一种提高地衣芽胞杆菌外源蛋白分泌水平的方法与流程

地衣芽胞杆菌是近年来被广泛研究的一种革兰氏阳性菌，广泛存在于自然界中，是公认的生物安全性菌株(GRAS)，具有遗传背景清晰，遗传操作简便等特点。其发酵后可以合成多种生物化工产品(聚γ-谷氨酸，杆菌肽，乙偶姻，2,3-丁二醇等)。与此同时，地衣芽胞杆菌具有良好的外源蛋白分泌能力，可作为一种优良的宿主菌用于外源蛋白的生产。

在地衣芽胞杆菌外源蛋白分泌过程中，前体蛋白经过信号肽酶的剪切作用后从而分泌到胞外，而信号肽则残留于细胞膜上，而抑制了前体蛋白进一步分泌到胞外，影响蛋白分泌水平。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明提供了一种提高地衣芽胞杆菌外源蛋白分泌效率的方法。所述方法是在在地衣芽胞杆菌的基础上，通过过表达信号肽肽酶SppA，得到信号肽肽酶过表达菌株，所述菌株能有效提高外源蛋白的分泌量。

本发明的技术方案为：

一种提高地衣芽胞杆菌外源蛋白分泌水平的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

S1，构建信号肽肽酶SppA整合载体，导入地衣芽胞杆菌中，通过同源单双交换，过表达信号肽肽酶SppA，从而得到地衣芽胞杆菌整合菌株；

S2，将外源蛋白的表达质粒电转入S1所述地衣芽胞杆菌整合菌株中，从而得到地衣芽胞杆菌外源蛋白表达菌株；

S3，将S2所述地衣芽胞杆菌外源蛋白表达菌株于种子培养基中进行活化，得到活化的种子液；

S4，将S3中所述种子液于相应外源蛋白液体发酵培养基中进行发酵，即可提高所述外源蛋白分泌水平。

过表达地衣芽胞杆菌中信号肽肽酶SppA的具体步骤为：

1)采用PCR的方法扩增出信号肽肽酶sppA基因所需的上下游同源臂；

2)所述上下游同源臂片段回收纯化后，进行SOE-PCR并回收纯化，酶切，并与相同酶酶切的整合表达质粒T₂(2)-Ori连接，并进行PCR验证，得到信号肽肽酶SppA整合载体；

3)将所述信号肽肽酶SppA整合载体转入地衣芽胞杆菌中。

所述地衣芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌BL10，所述地衣芽胞杆菌BL10(Bacillus licheniformis BL10)保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M2013400，保藏日期为：2013年9月10日，保藏地址为：中国武汉大学。

所述信号肽肽酶sppA基因的DNA序列表为序列表中的SEQ ID NO:1。

所述外源蛋白包括淀粉酶、纳豆激酶、甘露聚糖酶中的一种。

所述淀粉酶、纳豆激酶、甘露聚糖酶的液体发酵培养基分别对应为淀粉酶液体发酵培养基、纳豆激酶液体发酵培养基和甘露聚糖酶液体发酵培养基。

一种淀粉酶液体发酵培养基，其特征在于，所述淀粉酶液体发酵培养基的成分为：5～8g/L玉米浆；5～8g/L酵母粉；6～12g/L蛋白胨；8～14g/L柠檬酸钠；2～3g/L一水合磷酸氢二钾；0.5～2g/L七水合硫酸镁及余量的水；所述淀粉酶液体发酵培养基pH 7.0～7.2。

一种纳豆激酶液体发酵培养基，其特征在于，所述纳豆激酶液体发酵培养基的成分为：10～30g/L葡萄糖；5～20g/L蛋白胨；10～25g/L酵母粉；5～15g/L大豆蛋白胨；5～12g/L氯化钠；3～12g/L硫酸铵及余量的水；所述纳豆激酶液体发酵培养基pH 7.0～7.2。

