一种低异味产杆菌肽地衣芽胞杆菌及其构建方法和应用与流程

文档序号:12412122阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种低异味产杆菌肽地衣芽胞杆菌的构建方法,包括以下步骤:

1)根据地衣芽胞杆菌DW2基因组DNA序列中的ptb基因的上、下游序列,设计ptb基因的上、下游同源臂引物;并以地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA为模板,分别以ptb基因的上、下游同源臂引物进行PCR扩增得到ptb基因的上游同源臂和ptb基因的下游同源臂,再利用重叠延伸PCR方法将ptb基因的上游同源臂和ptb基因的下游同源臂拼接在一起,得到融合基因序列A;

2)采用限制性内切酶XbaⅠ和BamH I对步骤(1)得到的融合基因序列A进行双酶切,得到酶切基因序列A;同时,采用限制性内切酶XbaⅠ和BamH I对质粒T2(2)-ori进行双酶切,得到酶切质粒T2(2)-ori,并将酶切基因序列A连接到酶切质粒T2(2)-ori中,得到ptb基因敲除质粒T2(2)-ori- ptb

3)通过电转化将步骤2)得到的ptb基因敲除质粒T2(2)-ori- ptb转入地衣芽胞杆菌DW2中,经卡那霉素抗性筛选得到阳性转化子,抽质粒进行菌落PCR验证,将验证成功的阳性转化子在45℃条件下转接培养数次后,进行菌落PCR检测,得到ptb基因的上游臂或ptb基因的下游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株;

4)挑选ptb基因的上游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株与ptb基因的下游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于37℃、不含有卡那霉素的培养基中经过数次转接培养,PCR法筛选得到敲除ptb基因的地衣芽胞杆菌DW2△ptb(简称:Bacillus licheniformis DW2△ptb);

其中,步骤(1)和步骤(3)中所述的地衣芽胞杆菌DW2已于2011年10月12日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M2011344;

所述地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA序列中的ptb基因为SEQUENCE LISTING中所示。

2.根据权利要求1所述的一种低异味产杆菌肽地衣芽胞杆菌的构建方法构建得到的地衣芽胞杆菌DW2△ptb

3.根据权利要求2所述的一种低异味产杆菌肽地衣芽胞杆菌的构建方法构建得到的地衣芽胞杆菌DW2△ptb,其保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心,保藏编号CCTCC NO:M 2016598,保藏日期为2016年10 月28日。

4.根据权利要求2所述的一种低异味产杆菌肽地衣芽胞杆菌的构建方法构建得到的敲除ptb基因的地衣芽胞杆菌DW2△ptb在抗菌肽生产中的应用。

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