本发明涉及一种吡咯嘧啶五元氮杂环衍生物及其在制备预防和/或治疗与JAK激酶功能有关的适应症的药物中的用途，制备方法及其中间体。
背景技术：
JAK激酶(Janus kinase)为细胞内非受体酪氨酸激酶，能够介导细胞因子，在牵涉免疫应答的细胞增殖和功能中具有一定的调节作用。JAK激酶家族共有四个成员，分别是JAK激酶1(JAK1)、JAK激酶2(JAK2)、JAK激酶3(JAK3)和酪氨酸激酶2(TYK2)。一般情况下，细胞因子通过与细胞因子受体结合而活化JAK激酶，JAK活化后激活STATs(一种DNA结合蛋白)，活化的STATs进入细胞核中调控基因表达。JAKs-STATs家族作为细胞因子受体介导的主要信号转导途径，可能与其他信号转导通路相互影响，参与了多种免疫和造血细胞的发育、分化、成熟、凋亡和功能表达过程，在调节机体的免疫、炎症反应过程中发挥着极为重要的作用。
JAKs-STATs通路的异常活化与多种疾病密切相关。JAK激酶抑制剂可以用于类风湿性关节炎、真性红细胞增多症、银屑病、原发性血小板增多症和骨髓纤维化等疾病的治疗。
在开发免疫与炎症相关适应症的JAK激酶抑制剂时，首先要考虑的是药物对JAK2的抑制活性，同时也还要考虑对其他三个激酶的选择性，如果选择性不高，容易产生严重的毒副作用，毒副作用主要体现在人体正常的免疫功能受到抑制，从而发生较高的感染率。目前已上市的第一个JAK激酶抑制剂产品托伐替尼(Tofacitinib)，虽然其对JAK2有较强的抑制活性，但因其对其他三个激酶的选择性不高，因此产生了较高的毒副作用，在其说明书中明确指明使用Xeljanz(托伐替尼商品名)与严重感染风险增高相关，包括机会性感染、结核、癌症和淋巴瘤等。
因此，开发既具有高活性又具有安全性的JAK激酶抑制剂是本领域的难点。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种新型的JAK激酶抑制剂，具有高活性和高安全性。
本发明提供了一种吡咯嘧啶五元氮杂环衍生物，其是理想的非可逆性JAK激酶抑制剂。
本发明同时还提供吡咯嘧啶五元氮杂环衍生物，其可药用盐、水合物，或以任何形式代谢形成的代谢产物在制备预防和/或治疗与JAK激酶功能有关的适应症的药物中的用途。
为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：
一种吡咯嘧啶五元氮杂环衍生物，其可药用盐、水合物、或以任何形式代谢形成的代谢产物，所述的吡咯嘧啶五元氮杂环衍生物的结构通式如式(I)所示：
其中：
X为N或CH；
R1为CH2CN或COCH2CN；
R2为
其中，R3为SO2R4或C(O)R4，R4为直链或环状烷基、具有至少一个双键的直链或分支链烃链、氟取代的直链或环状烷基、NHCH3、N(CH3)2、苯基、吡啶或嘧啶。
优化地，所述的吡咯嘧啶五元氮杂环衍生物，其可药用盐、水合物、或以任何形式代谢形成的代谢产物中，非交换性的氢未被取代，或部分或全部被氘取代。
优化地，所述的R4为碳数1～6的直链或环状烷基或具有一个双键且碳数为2～6的烃基。R4更优选为甲基、乙基、乙烯基或环丙基。
进一步地，式(I)中，R1为CH2CN且R3为SO2R4。
优化地，式(I)中，R3为SO2CH2CH3。
优化地，所述吡咯嘧啶五元氮杂环衍生物为如下结构式表示的化合物中的一种或多种的混合物：
根据本发明，所述的吡咯嘧啶五元氮杂环衍生物的化合物，其不仅包括单一的某种化合物形式，还包括多种结构满足通式(Ⅰ)要求的化合物的混合物形式，以及同一化合物的不同异构体形式例如外消旋体、对映异构体、非对映异构体等。所述的可药用盐包括但不限于盐酸盐、磷酸盐、硫酸盐、醋酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、苯酸盐、甲基苯磺酸盐、琥珀酸盐、延胡索酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、没食子酸盐、柠檬酸盐等。所述的“具有通式(Ⅰ)的化合物的前药”指一种物质，当采用适当的方法施用后，可在受试者体内进行代谢或化学反应而转变成结构式(Ⅰ)的至少一种化合物或其盐。