一种甘露聚糖酶液体发酵培养基，其特征在于，所述甘露聚糖酶液体发酵培养基的成分为：15～30g/L魔芋粉；15～35g/L豆粕；3～8g/L玉米浆；3～8g/L硫酸铵；1～3g/L一水合磷酸二氢钾及余量的水；所述甘露聚糖酶液体发酵培养基pH 7.0～7.4。

所述淀粉酶的表达质粒为pHY-amyL；所述纳豆激酶的表达质粒为pP3SacCNK；所述甘露聚糖酶的表达质粒为pHY-manA。

本发明的技术效果为：

本发明通过过表达地衣芽胞杆菌中信号肽肽酶SppA，信号肽肽酶SppA高效溶解地衣芽胞杆菌细胞膜上被信号肽酶切割后残留的信号肽，从而打通地衣芽胞杆菌源蛋白分泌至胞外的通道，所述方法以淀粉酶、纳豆激酶、甘露聚糖酶为目标蛋白进行研究，发现地衣芽胞杆菌过表达信号肽肽酶SppA后其外源蛋白的分泌量显著提高，分别提高了70％，33％，48.8％，说明对地衣芽胞杆菌过表达信号肽肽酶SppA可以有效提高其外源蛋白的分泌水平；另外本发明所述的外源蛋白发酵培养基营养有效全面，能辅助提高地衣芽胞杆菌外源蛋白分泌水平。

附图说明

图1：sppA过表达载体的构件图(上下游同源臂扩增图)；

其中，泳道1，2：整合基因sppA所扩增的上下游同源臂A和B；泳道3：5K DNA marker(从上到下依次为：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)。

图2：整合载体转化地衣芽胞杆菌BL10菌落PCR验证图；

其中，泳道1：载体构建中的菌落PCR验证胶图，泳道2：5K marker(从上到下依次为：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)，PCR验证所用引物为载体上的验证引物T₂-F/R。

图3：地衣芽胞杆菌BL10中整合sppA的验证胶图；

其中，泳道1：野生菌的双交换验证的菌落PCR胶图，泳道2：工程菌的双交换验证的菌落PCR胶图，泳道3：5Kmarker(从上到下依次为：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)，PCR验证所用引物为双交换验证引物GsppA-KYF/KYR。

图4：淀粉酶表达质粒pHY-amyL转化地衣芽胞杆菌BL10(sppA)菌落PCR验证图；

其中，泳道1：5K marker(从上到下依次为：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；

泳道2：淀粉酶质粒转化BL10(sppA)菌落PCR验证图。

图5：纳豆激酶表达质粒pP3SacCNK转化地衣芽胞杆菌BL10(sppA)菌落PCR验证图；

其中，泳道1：5K marker(从上到下依次为：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；

泳道3：纳豆激酶质粒转换BL10(sppA)菌落PCR验证图。

图6：甘露聚糖酶表达质粒pHY-manA转化地衣芽胞杆菌BL10(sppA)菌落PCR验证图；

其中，泳道1：5K marker(从上到下依次为：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；

泳道4：甘露聚糖酶质粒转换BL10(sppA)菌落PCR验证图。

图7：地衣芽胞杆菌BL10(sppA)/pHY-amyL与原始菌发酵终点测定淀粉酶酶活力柱状图。

图8：地衣芽胞杆菌BL10(sppA)/pP43SacCNK与原始菌发酵终点测定纳豆激酶酶活力柱状图。

图9：地衣芽胞杆菌BL10(sppA)/pHY-manA与原始菌发酵终点测定甘露聚糖酶酶活力柱状图。

具体实施方式

结合以下实例，对本发明进行进一步说明：

本发明所述实施例所用地衣芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌BL10，所述地衣芽胞杆菌BL10的拉丁文分类命名为Bacillus licheniformis BL10，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M2013400。中国典型培养物保藏中心(CCTCC)于2013年9月10日收到地衣芽胞杆菌BL10，并登记入册，由该日起保存三十年，在期满前收到提供培养物样品的请求后再延续保存五年，所述地衣芽胞杆菌BL10在保藏中心于2013年9月15日检测完毕，结果为存活。

