一种用于NKT细胞培养的融合蛋白、编码基因及应用的制作方法

本发明涉及生物技术及医学领域，具体地，本发明涉及一种用于NKT细胞培养的融合蛋白、编码基因及应用，用以制备高增殖活性、高杀伤活性的NKT细胞。
背景技术：
：癌症发病率从有记录以来，一直呈上升的趋势，特别是过去二三十年以来，以每年3％-5％的速度增长。全球新增癌症病例有近一半出现在亚洲，其中大部分在中国。全国每分钟约6人确诊癌症。近年来，随着分子生物学和免疫学等学科的飞速发展，肿瘤的细胞免疫治疗已成为继手术、放疗、化疗后另一种新的肿瘤治疗模式。细胞免疫治疗作为治疗肿瘤的新技术手段，是通过分离、活化、体外大量培养患者自身的抗肿瘤免疫细胞，再回输到患者体内，用患者自身的肿瘤杀伤细胞去消灭肿瘤。该治疗方法以安全有效、副作用小、提高机体免疫力、杀伤微小残留癌细胞、预防肿瘤复发转移等特点在临床应用上得到大力发展。此类免疫细胞的种类包括细胞因子诱导的杀伤性细胞(CIK细胞)，自然杀伤细胞(NK细胞)，肿瘤浸润的淋巴细胞(TIL)，细胞毒性淋巴细胞(CTL细胞)等。传统意义上我们认为免疫系统中主要的直接对抗肿瘤的细胞有两种，即NK细胞和T细胞，而NKT细胞是NK细胞和T细胞的综合体，同时具有NK细胞的非特异性杀伤功能和T细胞的特异性杀伤功能。NKT细胞的主要特征为T细胞受体(TCR)基因表达的恒定性、CD1d的限制性以及细胞因子产生的迅速、高水平性。NKT细胞既能增强免疫反应又能抑制免疫反应，从而在抗肿瘤、抗感染、抑制自身免疫性疾病及移植耐受中发挥重要作用。细胞间粘附分子-1(intercellularcelladhesionmolecule-1，ICAM1-1)是一种重要的细胞粘附分子，是介导细胞与细胞或细胞与外基质间相互接触和结合的膜表面糖蛋白。细胞黏连，生长，迁移，分化，凋亡的过程中扮演重要角色，且在伤口愈合，免疫应答，胚胎发育，肿瘤转移等一系列过程中至关重要。Rothlein等于1986年在研究淋巴细胞粘附时第一次发现ICAM1-1促黏连的作用。ICAM-1的分子量介于76-114kDa,其中核心区域为55kDa。黏附因子多以受体配体结合的形式发挥作用。淋巴细胞功能相关抗原-1(lymphocytefunctionalantigen-1，LFA-1)是ICAM1-1的主要受体。经文献查询和序列比对，ICAM1-1N段Q28-T207的180个氨基酸为主要功能序列，在ICAM1-1与LFA-1分子结合过程中发挥关键作用并保持了其生物活性。纤连蛋白(fibronectin，FN)是一种位于细胞外基质中的多功能高分子糖蛋白，分子量约440KD。FN广泛存在于动物组织和组织液中，并在进化过程中保守性很强。FN的表达，降解和组织结构的异常与一系列生理病变相关，包括癌症,糖尿病及纤维症。在FN的多功能中，其重要功能之一是促进细胞的黏连生长。细胞的黏连是机体结构得以维持，细胞生长的必要条件。FN因此作为细胞培养的基质，促进多种细胞的贴壁。由于FN分子量大，全分子表达存在基因工程上的困难,因此FN多以功能多肽的形式被研究。美国专利第5198423号中指出FN含有三个关键的功能结构域，即细胞结合域(cellbindingdomain)、肝素结合域(heparindomain)和CS-1区域。该多肽可参与细胞黏附，分化增值的主要生理功能。该多肽能够与T细胞表面的整合素家族成员相结合，同时加入抗CD3抗体与T细胞的抗原受体相结合，两者共同作用激活酪氨酸激酶pp125FAK，然后通过Ras途径刺激T细胞的增殖和分化。在现有的外周血淋巴细胞制备方法中，淋巴细胞体外增殖的效率十分关键。如何提高外周血单个核细胞体外扩增效率依然是目前本领域尚待优化的主要问题。另一方面，NKT细胞中主要的效应是CD3/CD56双阳性细胞，因此在提高细胞增殖数量的基础上，提高CD3/CD56双阳性细胞的比例显得同样重要。技术实现要素：针对现有技术中外周血单个核细胞(PBMC)体外扩增效率及NKT细胞中CD3/CD56双阳性细胞所占比例均偏低的问题，本发明提供一种用于NKT细胞培养的融合蛋白、编码基因及应用，用以提高人体外周血单个核细胞体外扩增效率和NKT细胞中CD3/CD56双阳性细胞所占比例。本发明的目的通过以下技术手段得以实现：提供一种用于NKT细胞培养的融合蛋白，是如下a)或b)的蛋白：a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)在序列表中序列2的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与用于NKT细胞培养的由a)衍生的蛋白质。本发明还提供所述融合蛋白的编码基因。本发明提供的所述编码基因是如下1)或2)或3)的基因：1)其核苷酸序列是序列表中序列1；2)在严格条件下与序列1限定的DNA片段杂交且编码与用于NKT细胞培养相关蛋白的DNA分子；3)与1)或2)的基因具有90％以上的同源性，且编码与用于NKT细胞培养相关蛋白的DNA分子。本发明还提供所述编码基因的重组表达载体。本发明还提供所述融合蛋白、所述编码基因、所述重组表达载体在NKT细胞培养中的应用。本发明还提供一种人NKT细胞的体外制备方法，包括如下步骤：S100、包被细胞培养瓶：用杜氏磷酸盐缓冲液配制包被液，所述包被液包括CD3单克隆抗体1-10μg/ml、如权利要求1中所述的融合蛋白5-25μg/ml；将所述包被液加入培养瓶中避光放置8-24h；S200、单个核细胞的制备：抽取人体外周血，使用淋巴细胞分离液分离得到单个核细胞，使用含有自体血浆、人CD3单克隆抗体的淋巴培养液重悬细胞得到细胞悬液；S300、NKT细胞的诱导扩增：移除包被液，加入所述细胞悬液至细胞培养瓶后，添加细胞因子形成持续的刺激，置于CO2饱和湿度培养箱中培养获得NKT细胞。在本发明提供的人NKT细胞的体外制备方法中，所述步骤S100中，所述包被液中所述融合蛋白的浓度为10-15μg/ml、所述人CD3单克隆抗体的浓度为4-7μg/ml；取包被液10ml，加入到75cm2培养瓶中，4℃避光放置过夜，备用。