本发明还提供了一种药物组合物，含有所述的吡咯嘧啶五元氮杂环衍生物或其可药用盐，及药学上可接受的载体。
本发明吡咯嘧啶五元氮杂环衍生物的制备可以通过化学领域众所周知的那些类似的方法的合成途径，特别是根据本文包含的描述合成本发明的化合物。试剂一般从商业来源获得或易于使用本领域技术人员众所周知的方法制备。
本发明的又一目的在于提供一种上述吡咯嘧啶五元氮杂环衍生物的制备方法，它包括以下步骤：(a)将与第一氨基保护试剂PG1反应生成前述式中Z为Cl、Br或I，
(b)将步骤(a)得到的产物与反应制得所述R5为烷氧基氨基保护基或硅烷氨基保护基；当R5为烷氧基氨基保护基时，先将步骤(a)中得到的产物与置于醇和水的混合溶剂中，在催化剂和碱性条件下进行反应，使得基团取代Z，再在酸性条件下反应脱去R5；
(c)采用其中PG2为第二氨基保护基，将步骤(b)得到的产物与进行加成反应，随后在酸性条件下脱去第二氨基保护基PG2制得其中R6为CHCN或CH(CO)CN，R1的定义同前，n为1～3的整数；
(d)将步骤(c)得到的产物与R3-Cl在极性溶剂中进行取代反应制得随后脱去第一氨基保护基PG1制得即为式(I)化合物。
示例性的具体合成路线如下：
本领域技术人员可以根据现有技术得到上述吡咯嘧啶五元氮杂环衍生物制备方法的反应条件；也可以根据下述优选的制备和提纯方案进行，以提高产物的产率和纯度，并降低成本。
步骤(a)中，第一氨基保护试剂可以为2-(三甲硅烷基)乙氧甲基氯(SEMCl，此时PG1为SEM)，此时可以将NaH和DMF的悬浮液缓慢加入的DMF溶液中，在5℃以下搅拌0.5～5小时；随后缓慢加入SEMCl，在室温下搅拌过夜，加水淬灭反应并用乙酸乙酯萃取，过滤减压浓缩；通过快速色谱法纯化得到(通常为浅黄色油状物)。
步骤(b)中，将醇类溶剂(如1-丁醇)、水和碳酸盐(如碳酸钾)的混合物在60～100℃搅拌，随后加入四(三苯基膦)钯(0)，在60～100℃搅拌过夜；冷却至室温后，将反应混合物通过硅藻土床过滤，萃取减压浓缩，通过硅胶柱纯化得到；需要注意的是：R5可能为不能水解的烷氧基氨基保护基(如)或者可以水解的硅烷氨基保护基(如)；当R5为硅烷氨基保护基时，产物直接得到当R5为烷氧基氨基保护基，通过硅胶柱纯化得到的产物还需要在酸性条件下(溶于THF，并加入HCl水溶液)搅拌过夜，减压浓缩后用乙酸乙酯萃取，干燥过滤浓缩，通过硅胶柱纯化得到
步骤(c)中，将步骤(b)得到的产物、(n为1～3的整数)、乙腈和DBU中混合形成混合物，在50～90℃下搅拌1～5小时，然后将反应混合物减压浓缩，通过硅胶柱纯化即可。
步骤(d)中，将步骤(c)得到的产物、DCM、三乙胺和乙磺酰氯的混合物在室温下搅拌过夜。然后将反应混合物减压浓缩，通过快速色谱法纯化得到再在5℃以下将其的DCM溶液加入TFA，随后在室温下搅拌0.5～5小时，减压浓缩；向残余物中加入甲醇和乙二胺，在室温下搅拌1～5小时，除去溶剂，通过HPLC纯化得到即可。
本发明的再一目的在于提供一种上述的吡咯嘧啶五元氮杂环衍生物的中间体，它的结构通式如式(II)所示：
其中：PG1为第一氨基保护基，R7为第二氨基保护基PG2、H或R3。第一氨基保护基PG1和第二氨基保护基PG2可以采用常规的那些，如第一氨基保护基PG1为2-(三甲基硅)乙氧基甲基(SEM)，所述第二氨基保护基PG2为叔丁氧羰基(Boc)。
进一步地，吡咯嘧啶五元氮杂环衍生物的中间体结构通式为：它们均是吡咯嘧啶五元氮杂环衍生物中间体，只是处于其制备方法的不同步骤中。