实施例1

(1)信号肽肽酶整合表达载体T2-SppA的构建

根据NCBI公布的地衣芽胞杆菌WX-02基因组序列及sppA基因序列，采用PCR的方法扩增出用于过表达sppA的上下游同源臂A和B。

由图1可知，已成功扩增用于整合sppA的上下游同源臂。

地衣芽胞杆菌信号肽肽酶基因sppA整合载体引物：

sppA-KF1 CGGGATCC ATGATGAGGAAAAAGAGTTT

sppA-KR1 AGCGTCCCATTAAGACTTGCAGCAGAAGCGGAATCGCTGA

sppA-KF2 TCAGCGATTCCGCTTCTGCTGCAAGTCTTAATGGGACGCT

sppA-KR2 CGGGATCC ATGAAACAACACAAACGGCTTT

上下游同源臂片段回收纯化后，进行SOE-PCR并回收纯化，酶切，并与相同酶酶切的整合表达质粒T₂(2)-Ori连接，并进行PCR验证，其验证引物为：

T₂-F ATGTGATAACTCGGCGTA

T₂-R GCAAGCAGCAGATTACGC

(2)地衣芽胞杆菌BL10中sppA的整合

将构建好的SppA整合载体转入地衣芽胞杆菌BL10中，如图2所示，经单双交换验证后并测序验证，BL10中成功整合信号肽肽酶基因sppA。其验证引物为：

GsppA-KYF：CGGGATCC ATGAAAAAGAGACTGATTCA

GsppA-KYR：AAGACTTGCTGCATCTGCCGAAAATGCC

由图3可知，野生菌PCR验证条带为1835bp，整合菌株验证条带为2200bp，说明信号肽肽酶基因sppA已成功整合至地衣芽胞杆菌BL10基因组中。

(3)过表达信号肽肽酶SppA对纳豆激酶外源表达的影响

将构建好的纳豆激酶表达质粒pP3SacCNK电转入BL10(sppA)中，如图5所示。

菌株：BL10/pP3SacCNK和BL10(sppA)/pP3SacCNK

本发明中，种子液：8～10g/L蛋白胨；3～6g/L酵母浸出粉；7～10g/L氯化钠及余量的水，pH 7.0～7.2，250mL三角瓶装液量为50mL。

种子培养时间：10h

纳豆激酶液体发酵培养基：10～30g/L葡萄糖；5～20g/L蛋白胨；10～25g/L酵母粉；5～15g/L大豆蛋白胨；5～12g/L氯化钠；3～12g/L硫酸铵及余量的水；pH 7.0～7.2。

接种量：3％～5％

培养时间：48h

具体到本次实验,种子液：9g/L蛋白胨；4g/L酵母浸出粉；9g/L氯化钠及余量的水，pH 7.1，250mL三角瓶装液量为50mL。

种子培养时间：10h

纳豆激酶液体发酵培养基：20g/L葡萄糖；15g/L蛋白胨；20g/L酵母粉；10g/L大豆蛋白胨；9g/L氯化钠；7g/L硫酸铵及余量的水；pH 7.1。

接种量：4％

培养时间：48h

(4)纳豆激酶酶活的测定：

1)取发酵后的样品按倍数依次稀释。

2)样品吸光度AT：向试管中依次加入0.40mL纤维蛋白原溶液(0.72％,w/v)，1.4mL Tris-HCl(50mM,pH 7.8)，37℃温浴5min，然后加入0.10mL凝血酶溶液(20U/mL)，37℃温浴10min，然后加入0.10ml的稀释酶样品，37℃温浴60min，加入2mL三氯乙酸(0.20M)静止20min终止反应，10000rpm离心10min，取上清于275nm比色测定吸光度AT；

