fgfr2阈值水平(1.460-1.610)。在这样的实施方案中，可以仅确定fgfr2的表达水平或fgfr1、2和3的表达水平。
在本发明的又一个具体的实施方案中，所述癌症是食管鳞状细胞癌，并且预先设定的fgfr1的阈值表达水平对应于fgfr1自44％至84％临界表达水平的任意水平，其对应于fgfr1的相对于通过ncounter基因表达测定法测量的上述定义的16种参考基因的集的mrna表达水平的中值的表达水平为从0.104至1.362。在这种实施方案中，更优选的是对应于自约60％至约84％的临界水平的fgfr1阈值水平(0.301-1.362)。甚至更优选的是对应于自约70％至约84％的临界水平的fgfr1阈值水平(0.558-1.362)。最优选的是对应于自约80％至约84％的临界水平的fgfr1阈值水平(0.759-1.610)。在这样的实施方案中，可以仅确定fgfr1的表达水平或fgfr1、2和3的表达水平。
所有上述阈值水平以及某些中间百分比临界水平的阈值水平见表1。如前所述，可以很容易地确定其他百分比临界水平的阈值水平。
附图说明
图1显示了在66个pdx模型中用化合物a治疗的功效(δt/δc)的瀑布图。在该分析中，δt/δc值<0表示有效治疗。模型被标识在横坐标上。
图2.左侧是pdx模型用化合物a治疗的功效(δt/δc)的瀑布图，显示既没有任意fgfr的基因拷贝数增加也没有融合基因的表达。右侧是pdx模型的类似图，显示有fgfr的基因拷贝数增加或融合基因的表达。δt/δc值<0表示有效治疗。模型被标识在横坐标上。
图3.左侧是没有过表达fgfr1、fgfr2或fgfr3任一种(水平低于73th百分比临界表达水平)的pdx模型用化合物a治疗的功效(δt/δc)的瀑布图。右侧是过表达fgfr1、fgfr2或fgfr3任一种(水平高于73th百分比临界表达水平)的pdx模型的类似图。δt/δc值<0表示有效治疗。模型被标识在横坐标上。
图4.左侧是pdx模型用化合物a治疗的功效(δt/δc)的瀑布图，显示没有任意fgfr的基因拷贝数增加、融合基因的表达或fgfr突变的存在。右侧是pdx模型的类似图，显示有fgfr的基因拷贝数增加、融合基因的表达或fgfr突变的存在。δt/δc值<0表示有效治疗。模型被标识在横坐标上。
图5显示了在66个pdx模型中用化合物a治疗的功效(δt/δc)的瀑布图。在该分析中，δt/δc值<0.4表示有效治疗。模型被标识在横坐标上。
图6.左侧是pdx模型用化合物a治疗的功效(δt/δc)的瀑布图，显示既没有任意fgfr的基因拷贝数增加也没有融合基因的表达。右侧是pdx模型的类似图，显示有任意fgfr的基因拷贝数增加或融合基因的表达。δt/δc值<0.4表示有效治疗。模型被标识在横坐标上。
图7.左侧是没有过表达fgfr1、fgfr2或fgfr3任一种(水平低于73th百分比临界表达水平)的pdx模型用化合物a治疗的功效(δt/δc)的瀑布图。右侧是过表达fgfr1、fgfr2或fgfr3任一种(水平高于73th百分比临界表达水平)的pdx模型的类似图。δt/δc值<0.4表示有效治疗。模型被标识在横坐标上。
图8.左侧是pdx模型用化合物a治疗的功效(δt/δc)的瀑布图，显示没有任意fgfr的基因拷贝数增加、融合基因的表达或fgfr突变的存在。右侧是pdx模型的类似图，显示有fgfr的基因拷贝数增加、融合基因的表达或fgfr突变的存在。δt/δc值<0.4表示有效治疗。模型被标识在横坐标上。
图9显示了通过rt-qpcr和nanostring技术中的每一种在pdx肿瘤样品的测试集(testset)上测量的mrna水平之间非常好的相关性。两种方法都使用三个持家基因(alas1、cltc、mrpl19)的一个常见集进行标准化。(a)16个食管鳞状细胞癌(escc)pdx肿瘤样品——对于fgfr1mrna水平，r2＝0.915；(b)26个胃pdx肿瘤样品——对于fgfr2mrna水平，r2＝0.957。
图10显示了根据实施例1，在胃癌的pdx模型中用化合物a治疗的功效(δt/δc)与fgfr2的表达水平之间的关系，同时显示fgfr2扩增(空心圆圈)。(a)相关性图；(b)箱形图。
图11显示了根据实施例2，在escc的pdx模型中用化合物a治疗的功效(δt/δc)和fgfr1的表达水平之间的关系，同时显示了fgfr1扩增(空心圆圈)。(a)相关性图；(b)箱形图。
具体实施方式
定义：
化合物a是5-氨基-1-(2-甲基-1h-苯并咪唑-5-基)-1h-吡唑-4-基]-(1h-吲哚-2-基)-甲酮(cas1265229-25-1)。该化合物描述于国际专利申请公开wo2011016528和nakanishi,y.等人(2014)mol.cancerther.13:2547-58中。其还包括这种化合物的药学上可接受的盐，包括但不限于乙酸，己二酸，l-抗坏血酸，l-天冬氨酸，羊蜡酸(癸酸)，碳酸，柠檬酸，富马酸，半乳糖二酸，d-葡庚糖酸，d-葡糖酸，d-葡糖醛酸，谷氨酸，戊二酸，甘油磷酸，乙醇酸，马尿酸，盐酸，dl-乳酸，月桂酸，马来酸，(-)-l-苹果酸，棕榈酸，磷酸，癸二酸，硬脂酸，琥珀酸，硫酸，(+)-l-酒石酸和硫氰酸，其中优选(-)-l-苹果酸。
“fgfr”是指成纤维细胞生长因子受体家族的成员。fgfr家族是受体酪氨酸激酶家族的成员。fgfr家族的四个成员是已知的，即fgfr1、fgfr2、fgfr3和fgfr4。本发明中所提及的fgfr可以来自任意来源，但优选地来自哺乳动物，更优选地，来自人类。本发明涉及fgfr1、2和/或3，并且如本文所用的术语fgfr是指后三种fgfr中的任意一种或任意组合。
“癌症”通常是指恶性新生物，其可以是转移性或非转移性的。例如，发育自上皮组织(如胃肠道和皮肤)的癌症的非限制性实例包括脑肿瘤、皮肤癌、头颈癌、食管癌、肺癌、胃癌、十二指肠癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫颈癌、子宫体癌、胰腺癌、肝癌、胆管癌、胆囊癌、结肠直肠癌、结肠癌、膀胱癌和卵巢癌。发育自非上皮组织(基质)(例如肌肉)的肉瘤的非限制性实例包括骨肉瘤、软骨肉瘤、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤和血管肉瘤。此外，源自造血器官的血液癌症的非限制性实例包括恶性淋巴瘤包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤、白血病包括急性粒细胞白血病、慢性粒细胞白血病、急性淋巴性白血病、慢性淋巴性白血病和多发性骨髓瘤。后面的癌症的实例在本文中也指癌症的类型。