本发明采用的另一技术方案：上述吡咯嘧啶五元氮杂环衍生物，其可药用盐、水合物或以任何形式代谢形成的代谢产物在制备预防和/或治疗与JAK激酶功能有关的适应症的药物中的用途。
所述与JAK激酶功能有关的适应症包括但不限于类风湿性关节炎、真性红细胞增多症、银屑病、原发性血小板增多症和骨髓纤维化等疾病。
由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：
本发明提供的化合物吡咯嘧啶五元氮杂环衍生物是新型的JAK激酶抑制剂，其是理想的高效、高选择性JAK激酶抑制剂，通过作用于JAK激酶，在免疫及炎症反应方面具有一定的药物治疗作用，同时具有较小的毒副作用，安全性高。因此本发明化合物可用于制备治疗或预防各种与JAK激酶功能有关的适应症的药物。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1
本实施例提供一种吡咯嘧啶五元氮杂环衍生物(式Ia化合物)，其化学结构如下：
式Ia化合物可通过如下合成路线获得：
式Ia化合物的制备方法具体包括如下步骤：
(1)、制备中间体2：0℃下向NaH(3g，0.13mol)DMF(60mL)悬浮液缓慢加入1(10g，0.066mol)DMF(40mL)溶液。将反应混合物在0℃下搅拌2小时，得到浅棕色混浊混合物。然后向混合物缓慢加入2-(三甲硅烷基)乙氧甲基氯(SEMCl)(12.7g，0.08mol)，室温下搅拌过夜，加水淬灭反应并用乙酸乙酯萃取，过滤减压浓缩。通过快速色谱法纯化得到中间体2(15g，81％)，为浅黄色油状物；MS(m/s):284[M+H]+；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ0.00(s,9H),0.95(t,J＝11.6Hz,2H),3.68(t,J＝10Hz,2H),5.79(s,2H),6.79(s,1H),7.98(s,1H),8.78(s,1H)。
(2)、制备中间体3：将中间体2(8g，283mol)、1-丁醇(30mL)、1-(1-乙氧基乙基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1,3-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-H-吡唑(9g，0.034mol)、水(30mL)和碳酸钾(9.9g，0.071mol)的混合物在100℃下搅拌。然后向该溶液中加入四(三苯基膦)钯(0)(3.3g，2.8mmol)，将混合物在100℃下搅拌过夜。冷却至室温后，将混合物通过硅藻土床过滤，萃取减压浓缩，通过硅胶柱纯化得到中间体3(8.5g，78％)，为黄色油状物；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ0.00(s,9H),0.95(t,J＝8Hz,2H),1.17-1.22(m,3H),1.84(d,J＝6Hz,3H),3.43-3.40(m,1H),3.63-3.67(m,4H),5.78(s,2H),7.28(d,J＝3.6Hz,1H),7.88(d,J＝3.6Hz,1H),8.54(s,1H),8.92(s,1H),8.96(s,1H)。
(3)、制备中间体4：向中间体3(8.5g，0.022mol)THF(80mL)溶液加入1.5N HCl水溶液(20mL)，将混合物在室温下搅拌过夜。然后将反应混合物减压浓缩，用乙酸乙酯萃取，干燥过滤浓缩，通过硅胶柱纯化得到中间体4(4.8g，69％)，为白色固体；MS(m/s):316[M+H]+；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ0.00(s,9H),0.91(t,J＝8Hz,2H),3.65(t,J＝8Hz,2H),5.73(s,2H),7.18(s,1H),7.83(s,1H),8.44(s,1H),8.77(s,1H),8.84(s,1H),13.50(s,1H)。
