胍基化壳聚糖的制备方法及其应用与流程

本发明涉及功能高分子材料领域，具体涉及一种胍基化壳聚糖的制备方法及采用胍基化壳聚糖制备抗菌性纳米微球的方法。

背景技术：

壳聚糖是自然界中广泛存在的甲壳素脱乙酰产物，分子表面的伯胺基(-NH₂)质子化后带正电，赋予了其抑菌特性，故壳聚糖也是普遍用于食品、医疗、农业等领域的天然抑菌剂。研究表明，高分子量的壳聚糖吸附在细菌细胞表面，可形成一层高分子膜，阻止了营养物质向细胞内的运输，因此对表层细胞壁结构的革兰氏阳性菌(G+)的抑菌效果显著；而低分子量的壳聚糖则可透过细胞膜进入细菌细胞内，与细胞内带负电的物质结合，使细胞的正常生理功能受到影响，导致细菌死亡，该方式对革兰氏阴性菌(G-)的抑制效果更佳。但是，由于壳聚糖仅可在酸性环境下溶解，故其在中性及碱性环境下的抑菌性能受到了限制。

胍基是目前被发现的自然界中碱性最强(碱性与NaOH相当)的有机碱，其与壳聚糖pKa10.8的伯胺基相比，pKa 12.5的胍基质子化能力更强，同时通过共振互变，形成的亚胺阳离子更加稳定。胍基在生理pH(7.35)环境中能够完全质子化，而且在酸性到碱性很大跨度条件下都能够保持较好的抑菌性能。现有技术中，胍基化壳聚糖的合成主要采用精氨酸在水溶液中以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)活化，然后与壳聚糖连接的路线，胍基与壳聚糖上伯胺基的接枝效率较低，同时还会与壳聚糖侧链羟基发生副反应。

目前国内外研制的抗菌性药物以抗生素、抗菌肽为主导，抗菌性材料则大多负载了抗菌性药物或复合了金、银、碘等抗菌性粒子。其中，抗生素的抗菌效果显著，但由于长期不合理使用，细菌已对抗生素产生了严重的耐药性，抗生素的应用成为了影响人类及动物长期健康发展的双刃剑；抗菌肽提取于天然生物体中，由10～50个氨基酸组成，富含疏水和碱性氨基酸残基，被认为是最有前途的抗生素替代产品，但作为生物体来源的药物仍不可避免的存在安全性、稳定性、生产成本过高等问题；金、银、碘等抗菌粒子虽具备一定的抗菌特性，但其不可吸收亦不可降解，可用于皮肤表层的抗菌消炎，却不能在体内应用。

溶菌酶是专一作用于细菌细胞壁的天然抗菌蛋白，可通过切断细胞壁的肽聚糖网络从而分解细菌，对表层细胞壁结构的革兰氏阳性菌(G+)的抑菌效果较好。但是，革兰氏阴性菌(G-)的细胞壁表层覆盖了一层脂质外膜难以穿透，其影响了溶菌酶对G-的抑制作用。

技术实现要素：

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种胍基化壳聚糖的制备方法，通过对壳聚糖进行胍基化改性，以提高其生物碱性及水溶性，并增强其对电负性细胞膜的作用能力，通过提供的胍基化壳聚糖制备方法，在无水甲醇中以N,N'-羰基二咪唑活化精氨酸，再对壳聚糖进行接枝，以期提高壳聚糖胍基化的接枝率。

本发明还有一个目的是提供一种采用胍基化壳聚糖制备抗菌性纳米微球的方法，该方法以硫酸葡聚糖为交联剂，制得包裹有溶菌酶的胍基化壳聚糖纳米微球，其利用中低分子量胍基化壳聚糖对细胞膜的穿透作用破坏G-外膜脂质结构的稳定性，使内壁层的肽聚糖暴露出来，进而被溶菌酶水解，通过二者协同作用，增强对G-的抑制效果。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种胍基化壳聚糖的制备方法，其包括以下步骤：