化合物a(本文也指“活性剂”或“化合物”)的“治疗有效量”是指在单次或多次施用后，以适用于任意医学治疗的合理的收益/风险比，对所治疗的受试者赋予治疗效果的化合物的量。但是，应理解，有效剂量还将根据施用的途径以及与其他试剂(包括抗肿瘤剂)共同使用的可能性而变化。但是，应理解，本发明组合物的每日总使用量将由主治医师在合理的医学判断范围内确定。对于任意特定的患者，具体治疗有效剂量水平将依赖于多种因素，包括病况/疾病的严重程度；所使用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；施用时间、施用途径、活性剂的排泄速率；治疗的持续时间；与活性剂组合或同时使用的药物以及医学领域公知的类似因素。
术语“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的溶媒”涵盖任意标准药物载体、溶剂、表面活性剂或溶媒。适合的药学上可接受的溶媒包括水性溶媒和非水性溶媒。标准药物载体及其制剂以非限制方式描述于remington'spharmaceuticalsciences,mackpublishingco.,easton,pa,第19版.1995。
术语“受试者”涉及哺乳动物，并且优选涉及人类。
关于fgfr的术语“过表达”是指肿瘤或肿瘤活检组织中的表达水平(在rna或蛋白质水平测量)，其超过在对应的非肿瘤细胞或组织中所测量的水平。
方法：
在66名患者衍生的异种移植物(pdx)模型中检查了对用fgfr激酶抑制剂化合物a治疗的敏感性。根据通过使用下一代测序(ngs)技术和与affymetrixhumangenomeu219阵列板杂交的rna测序(rna-seq)而获得的可用信息，来选择pdx模型。选择了一组均衡的模型，其具有以下特征：(i)fgfr基因的拷贝数增加并且fgfr过表达，或者(ii)fgfr基因的拷贝数增加而fgfr不过表达，或者(iii)fgfr基因的拷贝数不增加，但fgfr过表达，或者(iv)fgfr融合基因产物表达。
对于每个肿瘤模型，评估(或重新评估)化合物a对肿瘤生长(治疗功效)、fgfr拷贝数和fgfrmrna水平的影响。在几个模型研究中，还使用免疫组织化学方法估计了fgfr蛋白质水平。在一个典型实验中，从接种了所选择的pdx肿瘤的种子小鼠收获肿瘤片段，并用于接种雌性balb/c裸鼠。每只小鼠在右侧皮下接种一个肿瘤片段(直径2-3mm)用于肿瘤发育。当平均肿瘤大小达到约200-250mm3时开始治疗。向荷瘤小鼠每天通过灌胃口服施用配制成去离子水中的1％kollidonva64中的悬浮液的化合物a(60-80mg/kg)或仅溶媒(即，去离子水中的1％kollidonva64)，持续14天。
使用卡尺每周两次在两个维度上测量肿瘤体积，并且将体积以mm3表示，使用公式：v＝0.5a×b2，其中a和b分别是肿瘤的长直径和短直径。还每周两次记录体重。治疗功效表示为δt/δc，由此δt报告在治疗的最后一天与治疗开始之间药物治疗动物的肿瘤体积的相对变化，δc报告在治疗的最后一天和治疗开始之间非药物治疗动物的肿瘤体积的相对变化(中值体积差异)。不同模型的结果示于表2中。
通过fish估计fgfr拷贝数。将获自荷瘤动物的肿瘤组织固定在缓冲的福尔马林中并包封在石蜡块(ffpe)中。如schildhaus,h.u.等人(2012)mol.pathol.25:1473-80所述，将三至四微米的组织切片固定在硅烷化的载玻片上，脱蜡，蛋白酶处理，洗涤，dna变性，然后与fgfr探针杂交。在杂交之后，同样如schildhaus等人(2012)所述，使用荧光显微镜扫描肿瘤组织用于扩增热点(hotspot)。所使用的fgfr探针为fgfr1/cen8双色探针、fgfr2/cen10双色探针和fgfr3/4p11双色探针(均来自zytovisiongmbh，bremerhaven，德国)。将基因拷贝数增加(gcn)定义为扩增(fishfgfr探针-着丝粒探针比≥2.2)或多体性(polysomy)，定义为fgfr探针-着丝粒探针比<2.2，但fgfr探针和着丝粒探针中的每一个>2。
表2.pdx肿瘤模型的特征
*bl：膀胱；br：乳腺；bn：大脑；cr：结肠直肠；en：子宫内膜，es：食管：ga：胃；gl：胆囊；hn：头部和颈部；ki：肾脏；li：肝脏；lu：肺；pa：胰腺。除了模型7和8源自oncodesign(oncodesign,20,ruejeanmazen-bp27627-21076dijoncedex，法国)，模型56和57源自urolead(urolead,11ruehumann,
表2续.
*e10-14代表fgfrrna编码序列的外显子10至14。后者外显子编码fgfr的酪氨酸激酶结构域的大部分。数字表示相对于参考基因actb，alas1，cltc，mrpl19，rpl19，rplp0，sf3a1，tbp，tubb，c1orf43外显子1，c1orf43外显子2，chmp2a外显子3，emc7外显子5，emc7外显子3，gpi外显子4和gpi外显子6的表达水平的中值(通过nanostring的ncounter基因表达测定法测量)的表达水平。
表2续.
*e10-14和16代表fgfrrna编码序列的外显子10至14和16。后者外显子编码fgfr的酪氨酸激酶结构域的大部分。数字表示相对于参考基因actb，alas1，cltc，mrpl19，rpl19，rplp0，sf3a1，tbp，tubb，c1orf43外显子1，c1orf43外显子2，chmp2a外显子3，emc7外显子5，emc7外显子3，gpi外显子4和gpi外显子6的表达水平的中值(通过nanostring的ncounter基因表达测定法测量)的表达水平。
表2续.