(4)、制备中间体5：将中间体4(4.5g，0.143mol)、乙腈(50mL)、4-(氰基亚甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(4.67g，0.214mol)和DBU(2.2g，0.0143mol)的混合物在70℃下搅拌4小时。然后将反应混合物减压浓缩。通过硅胶柱纯化得到固体中间体5(3.5g，45％)；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ0.00(s,9H),0.92(t,J＝7.2Hz,2H),1.5(s,9H),2.12(t,J＝12Hz,2H),2.77(d,J＝14.4Hz,2H),3.10(s,2H),3.60(s,2H),3.64(t,J＝8Hz,2H),3.89(d,J＝32Hz,2H),5.74(s,2H),7.30(d,J＝3.6Hz,1H),7.89(d,J＝3.6Hz,1H),8.55(s,1H),8.62(s,1H),8.96(s,1H)。
(5)、制备中间体6：将中间体5(3.5g，6.5mmol)加入20mL4N HCl乙酸甲酯溶液中，室温下搅拌过夜。然后将反应混合物减压浓缩。通过硅胶柱纯化得到白色固体中间体6(1.4g，50％)；MS(m/s):438[M+H]+。
(6)、制备中间体7：将中间体6(1.4g，3.2mmol)、DCM(20mL)、三乙胺(0.5g，4.95mmol)和乙磺酰氯(0.5g，3.89mmol)的混合物在室温下搅拌过夜。然后将反应混合物减压浓缩，通过快速色谱法纯化得到中间体7(0.5g，30％)，为白色固体；MS(m/s):530[M+H]+；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ0.00(s,9H),0.92(m,J＝8Hz,2H),1.25(t,J＝7.2Hz,3H),2.17-2.23(m,2H),2.89-2.92(m,2H),3.00-3.12(m,4H),3.38(s,1H),3.43(s,1H),3.60-3.64(m,4H),5.74(s,2H),7.30(d,J＝3.6Hz,1H),7.90(d,J＝3.6Hz,1H),8.56(s,1H),8.87(s,1H),8.94(s,1H)。
(7)、制备式Ia化合物：在0℃下将中间体7(0.1g，0.189mmol)的DCM(5mL)溶液加入TFA(5mL)。将反应混合物在室温下搅拌1小时。然后将混合物减压浓缩，向残余物中加入甲醇(5mL)和乙二胺(1mL)，将混合物在室温下搅拌2小时。然后除去溶剂，通过HPLC纯化得到Ia化合物(25mg，33％)，为白色固体。
对得到的目标产品Ia进行了氢核磁共振1H-NMR(400MHz，MeOD)和质谱测试，结果如下：
1H-NMR谱图中吸收峰：δ＝8.81(s,1H)8.70(s,1H)8.45(s,1H)7.61(d,1H)7.09(d,1H)6.06(s,1H)3.56(d,2H)3.29(s,2H)3.03(m,2H)2.93(t,2H)2.82(t,2H)2.10(m,2H)1.15(t,3H)。
m/z[MH]+:400.2。计算得出产品具有分子式C18H21N7O2S，精确分子质量(exact mass)为399.15。
实施例2
式Ib化合物，其化学结构如下：
式Ib化合物可通过如下合成路线获得：
式Ib化合物的制备方法具体包括如下步骤：