步骤一、羧基活化精氨酸的制备：取精氨酸与N,N'-羰基二咪唑的摩尔比为1：0.2～5，溶于无水甲醇中反应1～5h，反应温度为-20～25℃，备用；

所述步骤一的合成路线为：

步骤二、胍基化壳聚糖的制备：取一定量壳聚糖溶于2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(MES)水溶液中，将步骤一制得的羧基活化精氨酸溶液直接滴加至壳聚糖溶液中，其中壳聚糖与步骤一中羧基活化精氨酸的摩尔比为1：30～300，室温下搅拌2～20h，真空状态下除去溶剂，产物溶解在超纯水中，透析，冻干，得到胍基化壳聚糖；

所述步骤二的合成路线为：

优选的是，所述的胍基化壳聚糖的制备方法，其中，所述壳聚糖的分子量为5～60kDa，脱乙酰度>85％。

一种采用上述制得的胍基化壳聚糖制备抗菌性纳米微球的方法，其中，以硫酸葡聚糖的水溶液为底液，将含有溶菌酶的胍基化壳聚糖水溶液以一定速率滴加到所述底液中，室温下高速搅拌，自然沉降过夜，4℃离心(速率5000xg)，取下层沉淀，冻干，得到抗菌性纳米微球；其中，所述胍基化壳聚糖、所述硫酸葡聚糖及所述溶菌酶的质量比为：0.1～1:1:0.2～1。

优选的是，所述的制备抗菌性纳米微球的方法，其中，所述抗菌性纳米微球的粒径为40～100nm。

优选的是，所述的制备抗菌性纳米微球的方法，其中，所述溶菌酶的浓度为0.5～5mg/mL，所述胍基化壳聚糖的浓度为1～5mg/mL，所述硫酸葡聚糖的浓度为1～5mg/mL。

优选的是，所述的制备抗菌性纳米微球的方法，其中，以2mL硫酸葡聚糖的水溶液为底液，将含有溶菌酶的胍基化壳聚糖水溶液以1～30mL/h速率滴加到所述底液中，滴加量为0.2～2mL，室温下高速搅拌，搅拌速率为100～1000rpm，搅拌时间为10～30min，自然沉降过夜，4℃离心(速率5000xg)20min，取下层沉淀，冻干，得到抗菌性纳米微球。

应用上述抗菌性纳米微球制备抗菌性生物制剂或抗菌材料。

如上所述，本发明公开的胍基化壳聚糖的制备方法及采用胍基化壳聚糖制备的抗菌性纳米微球具有以下有益效果：

(1)本发明采用在非水溶剂中先将精氨酸的羧基活化为环内酯结构，再进一步与壳聚糖反应的工艺路线，提高了壳聚糖上伯胺基的胍基化接枝率，避免了副反应的发生。与壳聚糖原有的伯氨基相比，胍基结构的共轭效应分散了精氨酸化壳聚糖表面的正电荷密度，使得细胞毒性更低；

(2)本发明的抗菌性纳米微球采用了胍基化壳聚糖包裹溶菌酶的协同抑菌思路；利用中低分子量胍基化壳聚糖的细胞膜穿透性质，以及溶菌酶的细胞壁专一分解能力，共同增强微球对G-的抗菌效果，实现了该抗菌性微球的广谱抑菌作用；

(3)本发明的抗菌性微球原料安全，制备工艺简单，微球可生物降解，生物相容性好，可以作为抗菌性生物制剂应用，或负载在其他材料表面作为抗菌性组分应用。

附图说明

图1为本发明制备的胍基化壳聚糖的红外光谱图(a：壳聚糖；b：胍基化壳聚糖GCS1；c：胍基化壳聚糖GCS2)；

图2为本发明制备的抗菌性纳米微球的SEM图。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。

实施例1

称取精氨酸2.0g，N,N'-羰基二咪唑4.84g，溶于50mL无水甲醇，在0～5℃下搅拌3小时，得到羧基活化的精氨酸，备用。称取壳聚糖(粘均分子量15kDa，脱乙酰度90％)2.7g溶于100mL MES水溶液，然后将上一步制得的羧基活化精氨酸直接滴加至壳聚糖溶液中，滴加完毕后，室温下搅拌6h。真空状态下除去溶剂，产物溶解在超纯水中，透析(MWCO 6000)3～4天，冷冻干燥。制得的胍基化壳聚糖GCS1红外光谱如图1中(b)所示，元素分析得胍基接枝率为34.8％。