*e10、11和14代表fgfrrna编码序列的外显子10、11和14。后者外显子编码fgfr的酪氨酸激酶结构域的大部分。数字表示相对于参考基因actb，alas1，cltc，mrpl19，rpl19，rplp0，sf3a1，tbp，tubb，c1orf43外显子1，c1orf43外显子2，chmp2a外显子3，emc7外显子5，emc7外显子3，gpi外显子4和gpi外显子6的表达水平的中值(通过nanostring的ncounter基因表达测定法测量)的表达水平。
为了确定fgfrmrna水平，根据制造商的说明使用qiagenmirneasyffpe试剂盒(qiagen217504)从一至六个宏观解剖的10μm厚的ffpe切片中提取总rna。该方案涉及使用qiagen专有的rna组织裂解缓冲液裂解脱蜡的组织，并与蛋白酶k孵育。在离液盐(chaotropicsalt)的存在下，rna与离心柱的玻璃纤维特异性地结合。将结合的rna与dna酶孵育，并在一系列的快速洗涤-旋转步骤中纯化，然后在水中洗脱。使用nanodrop分光光度计(thermofischerscientific，沃尔瑟穆，马萨诸塞州，美国)通过吸光度，和使用qubit荧光计(lifetechnologies)通过荧光测定rna浓度。
根据制造商nanostringtechnologies公司，西雅图，华盛顿州，美国(www.nanostring.com)的指示，使用ncounter基因表达测定方案分析每个样品的300ng总rna。ncounter测定基于使用目标特异性、颜色编码的探针直接数字检测感兴趣的mrna分子，所述目标特异性、颜色编码的探针与溶液中的靶分子直接杂交，从而通过计数以相对的方式测量每个基因的表达水平，而不需要cdna合成和扩增。每个探针由在5'末端携带条形码的50个碱基的报道探针部分和在3'末端携带生物素分子的50个碱基的捕获探针部分组成，使得清除多余的探针后，靶标探针复合物被固定在链霉亲和素包被的ncountercartridge上用于数字数据收集(计数)。nanostring方法的描述见于geiss,g.k.等人(2008)nat.biotech.26:317-325；malkow,v.a.等人(2009)bmcresearchnotes2:80；和guancial,e.a.等人(2014)cancermed.3(4):835-44。
本发明人选择了fgfr基因和参考(即持家)基因。由nanostringtechnologies公司(customcodeset)设计并合成了这种fgfr和持家基因的探针，然后将所有消耗品和试剂(包括由nanostring提供的8个阴性和6个阳性标准化探针)插入即用型ncountermaster试剂盒中用于在ncounter分析系统中的样品处理。阴性标准化探针用于背景校正(见下文)，阳性标准化探针仅用于cartridge质量控制。在nanostring于2012年出版的ncounterexpressiondataanalysisguide中描述了使用阳性标准化探针进行标准化的方法。由nanostring提供的用于探针设计的靶序列(fgfr靶序列以及用于标准化的靶序列，即持家基因的序列)再现于下表3中。标准化探针的参考提供于下表4中。表2中给出了为不同模型确定的fgfrmrna水平(相对于由actb，alas1，cltc，mrpl19，rpl19，rplp0，sf3a1，tbp，tubb，c1orf43外显子1，c1orf43外显子2，chmp2a外显子3，emc7外显子5，emc7外显子3，gpi外显子4和gpi外显子6组成的16种参考基因的集的mrna水平表示的)。
所获得的计数值是背景校正的。根据在每个所分析的rna样本中“持家基因”的表达水平的平行测量，对背景校正值进行标准化。使用了以下方案：
背景校正
1.对于每个样品，通过计算阴性标准化探针的计数的平均值±2倍标准偏差来得出背景校正值(backgroundcorrectionvalue)。
2.通过将除了阴性标准化探针以外的所有探针的计数减去背景校正值来获得背景校正过的值(background-correctedvalue)。
持家基因标准化
1.对于每个样品，计算背景校正过的标准化(持家基因)探针计数的中值[hkg中值]。
2.通过将fgfr探针的背景校正过的计数除以各自样品的hkg中值来获得标准化计数。
表3：ncounter测定中用于设计探针的靶序列。
a.fgfr基因靶标：
b.参考基因靶标(用于标准化的“持家”基因)
表4.阳性和阴性标准化探针*
*nanostring提供了以下关于阴性和阳性对照标准化的附加信息：外部rna对照联盟(externalrnacontrolconsortium,ercc)是为开发可用于在基因表达测定中评估技术性能的rna对照转录本而确立的一组行业代表物。nanostring采用了由ercc开发和测试的序列用于阳性和阴性杂交对照。ercc对照序列与任何已知的生物体都不是同源的，在所有的codesets中都是适用的和可转移的，并且在基因表达分析中产生一致的结果。针对ercc转录物序列设计的报告探针被预混合到每个codeset中，因此可用于数据分析。
注意的是，标准化的阈值对用于标准化的参考基因集敏感(表5)。
表5.用31、16或3个持家基因(hkg)的集计算的41个模型的标准化阈值(70百分比临界值)
或者，可以通过能够可靠地定量mrna水平的任意其他方法来确定fgfrmrna水平。合适的方法包括但不限于：
(1)northern印迹。northern印迹可用于估计mrna的分子量并测量不同样品中存在的mrna的相对量。一般的印迹方案以从均质化的组织样品或从细胞中提取总rna开始。通常在琼脂糖凝胶上通过凝胶电泳分离rna。由于凝胶上有很多不同的rna种类，因此rna通常表现为拖尾带(smear)而不是离散的带。将rna转移到硝酸纤维素膜上，但是也可以使用其他类型的膜。rna分子保持与凝胶中相同的分离模式。将印迹与探针，通常是单链dna，一起孵育。该探针将与其互补的rna序列形成碱基对并结合形成rna-dna双链分子。探针可以被放射性标记或与酶(例如，碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶)偶联。在后一种情况下，通过如下过程来显示探针的位置：将探针与无色底物一起孵育，所连接的酶转化成有色产物，该有色产物可被观察到或发光，其将曝光x射线胶片。如果用放射性标记探针，则它可以直接曝光x射线胶片。(2000)invest.ophthalmol.vis.sci.41:2357-62。
(2)核酸酶保护测定(npa)。npa(包括核糖核酸酶保护测定和s1核酸酶测定)是一种非常敏感的用于检测和定量具体mrna的方法。首先将提取的rna与放射性标记的rna或dna探针混合，所述放射性标记的rna或dna探针与一种或多种目标序列互补，并且互补链杂交以形成双链rna(或dna-rna杂交体)。然后将混合物暴露于核糖核酸酶，所述核糖核酸酶仅特异性切割单链rna(dna)但对双链rna(或dna-rna杂交体)无活性。当反应完成时，易感的rna区域被降解为非常短的寡聚物或个体核苷酸；尚存的rna片段是与所添加的反义链互补并由此包含目标序列的片段。剩余的受保护的片段通过凝胶电泳分离并通过放射自显影显现。maddula,k.等人fgfrandfgfligandoverexpressioninlungcancer:implicationsfortargetedtherapy.htgmoleculardiagnostics，图森，亚利桑那州，美国，2014ascoannualmeeting.