3)对照吸光度AB：向试管中依次加入0.40mL纤维蛋白原溶液(0.72％,w/v)，1.40mL Tris-HCl(50mM，pH7.8)，37℃温浴5min，然后加入0.10mL凝血酶溶液(20U/mL)，37℃温浴10min，继续37℃温浴60min，然后同时加入0.10mL的稀释酶样品和2mL三氯乙酸(0.20M)，10000rpm离心10min，取上清于275nm比色测定吸光度AB作为对照。

1个单位的纤维蛋白降解酶活(FU)相当于每分钟275nm处吸光度增加0.01纳豆激酶活性(FU/g或者FU/ml)＝(AT－AB)/0.01×1/60×1/0.1×D＝A100/6*D D：稀释倍数；AT实际的A275；AB：空白A275。

由图可知：对照菌BL10/pP43SacCNK所产的纳豆激酶酶活为31.83FU/mL，实验组BL10(sppA)/pP43SacCNK所产纳豆激酶酶活为42.33FU/mL，实验组较对照组提高了33.3％。

实施例2

(1)信号肽肽酶整合表达载体T2-SppA的构建

具体步骤与实施例1中(1)信号肽肽酶整合表达载体T2-SppA的构建所述内容相同。

(2)地衣芽胞杆菌BL10中sppA的整合

具体步骤与实施例1中(2)地衣芽胞杆菌BL10中sppA的整合所述内容相同。

(3)过表达信号肽肽酶SppA对α-淀粉酶外源表达的影响

将构建好的α-淀粉酶表达质粒pHY-amyL电转入BL10(sppA)中，如图4所示。

菌株：BL10/pHY-amyL和BL10(sppA)/pHY-amyL

本发明中，种子液：8～10g/L蛋白胨；3～6g/L酵母浸出粉；7～10g/L氯化钠及余量的水，pH 7.0～7.2，250mL三角瓶装液量为50mL。

种子培养时间：10h

淀粉酶液体发酵培养基：5～8g/L玉米浆；5～8g/L酵母粉；6～12g/L蛋白胨；8～14g/L柠檬酸钠；2～3g/L一水合磷酸氢二钾；0.5～2g/L七水合硫酸镁及余量的水；pH 7.0～7.2。

接种量：3％～5％

培养时间：48h

具体到本次实验，种子液：9g/L蛋白胨；4g/L酵母浸出粉；9g/L氯化钠及余量的水，pH 7.1，250mL三角瓶装液量为50mL。

种子培养时间：10h

淀粉酶液体发酵培养基：6g/L玉米浆；7g/L酵母粉；9g/L蛋白胨；12g/L柠檬酸钠；2.5g/L一水合磷酸氢二钾；1g/L七水合硫酸镁及余量的水；pH 7.1。

接种量：4％

培养时间：48h

(4)α-淀粉酶酶活力的测定：

原碘液：称取11.00g碘和22.00g碘化钾，少量水使碘完全溶解，定容至500mL贮存在棕色瓶中。

稀碘液：称取20.00g碘化钾用水溶解，吸取2.00mL碘原液并定容至500mL，贮存于棕色瓶内。

可溶性淀粉溶液(2mg/mL)：称取0.200g(精确至0.001g)可溶性淀粉，在烧杯内调成浆状物，缓慢注入70mL沸水中，搅拌加热至完全透明，定容至100mL，。

磷酸缓冲液(PH＝6.0)：称取45.23g磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)和8.07g柠檬酸钠(C₆H₈O₇·H₂O)，用水溶解并定容至1000mL。

1、待测初酶液的制备：取2mL发酵液于2mL离心管中，1000rpm离心10min，取上清液，稀释到一定倍数待用。

2、测定：吸取20.0mL可溶性淀粉溶液(2mg/mL)于50mL离心管中，加入5.00mL磷酸缓冲液(pH＝6)，摇匀后置于60±0.2℃恒温水浴锅中预热8min；

3、加入1.00mL待测酶液，立即计时，摇匀，准确反应10min；立即加入1.00mL反应液至预先含有0.5mL 0.1mol/L盐酸溶液和5.00mL稀碘液的离心管中，摇匀，并以0.5mL盐酸溶液和5.00稀碘液为空白，在660nm波长下，用10mm比色皿迅速测定其吸光度(A)。

