一种类肽及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种类肽，尤其涉及一种类肽及其制备方法和应用，具体涉及一种能够检测血清中β-淀粉样蛋白含量的类肽及其制备方法和应用。

背景技术：

阿尔茨海默症(Alzheimer’s Disease,AD)是一种由淀粉样多肽的错误折叠和异常聚积造成的以进行性记忆力减退和认知功能障碍为发病症状的老年期高发病率的神经系统变性疾病。根据国际阿尔茨海默病协会(Alzheimer’s Disease International,ADI)2015年发布的《2015年全球阿尔茨海默症报告》显示，估计目前全球共有约4680万失智患者。这一数量将以每20年递增一倍的速度逐渐增加，预计到2030年将达到7470万，到2050年达1亿3150万人。这一估计比世界阿尔茨海默病2009年报告中增加了12％-13％。国际阿尔茨海默症联合会称在中国，有900万人患有痴呆症。但这一数字可能人为偏低，因为农村地区很多患者从未得到诊断。国际阿尔茨海默症联合会估计，到2050年，中国的患者数量估计将达到3000万。我国作为全球人口第一大国，目前老龄化的社会现象越来越严重，而且65岁以上的老人患阿尔茨海默症病率为6.6％，在85岁以上的老人中发病率高达30％以上。因此阿尔茨海默症成为我们必须要面对的重大社会问题。

AD的发病机制复杂，至今未有定论，目前人们提出几种假说，如胆碱能神经异常学说、淀粉样蛋白级联学说、自由基与凋亡学说、tau蛋白异常修饰学说、线粒体代谢障碍学说、兴奋性氨基酸毒性学说及基因突变学说等。在众多AD的致病机理假说中，淀粉样蛋白级联假说被越来越多的研究所证实。淀粉样蛋白级联假说认为脑内淀粉样蛋白前体(amyloid protein precursor,APP)的异常代谢使得Aβ的产量增多、降解减少，引起Aβ的大量聚集，形成寡聚体、原纤维和纤维等聚集体，进而形成淀粉样斑块，即老年斑。Aβ虽然不是唯一的致病原因，但是Aβ在阿尔兹海默病的发展中起着核心的作用，要认为大脑内过量的β-淀粉样蛋白及其聚集形成的聚集物是诱发AD的核心因素。并且Aβ会在大脑和血液间流通，因此血清中Aβ的含量可以作为检测AD的标志物。

目前，由于AD病因未明，诊断首先要根据临床表现作出痴呆的诊断，然后对病史、病程的特点、体格检查及神经系统检查、心理测试与辅助检查的资料综合分析，排除其他原因引起的痴呆，才能诊断为AD。最常用的有简易智能状态检查，是一个非常简单的测试工具。此外，阿尔兹海默病评定量表亦是国际通用的测试工具。这些检测需要医生具有丰富的经验和知识。还有一些其他的检测手段，比如影像学检查可见脑萎缩像，如侧脑室、三脑室增大；PET、SPECT、MRI可见顶叶低代谢区；脑电图检查早期α节律丧失及电位降低，常见弥散性慢波，且脑电图减慢的程度和痴呆严重程度相关；脑脊液检测tau蛋白、β淀粉样蛋白的提高等，这些方法都具有一些局限性。

如CN 106018827 A公开一种阿尔茨海默症检测标志物及其检测方法，所述提供的一组血清差异蛋白可用于阿尔茨海默症检测，但目前的方法缺乏准确性和特异性，并且需要病人出现一定的病理特征才能够检测到。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种类肽及其制备方法和应用，可以更简便、更灵敏、更低成本、无创伤的方法检测血液中β淀粉样蛋白含量来诊断和监控AD(阿尔茨海默症)，能够有效地通过血清中的Aβ来对病人和正常人血清进行区分。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种类肽，其特征在于，所述类肽包括乙二胺(Ⅰ)、4-苯基苄胺(Ⅱ)、β-苯乙胺(Ⅲ)、四亚甲基二胺(Ⅳ)、3,4-亚甲二氧基苄胺(Ⅴ)、异丁胺(Ⅵ)、R(+)-α-甲基苄胺(Ⅶ)、甘氨酸(Ⅷ)和3-氨基丙酸(Ⅸ)亚单位。

类肽(peptoid)是以N-取代甘氨酸为单元，与多肽结构相似的非天然折叠体。它可以折叠成高生物活性和高特异性的功能单元，且其组成单元比多肽更丰富，并能够耐受蛋白酶，因此，类肽化合物具有良好的生物活性和化学性质。

所述各亚单位的分子式如下所示：

根据本发明，所述类肽包含的亚单位的顺序为(Ⅰ-Ⅱ-Ⅰ-Ⅲ)_n-Ⅰ-Ⅱ-Ⅳ-Ⅴ-Ⅵ-Ⅳ-Ⅳ-Ⅶ-Ⅳ-Ⅷ-Ⅸ-Ⅲ-(Ⅸ-Ⅱ-Ⅸ-Ⅳ)_n，其中，所述n为3-7的正整数。