(3)逆转录-定量聚合酶链式反应(rt-qpcr)。rt-qpcr彻底改变了基因表达的研究。无论起始材料的稀缺性或具体mrna的相对丰度如何，理论上现在可以检测任意基因的rna转录物。在rt-qpcr中，使用逆转录病毒逆转录酶将rna模板复制成互补dna(cdna)。然后通过pcr以指数方式扩增cdna，并且扩增与荧光的产生有关联，其可以在每个pcr循环期间简单地用照相机检测。这个过程是“实时”监控的，所以是定量的。相对定量的rt-qpcr涉及与目标转录物同时扩增内部对照转录物。内部对照用于标准化样本。一旦标准化，则可以在样品间直接比较具体mrna的相对丰度。为了使相对rt-qpcr结果有意义，必须在扩增的线性范围内分析pcr反应的所有产物。yan,d.,等人(2011)arthritisres.ther.13(4):r130；wong,m.l.和medrano,j.f.(2005)biotechniques39:75-85。
(4)与dna微阵列杂交。genechip微阵列使用dna片段(阵列上)和rna靶分子(来自待分析的样品)的杂交来确定表达水平，即从给定基因制备了多少rna。已知的dna片段被用作“探针”来结合和鉴定样品mrna。虽然这与其他杂交技术(如southern和northern印迹)没有本质区别，但微阵列的独特之处在于一次提供的信息量。成千上万的dna序列(或甚至更大数目的寡核苷酸)以已知和有序的方式(因此为“阵列”)排列在小的固体支持结构或微芯片上。扩增和标记之后的rna样品能够与阵列结合。如果样品中的基因被表达，其mrna(cdna)将与芯片上的其互补dna探针杂交。然后对阵列进行扫描，提供关于具体基因功能的定性和定量信息。dalma-weiszhausz,d.d.等人(2006)methodsenzymol.410:3-28；yadav,v.等人(2012)j.biol.chem.287:28087-98。
(5)rna-seq。rna-seq是最近开发的使用深度测序技术进行转录组分析的方法。与其他方法相比，rna-seq还提供了更精确的转录本及其异构体水平的测量。所有rna-seq实验都遵循类似的方案。根据待分析的rna的类型，从目标样品中分离总rna，可以在制备文库之前纯化以富集mrna、microrna或lincrna等。文库制备可能涉及反转录成cdna、pcr扩增等步骤，并且可能保存或可能不保存链型(strandedness)信息。测序可以在单末端测序反应中产生一个读长(read)，或在成对末端反应中产生由未测序的片段分开的两个末端。li,f.等人(2015)cancerdiscov.5:438-51。对于深度测序技术的综述，参见metzker,m.l.等人(2010)nat.rev.genet.11:31-46。
还可以通过能够可靠地定量不同fgfr的蛋白质水平的方法来评估fgfr基因的表达。合适的方法包括但不限于：
(1)western印迹。western印迹使用凝胶电泳通过3-d结构来分离天然蛋白或通过多肽的长度来分离变性蛋白。然后将蛋白质转移到膜(通常是硝酸纤维素膜或pvdf膜)上，在膜上用靶蛋白特异性的一抗对其染色。一旦结合，抗体则可视化，或者用与一抗偶联的特异性标签或者用可以显现的二抗。wynes,m.w.等人(2014)clin.cancerres.20:3299-309。
(2)免疫斑点测定。斑点印迹是一种简单的鉴定生物样品中已知蛋白质的技术。该技术的方便和简单性使得斑点印迹成为理想的诊断工具。斑点印迹的关键特征是使用免疫检测来鉴定具体蛋白质，例如疾病的蛋白质标记物。一旦将蛋白质固定在蛋白质结合膜上，通常是硝化纤维素或pvdf，就可以用一抗，即对目标蛋白特异的抗体来对其进行探针探查。一旦结合，抗体则可视化，或者用与一抗偶联的特异性标签或者用可以显现的二抗。girjes,a.a.等人(1993)veterinaryrecord133:136-41；shekhar,m.s.(2010)aquacultureresearch41:1683-90。
(3)免疫测定。酶联免疫吸附测定(elisa)是使用抗体和颜色变化来鉴定物质的测试，固相酶免疫测定(eia)是用于检测液体样品或湿样品中物质(通常为抗原)的存在的测试。来自样品的抗原附着于表面上。然后，将另外的特异性抗体应用于表面以使其可以结合抗原。该抗体与酶连接，并且在最后一步中加入酶的底物。随后的反应产生可检测的信号，最常见的是底物的颜色变化。许多平台技术提供用于多路复用和小型化免疫亲和测定(例如luminex、mesoscalediscovery和perkinelmer)的方法。人成纤维细胞生长因子受体3(fgfr3)elisa试剂盒(http://www.cusabio.com/)；lequin,r.m.(2005)clin.chem.51:2415-8。
(4)免疫层析法。免疫层析测定法(也称为侧流或试纸条测试)利用简单的装置来检测样品(基质)中靶标分析物的存在(或不存在)，而不需要专门的昂贵的设备，尽管存在许多由读取设备支持的应用。该技术基于一系列的毛细管床，如多孔纸或烧结聚合物。这些元件中的每一个都具有自发输送流体(例如尿液)的能力。第一个元件(样品垫)起到海绵的作用，容纳过量的样品流体。一旦浸透，流体则迁移至第二元件(结合垫)，一种盐-糖基质中的干燥形式的生物活性颗粒，其包含保证靶分子(例如抗原)与其已被固定在颗粒表面上的化学配偶体(例如，抗体)之间最佳化学反应的所有物质。当样品流体溶解盐-糖基质时，它也溶解颗粒，并且在一个联合转运作用中，样品和偶联物混合，同时流动穿过多孔结构。这样，分析物与颗粒结合，同时进一步迁移通过第三毛细管床。该材料具有一个或多个区域(通常称为条带)，其中第三分子已被制造商固定。当样品-偶联物混合物到达这些条带时，分析物已经结合在颗粒上，并且第三“捕获”分子结合该复合物。稍后，当越来越多的流体已经通过条带，颗粒聚集，条带区域变色。典型地，至少有两个条带：一个(对照)捕获任意颗粒，从而表明反应条件和技术运行良好，第二个含有具体的捕获分子，仅捕获分析物分子已经被固定在其上的那些颗粒。流经这些反应区域后，流体进入最终的多孔材料，吸液芯(wick)，其只作为废物容器。zeng.q.等人(2009)am.j.biomed.sci.1:70-79。
(5)免疫组织化学。免疫组织化学(ihc)是一种能够显示组织切片中蛋白质的存在和位置的方法。虽然只是半定量的，但它能够在完整组织的情况下观察过程。ihc方案的基本步骤如下：固定和包埋组织，切割和固定切片，脱蜡和再水化切片，应用抗原修复过程，免疫组织化学染色并在显微镜下观察染色。以下方案用于检测肿瘤组织中的fgfr表达：在4μm石蜡包埋的组织切片上进行免疫染色。简而言之，将载玻片在二甲苯中脱蜡并使用梯度乙醇系列脱水，并用3％过氧化氢封闭内源性过氧化物酶。修复抗原表位后，将载玻片用含有0.1％(体积)吐温20/5％(体积)正常山羊血清的tris缓冲盐水洗涤和封闭。在4℃下进行一抗孵育过夜，然后与二抗在室温孵育30分钟。用含有0.1％(体积)吐温20的tris缓冲盐水将切片洗涤三次，用二氨基联苯胺(dab)染色并用苏木精复染。一抗：