在本发明提供的人NKT细胞的体外制备方法中，所述步骤S200中，所述单个核细胞用DPBS清洗两次，显微镜下观察计数，使用含5％自体血浆、50ng/ml人CD3单克隆抗体的淋巴细胞培养液GT-T551重悬细胞，调节细胞密度3×106个/ml。在本发明提供的人NKT细胞的体外制备方法中，所述步骤S300包括如下步骤：S301、移除包被液，用10mlDPBS轻轻漂洗一次，再用10mlGT-T551轻轻漂洗一次；S302、加入所述细胞悬液至该培养瓶，然后加入重组人干扰素-γ至终浓度为500-1000IU/ml，置于37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中培养24h；S303、分别加入重组人白介素-2至终浓度为500-1000IU/ml、重组人白介素12至终浓度5-50ng/ml、白介素15至终浓度5-50ng/ml；之后每3天向该细胞培养瓶中补加细胞培养液，补加的细胞培养液为含有0.5％自体血浆、50ng/ml的人CD3单克隆抗体、1000IU/ml重组人白介素-2、10ng/ml重组人白介素12、10ng/ml重组人白介素15的GT-T551培养基。在本发明提供的人NKT细胞的体外制备方法中，所述步骤S303中，分别加入重组人白介素-2至终浓度为1000IU/ml、重组人白介素12至终浓度10ng/ml、白介素15至终浓度10ng/ml。本发明的融合蛋白ICAM1-FN用于NKT细胞培养，并在细胞培养全过程中加入人CD3单克隆抗体，重组人白介素2，白介素12，白介素15，更好的刺激了淋巴细胞的增殖，同时提高CD3/CD56双阳性细胞所占比例，从而使得外周血单个核细胞体外扩增效率是传统方法的2倍，所得细胞中CD3/CD56双阳性细胞所占比例是传统方法的2-10倍，增强了NKT细胞的杀瘤活性，本发明的NKT细胞制备方法相对于传统方法杀瘤活性提高15-35％。附图说明图1为IPTG诱导前后及不同浓度IPTG诱导的BL21表达的ICAM1-FN融合蛋白的SDS-PAGE电泳图；A为纯化前，B为纯化后；图2为ICAM1-FN融合蛋白表达的WesternBlot检测结果；图3为实施例1中NKT细胞生长曲线；图4为PI染色检测NKT细胞活率的流式细胞检测图谱；图5为实施例1和对比实施例1中得到的NKT细胞的表型流式细胞检测图谱；其中，A为对比实施例1中得到的NKT检测结果；B为实施例1得到的NKT检测结果；图6为实施例(A)和对比例(B)中得到的NKT细胞的杀瘤活性检测结果图；其中，A为对比实施例1中得到的NKT杀伤效率；B为实施例1得到的NKT杀伤效率。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明的实施方案中构建了人细胞间粘附分子-1(ICAM1-1)功能结构域(Q28-T207)和人纤连蛋白(Fibronectin)功能结构域的融合蛋白ICAM1-FN，并在大肠杆菌BL21进行表达纯化。经优化剂量的重组ICAM1-FN蛋白与人源CD3单克隆抗体包被细胞培养瓶，用于培养人体外周血分离出的单个核细胞。在单个核细胞(PBMC)的培养过程中，于细胞培养液中加入少于包被浓度的人CD3单克隆抗体进行持续刺激。诱导10-13天后得到NKT细胞，检测并确定各项指标均可达到NKT细胞标准。本发明的实施方案中重组ICAM1-FN蛋白遵循分子克隆指南，本发明实施例提供一种人NKT细胞的体外制备方法，包括一种在NKT细胞的前体细胞培养前用中含有有效量的ICAM1-FN融合蛋白和人CD3单克隆抗体的包被液包被细胞培养瓶的步骤，和在所述人细胞因子诱导的杀伤细胞的诱导及培养全过程中在细胞培养液中添加人CD3单克隆抗体，重组人白介素2，白介素12，白介素15的步骤；其中所述融合蛋白为人细胞间粘附分子-1(ICAM-1)功能结构域和人纤连蛋白(Fibronectin)功能结构域融合蛋白。所述人CD3单克隆抗体在所述细胞培养液中的浓度低于在所述包被液中的浓度。本发明的NKT细胞制备方法在包被阶段引入了融合蛋白ICAM1-FN，使淋巴细胞在贴壁生长中得到有效的刺激。本发明且在细胞培养全过程中加入人CD3单克隆抗体，重组人白介素2，白介素12，白介素15，以形成持续的诱导刺激。该实施例方法优化了外周血单个核细胞体外扩增效率以及得到的NKT细胞中CD3/CD56双阳性细胞所占比例。因而增强了NKT细胞的杀瘤活性，有希望提高细胞免疫治疗的效果。优选地，本发明实施例的人NKT细胞体外制备方法中，所述细胞培养瓶的包被液中，所述融合蛋白浓度为5-25μg/ml，优选浓度为10-15μg/ml，所述人CD3单克隆抗体浓度为1-10μg/ml，优选浓度为4-7μg/ml，最优选浓度为5μg/ml。重组人白介素2的浓度为500-1000IU/ml，最优选浓度为1000IU/ml，白介素12的浓度为5-50ng/ml，最优选浓度为10ng/ml，白介素15的浓度为5-50ng/ml，最优选浓度为10ng/ml。优选地，NKT细胞体外制备中，所述细胞培养液中人CD3单克隆抗体浓度为50-100ng/ml。优选地，本发明实施例的人NKT细胞体外制备方法中，所述融合蛋白中人细胞间粘附分子-1功能结构域(ICAM1-1)和人纤连蛋白功能结构域(FN)通过柔性肽连接，所述柔性肽序列为GGGGSGGGGS。优选地，本发明实施例的人NKT细胞体外制备方法中，所述含有柔性肽的人细胞间粘附分子-1功能结构域和人纤连蛋白功能结构域的融合蛋白的DNA序列为序列表中序列2。