本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种脱氢异构酶基因敲除的裂殖壶菌工程菌的构建方法及其应用。
背景技术：
多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFAs)，指一类18-22碳，包含两个或两个以上不饱和双键的直链脂肪酸，在生物细胞中发挥重要作用，例如，作为细胞膜重要组分，储存油脂，信号传导等功能。目前，PUFAs被分为n-6(或ω-6)和n-3(或ω-3)族两类。在这两类脂肪酸中，n-3族多不饱和脂肪酸包括亚麻酸(α-Linolenic acid，ALA)、二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid，EPA)和二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic Acid，DHA)，n-6族多不饱和脂肪酸以花生四烯酸(Arachidonic acid，ARA)和亚麻油酸(Gamma-Linolenic Acid，GLA)为主。多不饱和脂肪酸，尤其是n-3族，作为生物活性物质，是促进人类健康和动物生长必要营养物质。
裂殖壶菌是多不饱和脂肪酸的重要生产菌株，目前已被工业化生产DHA，其细胞油脂含量高，生长繁殖快，更耐受机械搅拌，适宜发酵罐大规模培养，并已被美国及欧洲有关食品权利机构批准添加至相关食物中使用(Regulation(EC)No 258/97 of European Parliament，2010)。已经证明，裂殖壶菌具有PUFA合成酶途径(类PKS途径)大量合成多不饱和脂肪酸的能力(Science，2001，293(5528)：290-293；生物工程学报，2010，26(9)：1225-1231；Progress in lipid research，2014，56：19-35)，但是其PKS基因簇合成和调控多不饱和脂肪酸的机理仍然未有明确解释。
羟基脂酰基ACP脱氢异构酶(beta-hydroxydecanoyl-acyl carrier protein(ACP)-dehydratase，FabA)在植物、动物和微生物中广泛分布，与不饱和脂肪酸合成代谢密切相关的酶。FabA基因编码有双功能的3-羟基脂酰ACP脱水异构酶，其异构产物能被FabB基因编码的3-酮基脂酰ACP合成酶I延伸，合成不饱和脂肪酸。该途径被认为是缺氧条件下不饱和脂肪酸合成的经典途径。该脱氢酶基因是多不饱和脂肪酸合成的关键基因之一，裂殖壶菌的PKS基因簇中包含多个脱氢酶(FabA)序列，FabA基因参与了多不饱和脂肪酸合成过程，然而其作用机制目前仍然不清楚。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种脱氢异构酶基因敲除的裂殖壶菌工程菌的构建方法。
本发明的另一目的在于提供上述构建的裂殖壶菌工程菌的应用。
本发明的技术方案如下：
一种脱氢异构酶(FabA)基因敲除的裂殖壶菌工程菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)以裂殖壶菌的基因组为DNA模板，用上游引物对和下游引物对分别PCR扩增FabA基因的上游片段UFabA和下游片段DFabA，上述上游引物对包括上游正向引物和上游反向引物，分别如SEQ ID NO 01和SEQ ID NO 02所示，下游引物对包括下游正向引物和下游反向引物，分别如SEQ ID NO 03和SEQ ID NO 04所示；
(2)将上游片段UFabA和下游片段DFabA与敲除载体连接，构建重组敲除质粒；
(3)将上述重组敲除质粒电转化裂殖壶菌，用抗性平板筛选，并经PCR抗性基因序列验证，得转化子，即所述脱氢异构酶基因敲除的裂殖壶菌工程菌。
FabA基因是编码羟基脂酰ACP脱水异构酶的基因，可以催化葡3-羟基脂酰ACP脱水异构，是合成多不饱和脂肪酸的重要步骤，裂殖壶菌的PKS基因中OrfC片段包含两个FabA基因位点，参与了脂肪酸的合成。基于以上理论分析，通过在裂殖壶菌中敲除PKS基因簇中OrfC片段中第二个FabA基因，能够使其功能被屏障，并可以进一步的对生物体造成影响，进而推测出该基因在裂殖壶菌合成PUFAs过程中的作用，为探究裂殖壶菌中多不饱和脂肪酸合成的机理提供重要帮助。
在本发明的一个优选实施方案中，所述敲除载体为pBlu-Zeo。
在本发明的一个优选实施方案中，所述PCR扩增的程序包括如下：(1)94℃，5min；(2)94℃，30s；(3)55℃，30s；(4)72℃，1min；(5)重复(2)～(4)35个循环；(6)72℃，10min(7)4℃保存。