4、标准曲线的制作：精确配制2mg/mL的淀粉溶液，分别稀释成0.00mg/mL，0.10mg/mL，0.20mg/mL……1.70mg/mL，1.80mg/mL，1.90mg/mL，2.00mg/mL。分别加入到盛有0.5mL 0.1mol/L盐酸溶液和5.00mL稀碘液的离心管中，摇匀，并以0.5mL盐酸溶液和5.00稀碘液为空白，在660nm波长下，用10mm比色皿迅速测定其吸光度(A)，以吸光度(A)为横坐标，淀粉浓度为纵坐标，得到标准曲线和斜率K。单位U/mL，U定义为1min水解1mg淀粉的酶量。

计算：酶活力(U/mL)＝(2×20-26×AK)×n/10n：稀释倍

由图7可知：对照菌BL10/pHY-amyL所产的淀粉酶酶活为82.2U/mL，SppA过表达菌株BL10(sppA)/pHY-amyL所产淀粉酶酶活达到140U/mL，相比于对照组提高了70％。

实施例3

(1)信号肽肽酶整合表达载体T2-SppA的构建

具体步骤与实施例1中(1)信号肽肽酶整合表达载体T2-SppA的构建所述内容相同。

(2)地衣芽胞杆菌BL10中sppA的整合

具体步骤与实施例1中(2)地衣芽胞杆菌BL10中sppA的整合所述内容相同。

(3)过表达信号肽肽酶SppA对甘露聚糖酶外源表达的影响

将构建好的甘露聚糖酶表达质粒pHY-manA电转入BL10(sppA)，如图6所示。

菌株：BL10/pHY-manA和BL10(sppA)/pHY-manA。

本发明中，种子液：8～10g/L蛋白胨；3～6g/L酵母浸出粉；7～10g/L氯化钠及余量的水，pH 7.0～7.2，250mL三角瓶装液量为50mL。

种子培养时间：10h

甘露聚糖酶液体发酵培养基：15～30g/L魔芋粉；15～35g/L豆粕；3～8g/L玉米浆；3～8g/L硫酸铵；1～3g/L一水合磷酸二氢钾及余量的水；pH 7.0～7.4。

接种量：3％～5％

培养时间：48

具体到本次实验，种子液：9g/L蛋白胨；4g/L酵母浸出粉；9g/L氯化钠及余量的水，pH 7.1，250mL三角瓶装液量为50mL。

种子培养时间：10h

甘露聚糖酶液体发酵培养基：22g/L魔芋粉；25g/L豆粕；6g/L玉米浆；5g/L硫酸铵；2g/L一水合磷酸二氢钾；pH 7.2。

接种量：4％

培养时间：48

(4)酶活力单位(U)的定义：在40℃、pH 6.0的酶活力测定条件下，1min催化5mg/mL LBG底物溶液生成1μg还原糖(以甘露糖表示)所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)，其中样品的酶活力以U/g(固体酶)或U/mL(液体酶)表示。

标准曲线的制作：分别吸取10mg/mL甘露糖标准液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0mL于100mL容量瓶中，用pH 6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液稀释至刻度，得到0，100，200，300，400，500，600μg/mL的标准稀释液。取不同浓度稀释液各2mL于试管中，加2mL pH 6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，DNS试剂5mL，于沸水浴沸腾5min(样品放入从新沸腾计时)，取出后立即用自来水冷却至室温，并加入蒸馏水定容至25mL，混匀，以不含甘露糖的为空白，在540nm处分别测定其吸光度，并记录。

以吸光度OD值为纵坐标，以相应甘露糖浓度为横坐标，绘制出标准曲线。待测酶液的制备：吸取5mL发酵液4000r/min离心10min，取1.0mL上清液用0.05M pH 6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液定容至100mL作为待测酶液(用前作适当稀释；吸光度OD值在0.2-0.4之间)。