具体序列如下，其中下划线且加大部分为柔性肽GGGGSGGGGS的cDNA序列：ATGGCTCCCAGCAGCCCCCGGCCCGCGCTGCCCGCACTCCTGGTCCTGCTCGGGGCTCTGTTCCCAGGACCTGGCAATGCCCAGACATCTGTGTCCCCCTCAAAAGTCATCCTGCCCCGGGGAGGCTCCGTGCTGGTGACATGCAGCACCTCCTGTGACCAGCCCAAGTTGTTGGGCATAGAGACCCCGTTGCCTAAAAAGGAGTTGCTCCTGCCTGGGAACAACCGGAAGGTGTATGAACTGAGCAATGTGCAAGAAGATAGCCAACCAATGTGCTATTCAAACTGCCCTGATGGGCAGTCAACAGCTAAAACCTTCCTCACCGTGTACTGGACTCCAGAACGGGTGGAACTGGCACCCCTCCCCTCTTGGCAGCCAGTGGGCAAGAACCTTACCCTACGCTGCCAGGTGGAGGGTGGGGCACCCCGGGCCAACCTCACCGTGGTGCTGCTCCGTGGGGAGAAGGAGCTGAAACGGGAGCCAGCTGTGGGGGAGCCCGCTGAGGTCACGACCACGGTGCTGGTGAGGAGAGATCACCATGGAGCCAATTTCTCGTGCCGCACTGAACTGGACCTGCGGCCCCAAGGGCTGGAGCTGTTTGAGAACACCTCGGCCCCCTACCTTAGGGGTCCGGGGCCCGGGCTGCTGCTGCTGGCCGTCCTGTGCCTGGGGACAGCGGTGCCCTCCACGGGAGCCTCGAAGAGCAAGAGGCAGGCTCAGCAAATGGTTCAGCCCCAGTCCCCGGTGGCTGTCAGTCAAAGCAAGCCCGGTTGTTATGACAATGGAAAACACTATCAGATAAATCAACAGTGGGAGCGGACCTACCTAGGCAATGCGTTGGTTTGTACTTGTTATGGAGGAAGCCGAGGTTTTAACTGCGAGAGTAAACCTGAAGCTGAAGAGACTTGCTTTGACAAGTACACTGGGAACACTTACCGAGTGGGTGACACTTATGAGCGTCCTAAAGACTCCATGATCTGGGACTGTACCTGCATCGGGGCTGGGCGAGGGAGAATAAGCTGTACCATCGCAAACCGCTGCCATGAAGGGGGTCAGTCCTACAAGATTGGTGACACCTGGAGGAGACCACATGAGACTGGTGGTTACATGTTAGAGTGTGTGTGTCTTGGTAATGGAAAAGGAGAATGGACCTGCAAGCCCATAGCTGAGAAGTGTTTTGATCATGCTGCTGGGACTTCCTATGTGGTCGGAGAAACGTGGGAGAAGCCCTACCAAGGCTGGATGATGGTAGATTGTACTTGCCTGGGAGAAGGCAGCGGACGCATCACTTGCACTTCTAGAAATAGATGCAACGATCAGGACACAAGGACATCCTATAGAATTGGAGACACCTGGAGCAAGAAGGATAATCGAGGAAACCTGCTCCAGTGCATCTGCACAGGCAACGGCCGAGGAGAGTGGAAGTGTGAGAGGCACACCTCTGTGCAGACCACATCGAGCGGATCTGGCCCCTTCACCGATGTTCGTGCAGCTGTTTACCAACCGCAGCCTCACCCCCAGCCTCCTCCCTATGGCCACTGTGTCACAGACAGTGGTGTGGTCTACTCTGTGGGGATGCAGTGGCTGAAGACACAAGGAAATAAGCAAATGCTTTGCACGTGCCTGGGCAACGGAGTCAGCTGCCAAGAGACAGCTGTAACCCAGACTTACGGTGGCAACTCAAATGGAGAGCCATGTGTCTTACCATTCACCTACAATGGCAGGACGTTCTACTCCTGCACCACAGAAGGGCGACAGGACGGACATCTTTGGTGCAGCACAACTTCGAATTATGAGCAGGACCAGAAATACTCTTTCTGCACAGACCACACTGTTTTGGTTCAGACTCGAGGAGGAAATTCCAATGGTGCCTTGTGCCACTTCCCCTTCCTATACAACAACCACAATTACACTGATTGCACTTCTGAGGGCAGAAGAGACAACATGAAGTGGTGTGGGACCACACAGAACTATGATGCCGACCAGAAGTTTGGGTTCTGCCCCATGGCTGCCCACGAGGAAATCTGCACAACCAATGAAGGGGTCATGTACCGCATTGGAGATCAGTGGGATAAGCAGCATGACATGGGTCACATGATGAGGTGCACGTGTGTTGGGAATGGTCGTGGGGAATGGACATGCATTGCCTACTCGCAGCTTCGAGATCAGTGCATTGTTGATGACATCACTTACAATGTGAACGACACATTCCACAAGCGTCATGAAGAGGGGCACATGCTGAACTGTACATGCTTCGGTCAGGGTCGGGGCAGGTGGAAGTGTGATCCCGTCGACCAATGCCAGGATTCAGAGACTGGGACGTTTTATCAAATTGGAGATTCATGGGAGAAGTATGTGCATGGTGTCAGATACCAGTGCTACTGCTATGGCCGTGGCATTGGGGAGTGGCATTGCCAACCTTTACAGACCTATCCAAGCTCAAGTGGTCCTGTCGAAGTATTTATCACTGAGACTCCGAGTCAGCCCAACTCCCACCCCATCCAGTGGAATGCACCACAGCCATCTCACATTTCCAAGTACATTCTCAGGTGGAGACCTGTGAGTATCCCACCCAGAAACCTTGGATAC优选地，在所述融合蛋白的构建过程中，所述人细胞间粘附分子-1及人纤连蛋白由PCR法得到拼接到一起的目的基因序列为序列表中序列1。