本发明的另一技术方案如下：
一种多不饱和脂肪酸的生产方法，用权利要求1至3中任一权利要求所述构建方法构建的裂殖壶菌工程菌进行发酵生产。
在本发明的一个优选实施方案中，包括如下步骤：
(1)将所述裂殖壶菌工程菌接种于液体种子培养基中培养，获得种子培养液；
(2)将步骤(1)所得的种子培养液接种于发酵培养基中培养，以发酵生产多不饱和脂肪酸，得发酵液；
(3)将步骤(3)所得的发酵液中的菌体充分消化，加入正己烷混匀后静置分层，获得有机相，接着用正己烷清洗该有机相至无色，最后去除正己烷，即得所述多不饱和脂肪酸。
进一步优选的，所述步骤(1)为：将所述裂殖壶菌工程菌接种于液体种子培养基中，于27～29℃，180～220rpm培养24～48h，获得种子培养液。
进一步优选的，所述步骤(2)为：将步骤(1)所得的种子培养液以3～5％的体积比接种于发酵培养基中，于27～29℃，180～220rpm培养4～6d，以发酵生产多不饱和脂肪酸，得发酵液。
本发明的有益效果：本发明提供了裂殖壶菌敲除基因的工程菌的构建方法构，建了敲除FabA基因裂殖壶菌重组菌，该工程菌产多不饱和脂肪酸的能力比出发菌株中所占总油脂的比例减少了26％，而饱和脂肪酸的生产量增加16％。
附图说明
图1为本发明实施例1中重组敲除质粒pBlu-UFabA-Zeo-DFabA的PCR验证结果图，其中泳道1位阴性对照，泳道2位重组质粒pBlu-UFabA-Zeo-DFabA。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1：敲除重组载体质粒pBlu-UFabA-Zeo-DFabA的构建
设计PCR引物，用于扩增FabA基因上游片段UFabA。
正反向引物分别为：
正向引物1：GGGGTACCCCTTGCCAGCGATCTTGGACAT(SEQ ID NO 01)
反向引物2：CGCACAAGGGTAAGCTCGTATGGTAGCTACC(SEQ ID NO 02)
设计PCR引物，用于扩增FabA基因下游片段DFabA。
正反向引物分别为：
正向引物3：CGGGATCCCGTGGAGGCCGAGCCAGAGCAT(SEQ ID NO 03)
反向引物4：GACCAAGAAGCAGGACATCACGCTCGAGC(SEQ ID NO 04)
以Schizochytrium limacinum ATCC 1381(来源于美国ATCC菌株保藏中心)基因组DNA为模板，进行如下PCR程序：(1)94℃，5min；(2)94℃，30s；(3)55℃，30s；(4)72℃，1min；(5)重复(2)～(4)35个循环；(6)72℃，10min；(7)4℃保存。
PCR反应体系如下表：
将敲除载体pBlu-Zeo(参见公开文献：
The metabolic burden of cellulase expression by recombinant Saccharomyces cerevisiae Y294in aerobic batch culture.《Applied Microbiology and Biotechnology》，2012，96(1)：197-209以及
Over-expression of native Saccharomyces cerevisiae exocytic SNARE genes increased heterolo gous cellulase secretion.《Applied Microbiology and Biotechnology》，2014，98(12)：5567-5578)用限制性内切酶Kpn I和Cla I双酶切，回收后，与FabA基因上游片段UFabA以及DNA T4连接酶混合，在4℃下过夜连接反应。反应体系如下：
将上述所得连接产物转化到E.coli DH5α感受态细胞中，挑选阳性克隆，提取质粒pBlu-UFabA-Zeo，用限制性内切酶BamH I和Sac I双酶切，回收后，与FabA基因下游片段DFabA以及DNA T4连接酶混合，在4℃下过夜连接反应。反应体系如下：
将上述所得连接产物转化到E.coli DH5α感受态细胞中，挑选阳性克隆，提取质粒，获得敲除重组载体质粒pBlu-UFabA-Zeo-DFabA。
实施例2：裂殖壶菌基因工程菌SchΔFabA的构建
将pBlu-UFabA-Zeo-DFabA质粒经提取及浓缩后，电击转化裂殖壶菌，28℃复苏2-3h后，涂布博莱霉素抗性平板，再在28℃培养3～5d，筛选转化子。转化子经质粒提取后，利用PCR进行验证(如图1所示)，从而获得敲除FabA基因的裂殖壶菌重组菌株SchΔFabA。