(1)、制备中间体8：将中间体2(3g，10.6mmol)、1-丁醇(30mL)、3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1-(三异丙基甲硅烷基)-1H-吡咯(4.5g，12.7mmol)、水(30mL)和碳酸钾(3.7g，26.5mmol)的混合物在100℃下搅拌。然后向该溶液中加入四(三苯基膦)钯(0)(0.7g，0.53mmol)，将混合物在100℃下搅拌过夜。冷却至室温后，将混合物通过硅藻土床过滤，萃取减压浓缩，通过硅胶柱纯化得到中间体8(2g，60％)，为黄色油状物；MS(m/s):315[M+H]+。
(2)、制备中间体9：将中间体8(2g，6.4mmol)、乙腈(60mL)、4-(氰基亚甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(2.1g，9.5mmol)和DBU(1.5g，9.9mmol)的混合物在70℃下搅拌4小时。然后将反应混合物减压浓缩，通过硅胶柱纯化得到固体中间体9(1g，30％)；MS(m/s):537[M+H]+；1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ0.00(s,9H),0.95-1.00(m 2H),1.51(s,9H),2.13-2.17(m,2H),2.53-2.60m,2H),2.84(s,2H),3.20(brs,2H),3.60(t,J＝8.4Hz,2H),3.99(brs,2H),5.72(s,2H),6.91(d,J＝3.6Hz,1H),7.04-7.09(m,2H),7.40(s,1H),7.82(s,1H),8.87(s,1H)。
(3)、制备中间体10：将中间体9(1g，1.86mmol)加入10mL4N HCl乙酸甲酯溶液中，室温下搅拌过夜。然后将反应混合物减压浓缩。通过硅胶柱纯化得到白色固体中间体10(0.7g，86％)；MS(m/s):437[M+H]+。
(4)、制备中间体11：将中间体10(0.7g，1.4mmol)、DCM(15mL)、三乙胺(0.25g，2.5mmol)和乙磺酰氯(0.25g，1.9mmol)的混合物在室温下搅拌过夜。然后将反应混合物减压浓缩，通过快速色谱法纯化得到白色固体中间体11(0.25g，30％)；MS(m/s):529[M+H]+。
(5)、制备式Ib化合物：在0℃下将中间体11(0.25g，0.48mmol)的DCM(10mL)溶液加入TFA(10mL)。将反应混合物在室温下搅拌1小时。然后将混合物减压浓缩，向残余物中加入甲醇(10mL)和乙二胺(2mL)，将混合物在室温下搅拌2小时。然后除去溶剂，通过HPLC纯化得到Ib化合物(22mg，12％)，为白色固体。
对得到的目标产品Ib进行了氢核磁共振1H-NMR(400MHz，MeOD)和质谱测试，结果如下：1H-NMR谱图中吸收峰：δ＝11.16(s,1H)8.84(s,1H)7.78(s,1H)7.27(d,1H)7.07(t,1H)6.99(t,1H)6.85(d,1H)3.80(d,2H)3.03(t,2H)2.91(t,2H)2.78(s,2H)2.70(d,2H)2.18(t,2H)1.29(t,3H)。m/z[MH]+:399.2。计算得出产品具有分子式C19H22N6O2S，精确分子质量(exact mass)为398.15。
药效等试验
一、化合物酶活性测试：
1、试验方法
化合物的半抑制浓度IC50(把酶活性抑制至50％时所需的化合物的浓度)是以固定的酶混合特定底物及不同浓度的待测化合物来测定的。所用的测定方法是卡尺迁移变动分析(Caliper Mobility Shift Assay)，所测定的激酶为JAK1、JAK2、JAK3和TYK2，所应用的标准参照化合物为星形孢菌素(staurosporine)。
2、试验结果
表1总结了化合物酶活性抑制实验结果。结果显示本发明化合物(Ia和Ib)对JAK2激酶具有非常强的抑制作用；同时，结果显示本发明化合物(Ia和Ib)的选择性抑制活性很好。这一选择性的抑制作用对类风湿性关节炎、真性红细胞增多症、银屑病、原发性血小板增多症和骨髓纤维化等疾病的治疗具有重要的治疗意义。