具体序列如下：MAPSSPRPALPALLVLLGALFPGPGNAQTSVSPSKVILPRGGSVLVTCSTSCDQPKLLGIETPLPKKELLLPGNNRKVYELSNVQEDSQPMCYSNCPDGQSTAKTFLTVYWTPERVELAPLPSWQPVGKNLTLRCQVEGGAPRANLTVVLLRGEKELKREPAVGEPAEVTTTVLVRRDHHGANFSCRTELDLRPQGLELFENTSAPYGGGGSGGGGSLRGPGPGLLLLAVLCLGTAVPSTGASKSKRQAQQMVQPQSPVAVSQSKPGCYDNGKHYQINQQWERTYLGNALVCTCYGGSRGFNCESKPEAEETCFDKYTGNTYRVGDTYERPKDSMIWDCTCIGAGRGRISCTIANRCHEGGQSYKIGDTWRRPHETGGYMLECVCLGNGKGEWTCKPIAEKCFDHAAGTSYVVGETWEKPYQGWMMVDCTCLGEGSGRITCTSRNRCNDQDTRTSYRIGDTWSKKDNRGNLLQCICTGNGRGEWKCERHTSVQTTSSGSGPFTDVRAAVYQPQPHPQPPPYGHCVTDSGVVYSVGMQWLKTQGNKQMLCTCLGNGVSCQETAVTQTYGGNSNGEPCVLPFTYNGRTFYSCTTEGRQDGHLWCSTTSNYEQDQKYSFCTDHTVLVQTRGGNSNGALCHFPFLYNNHNYTDCTSEGRRDNMKWCGTTQNYDADQKFGFCPMAAHEEICTTNEGVMYRIGDQWDKQHDMGHMMRCTCVGNGRGEWTCIAYSQLRDQCIVDDITYNVNDTFHKRHEEGHMLNCTCFGQGRGRWKCDPVDQCQDSETGTFYQIGDSWEKYVHGVRYQCYCYGRGIGEWHCQPLQTYPSSSGPVEVFITETPSQPNSHPIQWNAPQPSHISKYILRWRPVSIPPRNLGY使用三字母表示氨基酸，则具体序列如下：MetAlaProSerSerProArgProAlaLeuProAlaLeuLeuValLeuLeuGlyAlaLeuPheProGlyProGlyAsnAlaGlnThrSerValSerProSerLysValIleLeuProArgGlyGlySerValLeuValThrCysSerThrSerCysAspGlnProLysLeuLeuGlyIleGluThrProLeuProLysLysGluLeuLeuLeuProGlyAsnAsnArgLysValTyrGluLeuSerAsnValGlnGluAspSerGlnProMetCysTyrSerAsnCysProAspGlyGlnSerThrAlaLysThrPheLeuThrValTyrTrpThrProGluArgValGluLeuAlaProLeuProSerTrpGlnProValGlyLysAsnLeuThrLeuArgCysGlnValGluGlyGlyAlaProArgAlaAsnLeuThrValValLeuLeuArgGlyGluLysGluLeuLysArgGluProAlaValGlyGluProAlaGluValThrThrThrValLeuValArgArgAspHisHisGlyAlaAsnPheSerCysArgThrGluLeuAspLeuArgProGlnGlyLeuGluLeuPheGluAsnThrSerAlaProTyrGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerLeuArgGlyProGlyProGlyLeuLeuLeuLeuAlaValLeuCysLeuGlyThrAlaValProSerThrGlyAlaSerLysSerLysArgGlnAlaGlnGlnMetValGlnProGlnSerProValAlaValSerGlnSerLysProGlyCysTyrAspAsnGlyLysHisTyrGlnIleAsnGlnGlnTrpGluArgThrTyrLeuGlyAsnAlaLeuValCysThrCysTyrGlyGlySerArgGlyPheAsnCysGluSerLysProGluAlaGluGluThrCysPheAspLysTyrThrGlyAsnThrTyrArgValGlyAspThrTyrGluArgProLysAspSerMetIleTrpAspCysThrCysIleGlyAlaGlyArgGlyArgIleSerCysThrIleAlaAsnArgCysHisGluGlyGlyGlnSerTyrLysIleGlyAspThrTrpArgArgProHisGluThrGlyGlyTyrMetLeuGluCysValCysLeuGlyAsnGlyLysGlyGluTrpThrCysLysProIleAlaGluLysCysPheAspHisAlaAlaGlyThrSerTyrValValGlyGluThrTrpGluLysProTyrGlnGlyTrpMetMetValAspCysThrCysLeuGlyGluGlySerGlyArgIleThrCysThrSerArgAsnArgCysAsnAspGlnAspThrArgThrSerTyrArgIleGlyAspThrTrpSerLysLysAspAsnArgGlyAsnLeuLeuGlnCysIleCysThrGlyAsnGlyArgGlyGluTrpLysCysGluArgHisThrSerValGlnThrThrSerSerGlySerGlyProPheThrAspValArgAlaAlaValTyrGlnProGlnProHisProGlnProProProTyrGlyHisCysValThrAspSerGlyValValTyrSerValGlyMetGlnTrpLeuLysThrGlnGlyAsnLysGlnMetLeuCysThrCysLeuGlyAsnGlyValSerCysGlnGluThrAlaValThrGlnThrTyrGlyGlyAsnSerAsnGlyGluProCysValLeuProPheThrTyrAsnGlyArgThrPheTyrSerCysThrThrGluGlyArgGlnAspGlyHisLeuTrpCysSerThrThrSerAsnTyrGluGlnAspGlnLysTyrSerPheCysThrAspHisThrValLeuValGlnThrArgGlyGlyAsnSerAsnGlyAlaLeuCysHisPheProPheLeuTyrAsnAsnHisAsnTyrThrAspCysThrSerGluGlyArgArgAspAsnMetLysTrpCysGlyThrThrGlnAsnTyrAspAlaAspGlnLysPheGlyPheCysProMetAlaAlaHisGluGluIleCysThrThrAsnGluGlyValMetTyrArgIleGlyAspGlnTrpAspLysGlnHisAspMetGlyHisMetMetArgCysThrCysValGlyAsnGlyArgGlyGluTrpThrCysIleAlaTyrSerGlnLeuArgAspGlnCysIleValAspAspIleThrTyrAsnValAsnAspThrPheHisLysArgHisGluGluGlyHisMetLeuAsnCysThrCysPheGlyGlnGlyArgGlyArgTrpLysCysAspProValAspGlnCysGlnAspSerGluThrGlyThrPheTyrGlnIleGlyAspSerTrpGluLysTyrValHisGlyValArgTyrGlnCysTyrCysTyrGlyArgGlyIleGlyGluTrpHisCysGlnProLeuGlnThrTyrProSerSerSerGlyProValGluValPheIleThrGluThrProSerGlnProAsnSerHisProIleGlnTrpAsnAlaProGlnProSerHisIleSerLysTyrIleLeuArgTrpArgProValSerIleProProArgAsnLeuGlyTyr以下结合具体实施例对本发明的实现进行详细描述。实施例11.ICAM1-FN质粒的构建根据人的ICAM1-1和FN基因序列，设计两对引物：人ICAM1-1的正向引物P1，反向引物P2；人FN的正向引物P3，反向引物P4。并通过两步PCR获得目的基因序列。引物序列如下：ICAM1-F：5′-CATCATCATCATCATCAGACATCTGTGTCCCC-3′ICAM1-R:5′–GTAGGGGGCCGAGGTGTT-CT-3′FN-F:5′-CTTAGGGGTCCGGGGCCCGG-GCT-3′FN-R:5′-AGACTGCAGGTCGACGTATCCAAGGTTTCTGGGTGGGATACTC-3′ICAM1-F引物5’端引入NdeI酶切位点(下划线且斜体部分)，ICAM1-R引物5’端引入编码柔性肽的cDNA(下划线加粗部分)，以含有人ICAM1-1cDNA序列的质粒(购自Origene)为模板。FN-F引物5’端引入柔性肽GGGGSGGGGS的cDNA序列(下划线加粗部分)，FN-R引物5’端引入HindIII酶切位点(下划线且斜体部分)，以购自Origene的质粒为模板，扩增人FN的功能区域。所得两段基因序列分别以ICAM1和FN命名。通过常规PCR得到。。PCR反应体系如下:DNA模板20ng，100nM正向引物，100nM反向引物，Taq聚合酶0.5μl，缓冲液5μl，10mMdNTP，双蒸水至50μl。PCR反应条件如下：95度5分钟，(94度30秒，57度30秒，72度45秒)，2-34循环，72度10分钟，4度保存目的基因。ICAM1-FN与pGEM-T载体连接，构建得到pGEMT-ICAM1-FN质粒。重组质粒在E.coliDH5a感受态细胞(Promega)中进行转化孵育，再通过氨苄青霉素筛选处理后于含有氨苄青霉素的培养基中再次孵育。用ICAM-1-F和FN-R引物对菌液进行PCR鉴定，PCR结束经琼脂糖凝胶电泳检测，具有目的基因条带的菌液为阳性菌液，保存菌种，对质粒进行测序鉴定。2.表达载体pColdII-ICAM1-FN的构建及ICAM1-FN的表达用内切酶NdeI、HindIII将ICAM-FN融合蛋白从质粒pGEMT-ICAM1-FN中切除并克隆至pColdII质粒，以用于蛋白表达。重组质粒在感受态细胞BL21(DE)中进行转化孵育。用ICAM-1-F和FN-R引物对菌液进行PCR鉴定并测序鉴定。经测序鉴定的阳性菌接种至含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，培养至OD600达到0.6时加入0.1-1mM的IPTG进行低温(15℃)诱导表达。分别在诱导前和诱导3h时取样1ml，用于目的蛋白表达的检测。3.目的蛋白的表达及鉴定收集诱导前和诱导3h的菌液各1ml，10000g，4℃，离心5min收集细胞沉淀，菌体沉淀用80μl细菌裂解液重悬，在样品中加入蛋白上样缓冲液，沸水浴10min制备蛋白样品。蛋白上样于8％蛋白胶，目的蛋白分子量约为83kDa.蛋白胶(SDS-PAGE)结果见图1A.如图1A所示，目的蛋白以可溶蛋白形式表达。在不同浓度的IPTG诱导下表达量不同。最终选用0.5mMIPTG诱导3h,为目的蛋白表达的诱导条件。按照上述处理蛋白，进行western-blot(免疫印迹)检测。检测结果见图2。阳性菌对应孔道在分子量83kD处有条带，而空白对照菌孔道无相应条带。4.重组ICAM1-FN的纯化取转入重组质粒pColdII-ICAM1-FN的阳性菌液10000g，4℃，离心5min，收集菌体。菌体重悬于细菌裂解液，冰浴超声裂解菌体至菌液变澄清。将超声破碎后的菌体悬液12000g，4℃，离心10min，收集上清液，上样，用Ni2+-NTA柱亲和层析纯化目的蛋白，并先后用25和300mmol/L的咪唑进行洗脱。最终以pH7.5的PB进行透析，0.22μm的滤膜进行过滤除菌，4℃保存备用。将纯化后的目的蛋白样品进行SDS-PAGE检测，检测结果见图1B。5.NKT细胞的制备杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS)中加入含人CD3单克隆抗体5μg/ml，ICAM1-FN融合蛋白10μg/ml配置包被液。