所述n例如可以是3、4、5、6或7，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

本发明中，所设计合成的类肽是中间嵌有能特异性识别β淀粉样蛋白的类肽嵌段的两亲性类肽，该两亲性类肽在气-液界面上自组装形成表面带有特异性识别β淀粉样蛋白的类肽环的类肽纳米片层。特异性识别β淀粉样蛋白的类肽环作为分子识别探针，可结合阿尔兹海默症生物标志物β淀粉样蛋白，而类肽纳米片层作为支架展示和支撑类肽环分子识别探针。利用该类肽纳米片层，结合表面等离激元共振技术，可用于阿尔兹海默症生化检测。

优选地，所述类肽具有式I所示的结构：

其中，所述n为3-7的正整数。

第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的类肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法通过固相亚单元合成法合成。

优选地，所述制备方法包括以下步骤：

(1)溴乙酸在N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)的活化下与前一亚单位的氨基反应形成酰胺键；

(2)加入伯胺通过亲核置换反应替换掉溴原子；

(3)重复步骤(1)和(2)直至完成所有亚单位的合成。

第三方面，本发明提供一种检测剂，所述检测剂包含如第一方面所述的类肽。

优选地，所述检测剂还包含药学上接受的辅料。

优选地，所述辅料为赋形剂、稀释剂、载体、调味剂、粘合剂和填充剂中的任意一种或至少两种的组合。

第四方面，本发明如第一方面所述的类肽或如第三方面所述的检测剂在制备检测、诊断或监控与β-淀粉样蛋白相关的疾病的药物中的应用。

优选地，所述疾病包括阿尔茨海默病。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明的类肽与Aβ结合能力较强，通过表面等离基元共振技术得到的本发明的类肽与Aβ的结合动力学常数中的平衡解离常数K_D为10^-10摩尔/升数量级；

(2)本发明类肽对血清中β-淀粉样蛋白具有高灵敏度，可以通过识别血清中的β-淀粉样蛋白进而对病人和正常人血清进行有效地区分，可利用表面等离基元共振技术检测类肽对AD病人与正常人血液信号强度，可以明显区分病人与正常人；

(3)本发明的类肽在发病早期就可进行检测，且无需给病人造成创伤，而且检测准确性高，特异性好；

(4)本发明类肽合成简单，成本低。

附图说明

图1为类肽的荧光显微图像，其中，图1(a)的标尺是50μm，图1(b)的标尺是20μm；

图2为类肽的原子力显微图像，其中，图2(a)的标尺是1μm，图2(b)的标尺是100nm；

图3为本发明的类肽分子与β-淀粉样蛋白结合的表面等离基元共振检测的结果，其中，Aβ分别在2.2μM、4.6×10^-1μM、9.1×10^-2μM、1.8×10^-2μM和3.6×10^-3μM浓度下与类肽的结合过程；

图4为本发明的类肽对AD病人与正常人血清信号的对比效果。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所述SPRi仪器为Plexera Kx5V2，Plexera Bioscience LLC,USA，该仪器主要装配有660nmLED光源、CCD图像采集器和带微流通道的传感芯片，仪器显示每个监测点上反射光强度随时间的变化并记录为SPR曲线。

除非特殊说明，本文中的“β-淀粉样多肽”指的是全长的β-淀粉样多肽Aβ1-42。

除非特殊说明，本文中的“AD病人”指的是阿尔兹海默症患者。

除非特殊说明，本文中的“μM”指的是“μmol/L”，“mM”指的是“m mol/L”。

实施例1类肽的制备

本发明类肽通过固相亚单元合成法合成，所述方法包括以下步骤：

(1)将2M溴乙酸和3.2M N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)加入Rink amide AM树脂(取代水平0.3mmol/g)中，在37℃下反应30min，将树脂末端的氨基酰化；

(2)再加入2M伯胺在37℃下反应90min，通过亲核取代反应替换掉溴原子，完成一个亚单位的合成；

(3)重复步骤(1)和(2)直至完成其余单位的合成；

(4)待合成完毕后，侧链保护基团被除去，并用95％三氟乙酸，2.5％超纯水，2.5％三异丙基硅烷将类肽从树脂上裂解下来备用。

制备得到的类肽的分子式如下：

本发明的类肽可以溶解到二甲基亚砜(DMSO)：水(2:1)混合溶液中，可以使类肽的母液浓度为2mM。

实施例2类肽的制备

本发明类肽通过固相亚单元合成法合成，所述方法包括以下步骤：

(1)将2M溴乙酸和3.2M N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)加入Rink amide AM树脂(取代水平0.3mmol/g)中，在37℃下反应30min，将树脂末端的氨基酰化；