fgfr1兔单克隆抗体(cellsignalingtechnology，cat#9740，clone#d8e4)
fgfr2兔多克隆抗体(novusbiologicals，cat#nb200-642)
fgfr3小鼠单克隆抗体(santacruzbiotechnology，cat#sc-13121，cloneb-9)guancial等人(2014)；redler,a.等人(2013)plosone.8:e72224。
(6)质谱。质谱(ms)测量离子的质荷比以鉴定和定量蛋白质。尽管质谱法可以检测到复杂混合物中非常低的分析物浓度，但由于分析过程中肽和离子的相当大的损失，ms并不是固有的定量分析。因此，肽标签或标准物与样品同时进行分析，并作为相对或绝对肽定量的参考点。catenacci.d.v.等人(2014)plosone9:e100586；razavi,m.等人(2013)clin.chem.59:1514-22.使用液体组织选择反应监测(lt-srm)的质谱法可用于客观地量化fgfr的水平。hembrough,t.等人(2012)clin.proteomics:9:5；hembrough,t.等人(2013)j.mol.diagn.5:454-65。
(7)流式细胞术。流式细胞术是一种用于细胞计数、细胞分选、生物标记物检测和蛋白质工程化的基于激光的生物物理技术，其涉及将细胞悬浮在流体流中，并通过电子检测装置使其传递。它允许每秒多达数千个粒子的物理和化学特性的同时多参数分析。使用蛋白特异性的抗体，流式细胞术可以提供关于细胞表面表达，以及在一些情况下，用于理解复杂细胞群体或过程的细胞质或细胞核标记物的表达的信息。yan,d.等人(2011)arthritisres.ther.13:r130.
所有66个pdx模型的δt/δc值的瀑布图示于图1中。当使用δt/δc值为0来定义药物治疗的功效(完全抑制肿瘤生长)时，66个肿瘤中仅21个(响应率约32％)被化合物a有效地治疗。由于pdx模型是低传代(low-passage)的人类肿瘤模型，因此，可能会非常接近地再现人类肿瘤的特性，所以这些数据被用来预测仅约32％的人类受试者(其具有扩增的fgfr基因、表达的fgfr融合基因产物和/或表现出一定水平的fgfrmrna的过表达)将对该药物治疗响应，68％的受试者将可能不会受益于该药物。值得注意的是，用于筛选用于具有抗fgfr活性的选择性酪氨酸激酶抑制剂(新化学实体)的试验(trial)的人类受试者的典型标准是fgfr基因的基因拷贝数增加(扩增，多体性)或fgfr融合蛋白基因的存在。表现出基因拷贝数增加和/或存在fgfr融合基因的所有pdx模型的δt/δc值的瀑布图也显示32.5％的响应率(图2，右图)。因此，这些选择标准的应用无法确定能被化合物a有效治疗的模型的亚组，或至少无法富集该亚组。从反向分析中获得基本上相同的结果，即，当考虑没有发现任何fgfr的基因拷贝数增加或fgfr融合基因的表达的所有pdx模型时(图2，左图)。
令人惊讶的是，当仅考虑过表达fgfr至一定水平的模型时，发现40个pdx模型中的21个(响应率约52％)对化合物a有响应(图3，右图)。相反，当仅将没有过表达任何fgfr至那个水平的模型包括在分析中时，响应率为0(图3，左图)。这些发现强烈地表明，与fgfr基因的拷贝数增加和/或fgfr融合基因的存在相比，fgfr(即fgfr1、fgfr2和fgfr3)的过表达是用化合物a成功治疗的更好的预测器。对于后期分析，如果fgfr的标准化的rna水平高于在66个pdx模型的73％(73th百分比临界表达水平)中发现的rna水平，则认为fgfr显著过表达。对于fgfr1，阈值水平(由上述nanostring技术确定的fgfr外显子14rna/参照rna)为0.641，对于fgfr2为1.094，对于fgfr3为0.815。
所有模型的事后分析确定在某些模型中存在fgfr突变。包括这些突变作为选择标准的响应率的计算令人惊讶地证实了fgfr过表达优于遗传学改变的优越的预测能力。表现出基因拷贝数增加和/或存在fgfr融合基因和/或fgfr突变的所有pdx模型的δt/δc值的瀑布图也显示约32％的响应率(图4，右图)。因此，与上述类似，应用遗传学改变作为选择标准(包括fgfr突变)也无法确定被化合物a有效治疗的模型的亚组，或至少无法富集该亚组。从反向分析中获得基本上相同的结果，即，当考虑没有发现任何fgfr的基因拷贝数增加、fgfr融合基因的表达或fgfr突变的存在的所有pdx模型时(图4，左图)。
注意到，fgfr过表达的预测能力可以通过降低或增加fgfr阈值表达水平来改变。在44th百分比临界表达水平下，用化合物a治疗的响应率约为36％(表1)。与选择fgfr的基因拷贝数增加和/或fgfr融合基因的存在和/或fgfr突变的存在所产生的响应率相比，这仍然是更好的响应率。在73th百分比临界表达水平下，响应率相当高，即高于52％(图3，右图；表1)。在90th百分比临界下，其高于71％。然而，在第74th百分比和更高的临界水平下，排除了一些对化合物a有响应的模型。
发现过表达选择标准对δt/δc阈值相对不敏感，所述δt/δc阈值被选择以分离化合物a有效的和无效的治疗。在上述分析中，将δt/δc阈值设定为零(0)，相当于在治疗期间肿瘤生长完全停止。当将δt/δc阈值设定为0.4时，相当于在治疗期间肿瘤生长显著减少，没有选择的响应率为51.5％(图5)。当仅考虑具有fgfr基因的拷贝数增加和/或fgfr融合基因表达的模型时，响应率为50％(图6，右图)。当仅考虑没有发现任何fgfr的基因拷贝数增加，也没有发现可检测的fgfr融合基因的表达的pdx模型时，响应率为53.8％(图6，左图)。这些发现再次表明，后两种选择标准很少或没有预测价值。当仅考虑过表达fgfr(73th百分比临界表达水平)的模型时，响应率高于72％(图7，右图)。因此，对于治疗功效，即使使用这种不太严格的0.4阈值，fgfr的过表达仍然是用化合物a成功治疗的重要预测因子。
将δt/δc阈值设定为0.4，当在选择标准中考虑fgfr突变时，可以进行与上述相同的观察。当仅考虑具有增加的fgfr基因拷贝数、表达fgfr融合基因和/或在fgfr基因中具有突变的模型时，响应率为52.4％(图8，右图)。当仅考虑没有发现任何fgfr的基因拷贝数增加、fgfr融合基因的表达或fgfr突变的存在的pdx模型时，响应率为50％(图8，左图)。