表1 化合物酶活性抑制实验结果
二、化合物体外电生理评估：
1、试验方法
应用hERG稳定表达的HEK293细胞和全自动膜片钳系统检测方法研究本发明化合物对全细胞hERG钾通道电流阻断百分率，得到量效关系曲线。阳性药物为Cisapride(西沙必利)。
2、试验结果
通过试验量效关系曲线得到本发明化合物(Ia和Ib)的IC50值均大于30μM，这表明本发明化合物具有QT间期延长药物心脏毒性的可能性极小。
三、大鼠佐剂诱导关节炎药效模型试验：
1、试验方法
(1)、造模：将Mycobacterium tuberculosis H37Ra溶于石蜡油，配成CFA，在大鼠尾根部进行皮内注射100μL，大鼠在14天的时候发病，同时发病的临床评分≥3。
(2)、给药治疗：随即对大鼠进行随机分组并进行口服给予本发明化合物(Ia和Ib，剂量分别为0.5mg/kg、1.0mg/kg、1.5mg/kg、10mg/kg和15mg/kg)。整个给药周期为14天，并在每周一和周四进行临床评分和测足体积记录数据。
2、试验结果
试验结果表明，模型组的临床评分﹑肿胀程度﹑足体积大小均高于正常组，并且从HE切片的结果来看，模型组有炎症细胞的浸润以及结缔组织的增生，X-ray也显示模型组有明显的骨质增生，关节面间隙不清晰，有毛刺感。综上所述，本次试验造模成功。
本发明化合物无论是在临床评分，足体积，HE切片以及X-ray都能有效的抑制大鼠病变。化合物Ia和Ib 10mg/kg和15mg/kg剂量组动物临床评分和足体积几乎接近正常组，HE切片及X-ray也证实药效明显有效，大鼠状态明显好转。其中化合物Ia0.5mg/kg、1.0mg/kg、1.5mg/kg、10mg/kg和15mg/kg剂量下疾病抑制率(针对于溶媒组，临床评分)分别为16％、28％、50％、100％和100％。化合物Ia和Ib给药组动物体重均较溶媒组动物体重有较大幅度的增加。
四、药物动力学实验
1、实验方法：
实验动物：比格犬、雄性和雌性；体重：7-9kg；
供试品配制：将本发明化合物(Ia)配制成2.5mg/mL(为静脉给药用)和2.0mg/mL(为口服给药用)，待用。给药途径：口服/静脉注射。给药容量及频率：2mL/kg(静脉注射)或5mL/kg(口服)，单次给药。
样品采集：按照下列时间点采集血液，给药后5min、15min、30min、1hr、2hr、4hr、8hr和24hr取血。
2、样品分析及结果
样品分析：使用LC-MS/MS方法对采集样品进行检测。使用仪器型号为API4000。
药物动力学数据分析：使用WinNolin按照非房室模型法对所得血药浓度数据进行拟合和计算，部分结果总结在表2中。
表2 按照非房室模型法计算出的目标化合物药物动力学参数
试验结果表明本发明化合物具有良好的药物动力学特征。
五、毒副作用试验
对本发明化合物(Ia和Ib)的毒副作用进行了试验测试。对大鼠每日一次30mg/kg/天，连续给药14天，结果表明本发明化合物没有明显毒副作用，各器官组织与血生化指标与溶媒对照组相比没有显著差异。本发明化合物在动物中的耐受性很好。同一试验中，类似化合物Baricitinib在相同剂量(30mg/kg/天)下大鼠胸腺和脾脏组织明显缩小(为正常规格的四分之一)，表现出一定的毒副作用。
以上实施例仅是代表性的。通过上述实施例可见，本发明的化合物是理想的高效JAK激酶抑制剂，可期望用于治疗或预防类风湿性关节炎、真性红细胞增多症、银屑病、原发性血小板增多症和骨髓纤维化等疾病并取得非常好的效果，其还可以和不同类型的药用盐相结合制成口服制剂(片剂或胶囊等)。用本发明化合物制成的片剂或胶囊可被服用每日一次或多次。本发明化合物还可和其他它药物结合制成复方制剂。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。