(2)再加入2M伯胺在37℃下反应90min，通过亲核取代反应替换掉溴原子，完成一个亚单位的合成；

(3)重复步骤(1)和(2)直至完成其余单位的合成；

(4)待合成完毕后，侧链保护基团被除去，并用95％三氟乙酸，2.5％超纯水，2.5％三异丙基硅烷将类肽从树脂上裂解下来备用。

制备得到的类肽的分子式如下：

本发明的类肽可以溶解到二甲基亚砜(DMSO)：水(2:1)混合溶液中，可以使类肽的母液浓度为2mM。

实施例3类肽的制备

本发明类肽通过固相亚单元合成法合成，所述方法包括以下步骤：

(1)将2M溴乙酸和3.2M N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)加入Rink amide AM树脂(取代水平0.3mmol/g)中，在37℃下反应30min，将树脂末端的氨基酰化；

(2)再加入2M伯胺在37℃下反应90min，通过亲核取代反应替换掉溴原子，完成一个亚单位的合成；

(3)重复步骤(1)和(2)直至完成其余单位的合成；

(4)待合成完毕后，侧链保护基团被除去，并用95％三氟乙酸，2.5％超纯水，2.5％三异丙基硅烷将类肽从树脂上裂解下来备用。

制备得到的类肽的分子式如下：

本发明的类肽可以溶解到二甲基亚砜(DMSO)：水(2:1)混合溶液中，可以使类肽的母液浓度为2mM。

实验例4类肽纳米片层的形成

由于实施例1-3制备的类肽在检测效果基本一致，本发明采用实施例1制备的类肽进行后续的实验。

将类肽母液稀释到片层形成缓冲液(10mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸,100mM氯化钠,pH＝8.0)中，至最终浓度为1-100μM，优选20μM。

(1)手动摇晃法：将类肽溶液在室温下稳定存放22小时，然后手动轻轻摇晃30秒，再稳定1分钟，重复摇晃-稳定过程5次；

(2)机器摇晃法：将类肽溶液在管中自水平至垂直缓慢旋转(0.6rpm)，每隔450秒旋转一次；

将得到的类肽纳米片层溶液加入尼罗红，至最终浓度为1μM，将溶液放在1％琼脂上，使用荧光显微镜(Vert.A1,Carl Zeiss Far East,Germany)观察，结果如图1(a)和图1(b)所示，可以观察到明显的纳米片层结构。

将得到的类肽纳米片层溶液溶液(1μM)滴加到云母基底上，25℃孵育5分钟，然后小心用水冲洗，使用原子力显微镜(Bruker,MA,US)观察，结果如图2(a)和2(b)所示，可以观察到纳米片层表面是粗糙的，表面的突起物为特异性识别β淀粉样蛋白的类肽所形成的类肽环。

实验例5类肽与β-淀粉样蛋白间结合能力

利用表面等离子体共振成像技术测试类肽与β-淀粉样蛋白间结合能力的具体步骤如下：

(1)将类肽溶解到ddH₂O中，浓度为1-1000μM；

(2)将样品点在一张3D芯片表面上，每种样品重复3个点，4℃孵育12小时后，用10X PBS，1XPBS，超纯水清洗干。然后将芯片用1M盐酸氨基乙醇封闭30分钟，然后用超纯水清洗5次，最后用干净氮气吹干；

(3)将芯片安装在SPRi仪器上，测定SPRi角并调节至最佳光学位置，在检测区域选取相关检测点，包括样品点与空白点，设置实验流速为2μL/s；

(4)选择PBS为缓冲液通入流通池至基线稳定后依次通过浓度为2.2μM、4.6×10^-1μM、9.1×10^-2μM、1.8×10^-2μM和3.6×10^-3μM进行检测，结合时间为300秒，解离时间为300秒，每个浓度间通入磷酸进行重生。

检测结果如图3所示，经拟合，平衡解离常数K_D为1.09×10^-10摩尔/升。

实验例6类肽对血清信号的检测

利用表面等离子体共振成像技术测试类肽检测AD病人血清与正常人血清的具体步骤如下

(1)同实验例5，制作同样的3D芯片，安装在在SPRi仪器上，测定SPRi角并调节至最佳光学位置，在检测区域选取相关检测点，包括样品点与空白点，设置实验流速为2μL/s；

(2)选择PBS为缓冲液通入流通池至基线稳定后，分别通入不同病人与正常人的血清(1:5000)稀释，结合时间为300秒，解离时间为300秒，每个样品间通入磷酸和蛋白酶K进行重生。

检测结果如图4所示，在环形类肽含量较高的情况下，可以明显区分AD病人与正常人。

综上所述，本发明的类肽是一种对血清中β-淀粉样蛋白高灵敏度的类肽，为诊断和监控阿尔茨海默症疾病提供了新的选择。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。