如前所述，上述分析不受用于估计fgfr表达的方法的限制。可以通过测量mrna水平的其他方法，如northern印迹、核酸酶保护测定、rt-qpcr、微阵列杂交或rna-seq，产生类似的数据。证明rt-qpcr和nanostringmrna表达结果非常相关的实例示于图9中。该图显示了在pdx肿瘤样品的测试集中通过rt-qpcr和nanostring技术中的每一种测量的mrna水平：(a)16个食管鳞状细胞癌(escc)pdx肿瘤样品(对于fgfr1mrna水平，r2＝0.915)以及(b)26个胃pdx肿瘤样品(对于fgfr2mrna水平，r2＝0.957)。按照本文方法部分中描述的方法进行nanostring测量，不同之处在于使用用于rt-qpcr数据的标准化的三个参考基因的相同组进行标准化(参见下文)。如下进行rt-qpcr测量：使用mirneasyffpe试剂盒(qiagen)分离来自ffpe组织切片的总rna。使用transcriptoruniversalcdnamaster(roche)，用500ngrna进行逆转录。对于qpcr，使用fam染料标记的taqmanassays(roche，thermo)和
fgfr过表达是不依赖癌症适应症或亚型选择可能对用化合物a治疗有响应的受试者的成功标准。基于癌症适应症或亚型的分析的分层具有增强过表达分析(如上所述进行)在特定适应症或亚型中的预测能力的潜力。显示fgfr表达与治疗功效之间的相关性适用于特定适应症的实例在图10和11中给出。例如，图11a中的图显示，在食管鳞状细胞癌(escc)的pdx模型中，用化合物a治疗的功效随着fgfr1表达的程度而增加。在所研究的食管模型中，δt/δc比与fgfr1表达呈负相关(spearman相关性p值：0.0043872)。
基于上述发现和结论，本发明人提出了一种用于鉴定和选择可能对用化合物a治疗有响应的被诊断患有癌症的受试者的方法。第一步包括从受试者获得肿瘤活检组织或液体活检组织(例如，血液，可从中分离循环肿瘤细胞或外泌体)。根据为确定fgfr1、fgfr2和fgfr3基因的表达水平而选择的方法的要求处理活检组织。在下一步中，估计fgfr1、fgfr2和fgfr3rna或蛋白质的量。在最后一步中，将如此获得的表达值与通过前面讨论的类型的分析而确定的预先设定的阈值进行比较。如果受试者的fgfr1、fgfr2和fgfr3的任一个的rna或蛋白质水平超过各自的阈值，则该受试者被认为是用化合物a治疗的候选者。本发明还涉及一种个体化的癌症治疗方法，其中，使通过后面的诊断方法选择为可能对用化合物a治疗有响应的患者接受治疗方案，所述治疗方案涉及施用包含化合物a的药物组合物。
值得注意的是，针对具体癌症适应症的预先设定的阈值水平可能不同于针对所有适应症所确定的阈值水平，必然地，它们的临界水平也不同。对于食管鳞状细胞癌，可选择对应于约44％至约84％的临界水平的fgfr1阈值水平(0.104-1.362)，因为该阈值水平范围不排除任何能够响应化合物a的模型。更优选的是对应于自约60％至约84％的临界水平的fgfr1阈值水平(0.301-1.362)。甚至更优选的是对应于自约70％至约84％的临界水平的fgfr1阈值水平(0.558-1.362)。最优选的是对应于自约80％至约84％的临界水平的fgfr1阈值水平(0.759-1.610)。对于胃癌，可以选择对应于约44％至约83％的临界水平的fgfr2阈值水平(0.257-1.610)，因为该阈值水平范围不排除任何能够响应化合物a的模型。更优选的是对应于自约60％至约83％的临界水平的fgfr2阈值水平(0.669-1.610)。甚至更优选的是对应于自70％至约83％的临界水平的fgfr2阈值水平(0.984-1.610)。最优选的是对应于自80％至约83％的临界水平的fgfr2阈值水平(1.460-1.610)。注意到，在一般(不依赖适应症的)方法中，测定fgfr1、fgfr2和fgfr3的水平，而在涉及具体类型的癌症的方法中，仅确定(多种)目标fgfr(即，已知在一小部分患有此类癌症的受试者的肿瘤中升高)的水平足矣。
进一步注意到，所公开的诊断方法依赖于这样的合理假设：患者的肿瘤和在动物体内直接从患者的肿瘤的片段生长的肿瘤在rna和蛋白质水平表现出非常相似的fgfr基因表达水平。guo等人2016cancerres.[电子版提前打印](can-15-32452016年六月发布)最近的分析证实了这种假设的合理性。
包含fgfr激酶抑制剂化合物a的本发明的药物组合物可以经口服、肠胃外、经吸入喷雾、局部、直肠、鼻、颊、阴道或通过植入储器施用，优选经口服施用或经注射施用。药物组合物可包含任意常规无毒的药学上可接受的载体、佐剂或溶媒。某些情况下，可使用药学上可接受的酸、碱或缓冲剂调节制剂的ph，以增强活性剂或其递送形式的稳定性。标准药物载体及其制剂以非限制方式描述于remington'spharmaceuticalsciences,mackpublishingco.,easton,pa，第19版.1995。本文中术语肠胃外包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内和颅内注射或输注技术。
用于经口服施用的液态剂型包括药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液、悬液、糖浆剂和酏剂。除了活性剂外，液态剂型可包含本领域通常使用的惰性稀释剂例如水或其它乳化剂、增溶剂和溶剂例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油类(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和山梨聚糖脂肪酸酯及其混合物。除了惰性稀释剂之外，经口服组合物还可以包括佐剂例如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂和芳香剂。
可注射制剂例如无菌可注射水性或油性悬液，可根据已知技术使用适合的分散剂或润湿剂和悬浮剂配制。无菌可注射制剂还可以是在无毒的肠胃外可接受稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液、悬液或乳液例如作为在1,3-丁二醇中的溶液。可接受的溶媒和溶剂中可使用的是水、林格氏溶液、u.s.p.和等渗氯化钠和右旋糖溶液。此外，无菌的非挥发油通常用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可以使用任意温和的不挥发油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸如油酸可用于制备注射剂。
可注射制剂可以是无菌的，例如通过细菌截留过滤器过滤、高压灭菌、干热、电离辐射或通过掺入无菌固体组合物形式的活性剂来灭菌，所述无菌固体组合物可在使用前溶解或分散于无菌水或其它无菌可注射介质中。