电转化具体步骤如下：
裂殖壶菌感受态的制备：
(1)在20mL种子培养基中接种一环Schizochytrium limacinum，28℃，200rpm过夜培养48h；
(2)取培养液1mL接入20mL种子培养基中，于28℃，200rpm培养至对数中后期24h；
(3)取5mL培养液于4℃以4200rpm离心收获细胞，弃上清；
(4)加入25mL的预处理剂(20Mm pH 5.8磷酸缓冲液配置25mM的DTT)重悬浮细胞，于28℃，200rpm震荡30min；
(5)将处理后的培养液于4℃以4200rpm离心收获细胞，弃上清；加入15-20mL预冷的灭菌水(0℃冰上)水洗两遍；
(6)再加入15-20mL的1M的山梨醇洗两遍
(7)最终加入一定量的1M山梨醇重悬，控制细胞的浓度在106cell/mL。裂殖壶菌感受态细胞需要现用现制备，制备好的感受态细胞需在1h内完成电转。
裂殖壶菌的电转：
(1)将感受态细胞和1～5ug质粒混合物转移到冰冷的0.1cm间隙的电击池中；
(2)以2100V、5ms脉冲转化；
(3)迅速往电击池中加入1mL复苏培养基(种子培养基)，将菌悬液回收到5mL离心管中，于28℃，200rpm培养3h；
(4)将菌液涂布在抗性平板上，于28℃培养直到平板上出现菌落。
实施例3利用裂殖壶菌及其基因工程菌发酵产多不饱和脂肪酸
将裂殖壶菌ATCC1381出发菌株和实施例2所述的工程菌接种于液体种子培养基中，28℃，200rpm培养24h，制备种子培养液，以4％(V/V)的接种量接种于不饱和脂肪酸发酵培养基中，28℃，200rpm培养，进行发酵产多不饱和脂肪酸。5d后分别测定发酵液总油脂及多不饱和脂肪酸组成(如表1所示)。本发明构建的裂殖壶菌工程菌SchΔFabA产多不饱和脂肪酸的能力比出发菌株中所占总油脂的比例减少了26％，而饱和脂肪酸的生产量增加16％(如表1所示)。
表1：裂殖壶菌ATCC 1381及其重组菌SchΔFabA总油脂产量和不饱和脂肪酸组分比较表(占总油脂％)，DHA：二十二碳六烯酸，DPA：二十二碳五烯酸
裂殖壶菌总油脂提取纯化方法：
(1)准确吸取3mL发酵液于10mL具塞试管中，混匀后再加入4mL质量分数为38％的浓盐酸。于60～70℃水浴加热40～50min至菌体消化完全。
(2)再加入3～5mL正己烷，加塞充分摇匀，静置分层，取上层有机相置于已恒重的磨口锥形瓶中。用正己烷重复洗涤3～5次，直至上层有机相无色。
(3)通过氮吹的方法除去有机溶剂至恒重，计算总油脂(TotaL fatty acid，TFA)产量。
多不饱和脂肪酸鉴定方法：
(1)准确称取一定量(约0.1g)的油脂，置于50mL磨口锥形瓶中，加入5mL的0.5mol/L的KOH-CH3OH溶液于65℃水浴回流至油滴消失(大约10min)，从冷凝管顶部加入5mL 30％的三氟化硼乙醚反应30min。
(2)冷却后加入5mL正己烷振荡，加入适量内标物(如十七烷酸甲酯)然后加入足量的饱和食盐水，静置分层后取上层正己烷相并加入无水硫酸钠脱水，过滤，所得样品即可进行气象色谱分析。
气象色谱条件：选用SP2560色谱柱(AvondaLe，PennsyLvania)(30m*0.25mm*0.25m)。采用程序升温：初始温度100℃，然后按20℃/min升温到180℃，再按15℃/min升温至220℃，保持20min；柱压13.582psi，进样口温度250℃，FID检测器温度260℃。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
<110> 厦门大学
<120> 一种脱氢异构酶基因敲除的裂殖壶菌工程菌的构建方法及应用
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ggggtacccc ttgccagcga tcttggacat 30
<210> 2
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cgcacaaggg taagctcgta tggtagctac c 31
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgggatcccg tggaggccga gccagagcat 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gaccaagaag caggacatca cgctcgagc 29