取包被液10ml，加入到75cm2培养瓶中，4℃避光放置过夜，备用。抽取健康志愿者外周血50ml，肝素抗凝，室温离心(700g，20分)；吸取上层血浆，置于水浴锅中56℃、30分。然后4℃静止15分后，离心(900g，30分)，取自体血浆4℃保存备用。取上述700g，20分离心后下部细胞成分，加入D-PBS至50ml，混匀，缓慢加到2个装有20ml人淋巴细胞分离液的50ml离心管中，室温离心(800g，15分)。吸取白膜层细胞，加入到装有5ml的RPMI1640的50ml离心管中。加入RPMI1640至总体积为50ml，离心(600g，10分钟)，弃上清。再次加入50mlRPMI，离心(600g，10分钟)，弃上清。最后用含5％的上述制备的血浆、50ng/ml人CD3单克隆抗体的淋巴细胞培养液GT-T551重悬细胞，调节细胞密度3×106个/ml。将包被过夜的75cm2培养瓶弃掉包被液，用10mlDPBS和10mlGT-T551各漂洗一次。并将上述得到的细胞悬液加入该75cm2培养瓶，然后加入终浓度为1000IU/ml的重组人干扰素-γ(INF-γ)，放入培养箱24h。24小时候分别加入加入：终浓度为1000IU/ml的重组人白介素-2(IL-2)，终浓度10ng/ml的重组人白介素12(IL-12)，终浓度10ng/ml的白介素15(IL-15)。并每3天向该细胞培养瓶中补含有GT-T551培养基，5％自体血浆，50ng/ml的人CD3单克隆抗体、1000IU/ml重组人白介素-2(IL-2)、10ng/ml重组人白介素12(IL-12)、10ng/ml重组人白介素15(IL-15)的细胞培养液。6.NKT细胞各项指标检测细胞增殖分别于第0d、4d、8d、10d、12d对上述步骤中培养的细胞取样，进行细胞计数，绘制细胞增殖曲线如图3所示。于第12d对上述培养的细胞经荧光染料PI(碘化丙啶)染色，通过流式细胞检测得到NKT细胞的活率达到96％以上。检测结果如图4所示。于第12d对上述培养的细胞进行淋巴细胞表型检测，检查CD3+/CD56+细胞比例。BDCalibur流式细胞仪进行的检测结果如图5所示。上述步骤中第12d得到的NKT细胞与被CFSE(羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯)染色的肿瘤细胞K562混合培养一段时间后，用PI进行染色，其中CFSE和PI双标记的细胞即为NKT细胞杀伤的肿瘤细胞。检测结果如图6所示。对比实施例1步骤1-4同实施例1。NKT细胞的制备过程中仅包被液成分与实施例不同。具体包被方法如下：取含有人CD3单克隆抗体5μg/ml及人FN活性片段10μg/ml的DPBS包被液10ml，加入到75cm2培养瓶中，4℃避光放置过夜，备用。实验结果(1)细胞增殖检测实施例1和对比实施例1中的细胞取样计数结果如表1所示。绘制细胞生长曲线，如图3所示。表1D0(*108)D5(*108)D8(*108)D10(*108)D12(*108)实施例10.31.10±0.1523.15±2.87143.68±4.92365.49±7.36对比实施例10.30.63±0.1220.81±4.7888.32±4.29224.37±7.90由表1及图3可看出，本发明的方法制备的NKT细胞平均增殖倍数是1418.3±19.76；传统方法制备的NKT细胞平均增殖倍数是747.9±18.40。本发明的方法制备的NKT细胞增殖活力明显高于传统方法，约为传统方法的2倍。(2)细胞死亡率检测实施例1中的细胞取样经荧光染料PI(碘化丙啶)染色，通过流式细胞检测得到NKT细胞的活率达到96％以上，如图4所示。(3)细胞表型检测细胞表型的流式细胞仪检测结果见图5。本发明的方法制备的NKT细胞表型结果为：CD3+/CD56+T细胞比例为70-80％(图5右，Data002)，传统方法制备的NKT中CD3+/CD56+T细胞比例为30-40％(图5左，Data001)。(4)NKT细胞杀瘤活性用BDCalibur流式细胞仪检测分别由本发明的方法(实施例1)和传统方法(对比实施例1)制备的NKT的杀瘤活性，检测结果见图6。在效靶比1：1的条件下，本发明的方法制备的NKT细胞杀瘤率为30-40％，传统方法的NKT细胞杀瘤率为10-20％。本发明提供的细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法显著增加了外周血单个核细胞体外扩增效率及NKT细胞中CD3/CD56双阳性细胞所占比例，同时也提高了NKT细胞中CD3/CD8细胞的比例，并增强了NKT细胞的杀瘤活性。以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>深圳中健生物技术有限公司<120>一种用于NKT细胞培养的融合蛋白、编码基因及应用<130><160>2<210>1<211>2619<212>DNA<213>人工序列<400>1ATGGCTCCCAGCAGCCCCCGGCCCGCGCTGCCCGCACTCCTGGTCCTGCTCGGGGCTCTG60TTCCCAGGACCTGGCAATGCCCAGACATCTGTGTCCCCCTCAAAAGTCATCCTGCCCCGG120GGAGGCTCCGTGCTGGTGACATGCAGCACCTCCTGTGACCAGCCCAAGTTGTTGGGCATA180GAGACCCCGTTGCCTAAAAAGGAGTTGCTCCTGCCTGGGAACAACCGGAAGGTGTATGAA240CTGAGCAATGTGCAAGAAGATAGCCAACCAATGTGCTATTCAAACTGCCCTGATGGGCAG300TCAACAGCTAAAACCTTCCTCACCGTGTACTGGACTCCAGAACGGGTGGAACTGGCACCC360CTCCCCTCTTGGCAGCCAGTGGGCAAGAACCTTACCCTACGCTGCCAGGTGGAGGGTGGG420GCACCCCGGGCCAACCTCACCGTGGTGCTGCTCCGTGGGGAGAAGGAGCTGAAACGGGAG480CCAGCTGTGGGGGAGCCCGCTGAGGTCACGACCACGGTGCTGGTGAGGAGAGATCACCAT540GGAGCCAATTTCTCGTGCCGCACTGAACTGGACCTGCGGCCCCAAGGGCTGGAGCTGTTT600GAGAACACCTCGGCCCCCTACGGCGGTGGCGGTAGCGGTGGTGGTGGTTCTCTTAGGGGT660CCGGGGCCCGGGCTGCTGCTGCTGGCCGTCCTGTGCCTGGGGACAGCGGTGCCCTCCACG720GGAGCCTCGAAGAGCAAGAGGCAGGCTCAGCAAATGGTTCAGCCCCAGTCCCCGGTGGCT780GTCAGTCAAAGCAAGCCCGGTTGTTATGACAATGGAAAACACTATCAGATAAATCAACAG840TGGGAGCGGACCTACCTAGGCAATGCGTTGGTTTGTACTTGTTATGGAGGAAGCCGAGGT900TTTAACTGCGAGAGTAAACCTGAAGCTGAAGAGACTTGCTTTGACAAGTACACTGGGAAC960ACTTACCGAGTGGGTGACACTTATGAGCGTCCTAAAGACTCCATGATCTGGGACTGTACC1020TGCATCGGGGCTGGGCGAGGGAGAATAAGCTGTACCATCGCAAACCGCTGCCATGAAGGG1080GGTCAGTCCTACAAGATTGGTGACACCTGGAGGAGACCACATGAGACTGGTGGTTACATG1140TTAGAGTGTGTGTGTCTTGGTAATGGAAAAGGAGAATGGACCTGCAAGCCCATAGCTGAG1200AAGTGTTTTGATCATGCTGCTGGGACTTCCTATGTGGTCGGAGAAACGTGGGAGAAGCCC1260TACCAAGGCTGGATGATGGTAGATTGTACTTGCCTGGGAGAAGGCAGCGGACGCATCACT1320TGCACTTCTAGAAATAGATGCAACGATCAGGACACAAGGACATCCTATAGAATTGGAGAC1380ACCTGGAGCAAGAAGGATAATCGAGGAAACCTGCTCCAGTGCATCTGCACAGGCAACGGC1440CGAGGAGAGTGGAAGTGTGAGAGGCACACCTCTGTGCAGACCACATCGAGCGGATCTGGC1500CCCTTCACCGATGTTCGTGCAGCTGTTTACCAACCGCAGCCTCACCCCCAGCCTCCTCCC1560TATGGCCACTGTGTCACAGACAGTGGTGTGGTCTACTCTGTGGGGATGCAGTGGCTGAAG1620ACACAAGGAAATAAGCAAATGCTTTGCACGTGCCTGGGCAACGGAGTCAGCTGCCAAGAG1680ACAGCTGTAACCCAGACTTACGGTGGCAACTCAAATGGAGAGCCATGTGTCTTACCATTC1740ACCTACAATGGCAGGACGTTCTACTCCTGCACCACAGAAGGGCGACAGGACGGACATCTT1800TGGTGCAGCACAACTTCGAATTATGAGCAGGACCAGAAATACTCTTTCTGCACAGACCAC1860ACTGTTTTGGTTCAGACTCGAGGAGGAAATTCCAATGGTGCCTTGTGCCACTTCCCCTTC1920CTATACAACAACCACAATTACACTGATTGCACTTCTGAGGGCAGAAGAGACAACATGAAG1980TGGTGTGGGACCACACAGAACTATGATGCCGACCAGAAGTTTGGGTTCTGCCCCATGGCT2040GCCCACGAGGAAATCTGCACAACCAATGAAGGGGTCATGTACCGCATTGGAGATCAGTGG2100GATAAGCAGCATGACATGGGTCACATGATGAGGTGCACGTGTGTTGGGAATGGTCGTGGG2160GAATGGACATGCATTGCCTACTCGCAGCTTCGAGATCAGTGCATTGTTGATGACATCACT2220TACAATGTGAACGACACATTCCACAAGCGTCATGAAGAGGGGCACATGCTGAACTGTACA2280TGCTTCGGTCAGGGTCGGGGCAGGTGGAAGTGTGATCCCGTCGACCAATGCCAGGATTCA2340GAGACTGGGACGTTTTATCAAATTGGAGATTCATGGGAGAAGTATGTGCATGGTGTCAGA2400TACCAGTGCTACTGCTATGGCCGTGGCATTGGGGAGTGGCATTGCCAACCTTTACAGACC2460TATCCAAGCTCAAGTGGTCCTGTCGAAGTATTTATCACTGAGACTCCGAGTCAGCCCAAC2520TCCCACCCCATCCAGTGGAATGCACCACAGCCATCTCACATTTCCAAGTACATTCTCAGG2580TGGAGACCTGTGAGTATCCCACCCAGAAACCTTGGATAC2619<210>2<211>873<212>PRT<213>人工序列<400>2MetAlaProSerSerProArgProAlaLeu10ProAlaLeuLeuValLeuLeuGlyAlaLeu20PheProGlyProGlyAsnAlaGlnThrSer30ValSerProSerLysValIleLeuProArg40GlyGlySerValLeuValThrCysSerThr50SerCysAspGlnProLysLeuLeuGlyIle60GluThrProLeuProLysLysGluLeuLeu70LeuProGlyAsnAsnArgLysValTyrGlu80LeuSerAsnValGlnGluAspSerGlnPro90MetCysTyrSerAsnCysProAspGlyGln100SerThrAlaLysThrPheLeuThrValTyr110TrpThrProGluArgValGluLeuAlaPro120LeuProSerTrpGlnProValGlyLysAsn130LeuThrLeuArgCysGlnValGluGlyGly140AlaProArgAlaAsnLeuThrValValLeu150LeuArgGlyGluLysGluLeuLysArgGlu160ProAlaValGlyGluProAlaGluValThr170ThrThrValLeuValArgArgAspHisHis180GlyAlaAsnPheSerCysArgThrGluLeu190AspLeuArgProGlnGlyLeuGluLeuPhe200GluAsnThrSerAlaProTyrGlyGlyGly210GlySerGlyGlyGlyGlySerLeuArgGly220ProGlyProGlyLeuLeuLeuLeuAlaVal230LeuCysLeuGlyThrAlaValProSerThr240GlyAlaSerLysSerLysArgGlnAlaGln250GlnMetValGlnProGlnSerProValAla260ValSerGlnSerLysProGlyCysTyrAsp270AsnGlyLysHisTyrGlnIleAsnGlnGln280TrpGluArgThrTyrLeuGlyAsnAlaLeu290ValCysThrCysTyrGlyGlySerArgGly300PheAsnCysGluSerLysProGluAlaGlu310GluThrCysPheAspLysTyrThrGlyAsn320ThrTyrArgValGlyAspThrTyrGluArg330ProLysAspSerMetIleTrpAspCysThr340CysIleGlyAlaGlyArgGlyArgIleSer350CysThrIleAlaAsnArgCysHisGluGly360GlyGlnSerTyrLysIleGlyAspThrTrp370ArgArgProHisGluThrGlyGlyTyrMet380LeuGluCysValCysLeuGlyAsnGlyLys390GlyGluTrpThrCysLysProIleAlaGlu400LysCysPheAspHisAlaAlaGlyThrSer410TyrValValGlyGluThrTrpGluLysPro420TyrGlnGlyTrpMetMetValAspCysThr430CysLeuGlyGluGlySerGlyArgIleThr440CysThrSerArgAsnArgCysAsnAspGln450AspThrArgThrSerTyrArgIleGlyAsp460ThrTrpSerLysLysAspAsnArgGlyAsn470LeuLeuGlnCysIleCysThrGlyAsnGly480ArgGlyGluTrpLysCysGluArgHisThr490SerValGlnThrThrSerSerGlySerGly500ProPheThrAspValArgAlaAlaValTyr510GlnProGlnProHisProGlnProProPro520TyrGlyHisCysValThrAspSerGlyVal530ValTyrSerValGlyMetGlnTrpLeuLys540ThrGlnGlyAsnLysGlnMetLeuCysThr550CysLeuGlyAsnGlyValSerCysGlnGlu560ThrAlaValThrGlnThrTyrGlyGlyAsn570SerAsnGlyGluProCysValLeuProPhe580ThrTyrAsnGlyArgThrPheTyrSerCys590ThrThrGluGlyArgGlnAspGlyHisLeu600TrpCysSerThrThrSerAsnTyrGluGln610AspGlnLysTyrSerPheCysThrAspHis620ThrValLeuValGlnThrArgGlyGlyAsn630SerAsnGlyAlaLeuCysHisPheProPhe640LeuTyrAsnAsnHisAsnTyrThrAspCys650ThrSerGluGlyArgArgAspAsnMetLys660TrpCysGlyThrThrGlnAsnTyrAspAla670AspGlnLysPheGlyPheCysProMetAla680AlaHisGluGluIleCysThrThrAsnGlu690GlyValMetTyrArgIleGlyAspGlnTrp700AspLysGlnHisAspMetGlyHisMetMet710ArgCysThrCysValGlyAsnGlyArgGly720GluTrpThrCysIleAlaTyrSerGlnLeu730ArgAspGlnCysIleValAspAspIleThr740TyrAsnValAsnAspThrPheHisLysArg750HisGluGluGlyHisMetLeuAsnCysThr760CysPheGlyGlnGlyArgGlyArgTrpLys770CysAspProValAspGlnCysGlnAspSer780GluThrGlyThrPheTyrGlnIleGlyAsp790SerTrpGluLysTyrValHisGlyValArg800TyrGlnCysTyrCysTyrGlyArgGlyIle810GlyGluTrpHisCysGlnProLeuGlnThr820TyrProSerSerSerGlyProValGluVal830PheIleThrGluThrProSerGlnProAsn840SerHisProIleGlnTrpAsnAlaProGln850ProSerHisIleSerLysTyrIleLeuArg860TrpArgProValSerIleProProArgAsn870LeuGlyTyr873当前第1页1 2 3