为了延长活性剂的效果，通常希望减缓来自皮下或肌内注射的活性剂的吸收。这可以通过使用具有弱水溶性的结晶或无定形材料的液态悬浮液来实现。然后，活性剂的吸收速率取决于其溶解速率，其转而可能取决于晶体尺寸和结晶形式。或者，肠胃外施用的药物形式的延迟吸收通过将活性剂溶解或悬浮在油溶媒中来实现。可注射的贮库形式通过在可生物降解的聚合物如聚丙交酯-聚乙交酯中微胶囊化活性剂来制备。根据活性剂与聚合物的比例和所用特定聚合物的性质，可以控制活性剂释放的速率。其它可生物降解聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。储库型可注射制剂也可通过将活性剂包埋在与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备。
用于经口服施用的固态剂型包括胶囊、片剂、丸剂、粉剂和颗粒剂。这些固态剂型中，活性剂与至少一种惰性的药学上可接受的赋形剂或载体，例如柠檬酸钠或磷酸二钙，和/或：a)填充剂(filler)或增量剂(extender)，例如淀粉、乳糖、纤维素、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸，b)粘合剂，例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶，c)保湿剂如甘油，d)崩解剂，例如琼脂-琼脂、碳酸钙、交联羧甲基纤维素、交聚维酮、羧甲基纤维素、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠，e)溶解阻滞剂，例如石蜡，f)吸收促进剂，例如季铵化合物，g)润湿剂，例如鲸蜡醇、十二烷基硫酸钠和单硬脂酸甘油酯，h)吸收剂，例如高岭土和膨润土，和/或i)润滑剂，例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固态聚乙二醇、十二烷基硫酸钠及其混合物混合。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型还可以包含缓冲剂。
相似类型的固态组合物也可以作为填充剂用于软和硬填充的明胶胶囊，使用赋形剂例如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等。
片剂、糖衣丸、胶囊、丸剂和颗粒剂的固态剂型可以用包衣和壳制备，例如药物配制领域熟知的肠溶衣和其它包衣。它们可任选地包含遮光剂(opacifyingagent)，并且还可以是仅仅或优选地在肠道某一部分中任选地以延迟方式释放活性剂的组合物。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。
一般而言，根据本发明的治疗方案包括每天以单剂量或多剂量，例如每日2剂量，向需要这种治疗的人类受试者施用10mg至250mg的化合物a。
可与药学上可接受的赋形剂或载体组合以产生单剂量形式的活性剂的量可根据特定的施用模式并且可能根据所治疗的受试者而变化。典型的制剂可含有1％至95％的活性剂(w/w)。可选择地，所述制剂可含有20％至80％的活性剂。可能需要比上述那些更低或更高的剂量。对于任意特定受试者的具体剂量和治疗方案将取决于多种因素，包括年龄，体重，身体表面面积，一般健康状况，性别，饮食，施用时间，排泄速率，药物组合，疾病、病况或症状的严重度及病程，受试者对疾病、病况或症状的处置，以及治疗医师的判断。
除非本文另有说明，否则本文中数值范围的列举仅旨在用作单独地指代落入该范围内的每个独立值的速记方法，并且每个独立的值被并入说明书中，如同它被单独记载于此。除非另有说明，本文提供的所有精确值代表相应的近似值(例如，关于特定因素或测量提供的所有确切示例性值在适当情况下可以被认为也提供由“约”修饰的相应的近似测量值)。
本文提供的任何和所有实施例或示例性语言(如，“例如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，而不对本发明的范围构成限制，除非另有说明。
本文中专利文献的引用和纳入仅仅是为了方便，并不反映对所述专利文献有效性、可专利性和/或可执行性的任何观点。本说明书中的任意方面或本发明的实施方案中使用术语例如参考一个或多个元件旨在提供对本发明的类似方面或实施例的支持，即“由......组成”、“基本上由...组成”或“基本上包括”一个或多个具体的元素，除非另有说明或与上下文明显矛盾(例如，除非另有说明或与上下文明显矛盾，否则描述为包含具体元素的组合物应理解为也描述由该元素组成的组合物)。
本发明包括在适用法律允许的最大范围内在本文提出的方面或权利要求中引用主题的所有修改和等同物。
本说明书中引用的所有出版物和专利文献通过引用全文纳入本文，如同每个单独的出版物或专利文献被具体和单独地指明通过引用纳入
实施例
实施例1：化合物a在胃pdx模型中的体内功效与fgfr2表达和/或扩增有关
考虑到其gcn和fgfr2的表达水平以及fgfr2融合，选择了11种胃癌pdx模型，从而构成了一个fgfr2表达水平尽可能均匀分布的均衡的模型集。
对于每个肿瘤模型，评估(或重新评估)化合物a对肿瘤生长(治疗功效)、fgfr拷贝数和fgfrmrna水平的影响。从接种了所选择的pdx肿瘤的种子小鼠收获肿瘤片段，并用于接种雌性balb/c裸鼠。每只小鼠在右侧皮下接种一个肿瘤片段(直径2-3mm)用于肿瘤发育。当平均肿瘤大小达到约200-250mm3时开始治疗。向荷瘤小鼠每天通过灌胃口服施用配制成去离子水中的1％kollidonva64中的悬浮液的化合物a(60-80mg/kg)或仅溶媒(即，去离子水中的1％kollidonva64)，持续14天。对于每种pdx模型，治疗组使用3只小鼠，并使用3只小鼠作为对照动物(仅溶媒)。
使用卡尺每周两次在两个维度上测量肿瘤体积，并且将体积以mm3表示，使用公式：v＝0.5a×b2，其中a和b分别是肿瘤的长直径和短直径。还每周两次记录体重。治疗功效表示为δt/δc，由此δt报告在治疗的最后一天与治疗开始之间药物治疗动物的肿瘤体积的相对变化，δc报告在治疗的最后一天和治疗开始之间非药物治疗动物的肿瘤体积的相对变化(中值体积差异)。不同模型的结果示于表6中。
通过fish估计fgfr拷贝数。将获自荷瘤动物的肿瘤组织固定在缓冲的福尔马林中并包埋在石蜡块(ffpe)中。如schildhaus,h.u.等人(2012)mol.pathol.25:1473-80所述，将三至四微米的组织切片固定在硅烷化的载玻片上，脱蜡，蛋白酶处理，洗涤，dna变性，然后与fgfr探针杂交。在杂交之后，同样如schildhaus等人(2012)所述，使用荧光显微镜扫描肿瘤组织用于扩增热点。所使用的fgfr探针为fgfr1/cen8双色探针、fgfr2/cen10双色探针和fgfr3/4p11双色探针(均来自zytovisiongmbh，bremerhaven，德国)。将基因拷贝数增加(gcn)定义为扩增(fishfgfr探针-着丝粒探针比≥2.2)或多体性，定义为fgfr探针-着丝粒探针比<2.2，但fgfr探针和着丝粒探针中的每一个>2。
如上文方法部分中所述，通过nanostring技术测定mrna水平。
表6.胃pdx肿瘤模型的特征
表6续.