吸取10.0mL 10mg/mL LBG底物溶液，40℃平衡10min。

吸取10.0mL经过适当稀释的待测酶液，40℃平衡10min。

吸取2.00mL经过适当稀释的酶液(已经过40℃平衡)，加入到刻度试管中，再加入5mL DNS试剂，振荡3s。然后加入2.0mL LBG底物溶液，40℃保温20min，沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，加水定容至25mL，振荡3s。以此作为下步反应空白调零样。

吸取2.00mL经过适当稀释的酶液(已经过40℃平衡)，加入到刻度试管中，再加入2.0mL LBG底物溶液(已经过40℃平衡)，振荡3s，40℃精确保温20min。加入5.0mL DNS试剂，振荡3s，以终止酶解反应。沸水浴加热5min，用自来水冷却至室温，加水定容至25mL，混匀。以酶空白样为空白调零，在540nm出测定吸光度OD值。需做2个平行。

查标准曲线或回归方程式，求出样品中还原糖量。OD值以在0.2-0.40范围为宜，若不在此范围需改变稀释倍数后再做。

其中，结果表示与计算按式(1)

式中：

X——试样甘露聚糖酶的活力，U/g或U/mL；A——从标准曲线中查得的还原糖量，μg；

N——稀释倍数(从固体样品到最终液的总稀释倍数)；20——20分钟的反应时间。

同一试样两个平行测定值的相对误差不超过8.0％，二者的平均值为最终的酶活力测定值。

由图9可知：对照菌BL10/pHY-manA所产的甘露聚糖酶酶活为12.5U/mL，BL10(sppA)/pHY-manA所产的甘露聚糖酶酶活为18.6U/mL，相对于对照组酶活提高了48.8％。

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

序列表

<110> 湖北大学

<120> 一种提高芽胞杆菌外源蛋白分泌水平的方法

<130> 2016

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1008

<212> DNA

<213> 地衣芽胞杆菌中信号肽肽酶基因sppA

<400> 1

atgaatgcga aaagatggat cgcacttgtc atcgcgctgg gcgtttttgc gttatctgcg 60

gtgatgagcc ttttgcttgc agtatttgac acgatgggga atgacggaaa gatgcagttt 120

ggcctcaatg acacccagga agaaacggtg cttgaacaag gaaacagctc aagaaaaatc 180

gccgttcttg aagtgaacgg aacgatttcc gacaatggcg gcgcttcagg cctgttcagc 240

tctgaaggct acaaccacag atcgtttttg caaatgcttg aaaaagcaaa agacgattct 300

gccgtaaagg gcattgttct gcgcgtcaat tctccgggtg gcggagtata cgagagcgct 360

gagatacata agaagcttga agagatcaaa aaagatacga aaaaaccgat ttacgtatca 420

atgggatcga tggctgcgtc cggcggctat tacatttcaa cgcctgccga caaaatcttt 480

gcagcgcctg acacgctgac gggttcactc ggggtcatca tggaaagcct taactacagc 540

aagcttgcag agaagcttgg attaaaaacg gagacgatta aaagcggtga gtttaaagat 600

atcatgtcac cgacgcgcga tatgacgaaa aaagaaagag aaatcatgca gtcaatggtc 660

gatgacgcgt acgaagggtt tgtagatgtt attgccgaag ggcgcggcat gtccgaaaat 720

gacgtgaaaa aaattgccga cggacgtgtc tatgacggcc gccaggcgaa acagaaccat 780

ctcattgatg agctcggcta ttatgaagat gcggtcaaag cgatgaaaaa ggaccacaaa 840

aaccttgccg gcgcatctgt tgtcagctat gaagaatcag ccggccttgc ctcgctgttt 900

tcaatgactg caaataagat gtttaaaagc gaagctgatt tcttaaacat taaagaagcg 960

atttctcaat ccggtgcacc gagactcatg tatttatatg ccaaatag 1008