实施例2

称取精氨酸1.9g，N,N'-羰基二咪唑3.72g，溶于100mL无水甲醇，在25℃下搅拌6小时，得到羧基活化的精氨酸，备用。称取壳聚糖(粘均分子量8kDa，脱乙酰度88％)1.6g溶于100mLMES水溶液，然后将上一步制得的羧基活化精氨酸直接滴加至壳聚糖溶液中，滴加完毕后，室温下搅拌20h。真空状态下除去溶剂，产物溶解在超纯水中，透析(MWCO 3400)3～4天，冷冻干燥。制得的胍基化壳聚糖GCS2红外光谱如图1中(c)所示，元素分析得胍基接枝率为45.2％。

实施例3

配置含溶菌酶的胍基化壳聚糖(粘均分子量15kDa，胍基接枝率34.8％)水溶液，其中溶菌酶的浓度为1mg/mL，胍基化壳聚糖的浓度为1mg/mL。配置2mg/mL的硫酸葡聚糖水溶液。以2mL硫酸葡聚糖为底液，采用注射泵以10mL/h的速度向其中加入0.8mL含溶菌酶的胍基化壳聚糖溶液，底液的搅拌速度为500rpm，滴加完毕后继续搅拌10min。自然沉降过夜，4℃离心(速率5000xg)20min，取下层沉淀，冻干，得到抗菌性纳米微球。该纳米微球的溶菌酶包封率为45.78％，载药率为27.62％。

实施例4

配置含溶菌酶的胍基化壳聚糖(粘均分子量8kDa，胍基接枝率45.2％)水溶液，其中溶菌酶的浓度为1.5mg/mL，胍基化壳聚糖的浓度为4mg/mL。配置3mg/mL的硫酸葡聚糖水溶液。以2mL硫酸葡聚糖为底液，采用注射泵以2mL/h的速度向其中加入1.5mL含溶菌酶的胍基化壳聚糖溶液，底液的搅拌速度为700rpm，滴加完毕后继续搅拌20min。自然沉降过夜，4℃离心(速率5000xg)20min，取下层沉淀，冻干，得到抗菌性纳米微球，如图2所示。该纳米微球的溶菌酶包封率为50.37％，载药率为31.22％

实施例5

以革兰氏阴性菌大肠杆菌(E.coli)为细菌模型，选取对数生长期的细菌进行纳米微球抑菌活性研究。具体方法为：从37℃培养16～20h的平板中挑取一个单菌落(直径2～3mm)，转到一个含有100mL SOB培养基的1L烧瓶中，于37℃剧烈振培6～7h，每隔15～20min测定OD600值来检测。当OD值达到0.35时，收获细菌。

取胍基化壳聚糖(粘均分子量8kDa，胍基接枝率45.2％)包裹溶菌酶制备的系列纳米微球，以20g/L的浓度加入到细菌培养液中，生化培养箱(或摇床)中37℃培养，24h后取出细菌样品，测定OD600nm值，评价抗菌微球制备过程中胍基化壳聚糖和溶菌酶的浓度对大肠杆菌(E.coli)抑制率的影响。

表1胍基化壳聚糖/溶菌酶纳米微球的E.coli抑制率

比较例1

以壳聚糖(粘均分子量8kDa，脱乙酰度88％)包裹溶菌酶制备系列纳米微球，然后以20g/L的浓度加入到E.coli细菌培养液中，生化培养箱(或摇床)中37℃培养，24h后取出细菌样品，测定OD600nm值，评价未进行胍基化的壳聚糖包裹溶菌酶制备的纳米微球对大肠杆菌(E.coli)抑制率的影响。

表2壳聚糖/溶菌酶纳米微球的E.coli抑制率

比较例2

称取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)0.6g，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)0.14g,溶于100mL MES水溶液中，然后加入精氨酸1.11g，搅拌2h使之活化。加入壳聚糖(粘均分子量8kDa，脱乙酰度88％)2.7g，室温搅拌24h后加入0.25g盐酸羟胺终止反应，用NaOH调节溶液PH至9左右，透析(MWCO 3400)3～4天，冷冻干燥。元素分析得胍基接枝率为10.5％。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。