表6续.
表6续.
*e10-14和16代表fgfrrna编码序列的外显子10至14和16。后者外显子编码fgfr的酪氨酸激酶结构域的大部分。数字表示相对于在表2的底部列举的16种参考基因的表达水平的中值(由nanostring的ncounter基因表达测定测量)的表达水平。
图10(a)中示出了用化合物a的治疗功效(δt/δc)与fgfr2mrna表达(按上述外显子10-14和16之一的表达水平测量的)之间的关系，其中还示出了显示fgfr2扩增的模型(fish比>2.2，空心圆圈)。似乎fgfr2水平的增加与更好的抗肿瘤功效相关(spearman相关性p值：0.0150174)。
图10(b)显示了将相同结果聚集成两个类别的另一种表示，即响应模型(δt/δc<0)和非响应模型(δt/δc>0)对fgfr2mrna表达水平，同时还示出了fgfr2扩增(fish比>2.2，空心圆圈)。
清楚地看出，响应模型和非响应模型显示出不同水平的fgfr2表达，并且仅基于fgfr2扩增(空心圆圈)选择模型(即患者肿瘤)不能够选择所有的响应模型。事实上，一种显示没有扩增但有高水平的fgfr2表达的模型对化合物a有响应。
实施例2：化合物a在食管鳞状细胞癌(escc)pdx模型中的体内功效与fgfr1表达和/或扩增有关
考虑到其gcn和fgfr1的表达水平，选择了13种esccpdx模型，从而构成了fgfr1表达水平尽可能均匀分布的一个均衡的模型集。在该特定的escc适应症中，尚未报到fgfr1融合。
对于每种肿瘤模型，评估(或重新评估)化合物a对肿瘤生长(治疗功效)、fgfr拷贝数和fgfrmrna水平的影响。从接种了所选择的pdx肿瘤的种子小鼠收获肿瘤片段，并用于接种雌性balb/c裸鼠。每只小鼠在右侧皮下接种一个肿瘤片段(直径2-3mm)用于肿瘤发育。当平均肿瘤大小达到约200-250mm3时开始治疗。向荷瘤小鼠每天通过灌胃口服施用配制成去离子水中的1％kollidonva64中的悬浮液的化合物a(60-80mg/kg)或仅溶媒(即，去离子水中的1％kollidonva64)，持续14天。对于每种pdx模型，治疗组使用3只小鼠，并使用3只小鼠作为对照动物(仅溶媒)。
使用卡尺每周两次在两个维度上测量肿瘤体积，并且将体积以mm3表示，使用公式：v＝0.5a×b2，其中a和b分别是肿瘤的长直径和短直径。还每周两次记录体重。治疗功效表示为δt/δc，由此δt报告在治疗的最后一天与治疗开始之间药物治疗动物的肿瘤体积的相对变化，δc报告在治疗的最后一天和治疗开始之间非药物治疗动物的肿瘤体积的相对变化(中值体积差异)。不同模型的结果示于表7中。
通过fish估计fgfr拷贝数。将获自荷瘤动物的肿瘤组织固定在缓冲的福尔马林中并包埋在石蜡块(ffpe)中。如schildhaus,h.u.等人(2012)mol.pathol.25:1473-80所述，将三至四微米的组织切片固定在硅烷化的载玻片上，脱蜡，蛋白酶处理，洗涤，dna变性，然后与fgfr探针杂交。在杂交之后，同样如schildhaus等人(2012)所述，使用荧光显微镜扫描肿瘤组织用于扩增热点。所使用的fgfr探针为fgfr1/cen8双色探针、fgfr2/cen10双色探针和fgfr3/4p11双色探针(均来自zytovisiongmbh，bremerhaven，德国)。将基因拷贝数增加(gcn)定义为扩增(fishfgfr探针-着丝粒探针比≥2.2)或多体性，定义为fgfr探针-着丝粒探针比<2.2，但fgfr探针和着丝粒探针中的每一个>2。
如上文方法部分中所述，通过nanostring技术测定mrna水平。
表7.esccpdx肿瘤模型的特征
表7续.
表7续.
表7续.
*e10-14和16代表fgfrrna编码序列的外显子10至14和16。后者外显子编码fgfr的酪氨酸激酶结构域的大部分。数字表示相对于在表2的底部描述的16种参考基因的表达水平的中值(由nanostring的ncounter基因表达测定测量)的表达水平。
图11(a)中示出了用化合物a的治疗功效(δt/δc)与fgfr1mrna表达(按上述外显子11-14之一的表达水平测量)之间的关系，其中还示出了显示fgfr1扩增的模型(fish比>2.2，空心圆圈)。似乎fgfr1水平的增加与更好的抗肿瘤功效相关(spearman相关性p值：0.0043872)。
图11(b)显示了将相同结果聚集成两个类别的另一种表示，即响应模型(δt/δc<0)和非响应模型(δt/δc>0)对fgfr1mrna表达水平，同时还示出了fgfr1扩增(fish比>2.2，空心圆圈)。
清楚地看出，响应模型和非响应模型显示出不同水平的fgfr1表达，并且对于这种特定的escc适应症，遗传结构改变，例如扩增(空心圆圈)不能够选择对化合物a有响应的模型。
虽然为了清楚理解的目的通过说明和实施例相当详细地描述了本发明，但是根据本发明的教导，本领域普通技术人员将容易明白可进行某些变化和修饰而不脱离所附权利要求的精神或范围。
序列表
<110>德彪药业国际股份公司
debiopharminternationalsa
<120>fgfr表达以及对fgfr抑制剂的敏感性
fgfrexpressionandsusceptibilitytoanfgfrinhibitor
<130>dph126-pct
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