一种茶黄素复合物的制备方法与流程

本发明属于茶黄素复合物制备及纯化领域，具体涉及一种高纯度茶黄素复合物的制备和纯化方法。
背景技术：
：茶黄素类化合物（theaflavins）是一类易溶于乙酸乙酯的、具有苯并卓酚酮结构的化合物的总称，由儿茶素类物质氧化形成，是决定红茶色香味及品质的重要成分，现已明确结构的茶黄素组分有22种，其中茶黄素（theaflavin，tf1）、茶黄素-3-没食子酸酯（theaflavins-3-gallate，tf2a）、茶黄素-3′-没食子酸酯（theaflavins-3′-gallate，tf2b）、茶黄素双没食子酸酯（theaflavins-3，3′-digallate，tf3）和表茶黄棓灵-3-没食子酸酯（epitheaflagallin-3-gallate，tf4）是主要成分。茶黄素类化合物是红茶的主要成分，被誉为茶叶中的“软黄金”，安全性高。茶黄素类化合物还具有广泛的生理活性和药理作用，如抗心血管系统疾病、抗炎、免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、抗糖尿病等。但是茶黄素类化合物制备的产业化工艺技术尚不成熟，产品纯度低、成本高、产能低，严重妨碍了以茶黄素为原料的天然药物、功能性食品以及化妆品的研究及开发。目前，制备高纯度茶黄素复合物的方法主要是大孔树脂法和聚酰胺树脂法。如中国专利cn102605016a公开的高纯茶黄素复合物的制备方法中选用了聚酰胺粉或nka大孔吸附树脂，制得茶黄素总量为80%的高纯茶黄素复合物。但是大孔树脂法和聚酰胺树脂法也存在各自的弊端。大孔吸附树脂主要通过化合物的极性不同进行分离，有文献将本领域常用的5种大孔树脂（ab-8，hpd-300，hpd-100，nka-2，nka）进行比较，研究其对高纯茶黄素复合物分离的效果，其中被认为最适合分离的hpd-300树脂解吸率为91.7%，仅得到纯度为67.2%的高纯茶黄素复合物，且整个洗脱过程需要调节ph值；其次，nka-9树脂解吸率为69.7%，得到高纯茶黄素复合物纯度为44.1%，同时需要调节ph值。所以使用大孔吸附树脂分离高纯茶黄素复合物存在解吸率低（即存在死吸附），以及除杂效果不理想的问题。有关聚酰胺树脂分离高纯茶黄素复合物也有很多文献报道。由于茶黄素类化合物具有多羟基结构，易与聚酰胺产生较强烈的吸附作用，所以对洗脱溶剂要求较高，死吸附大，树脂重复利用率低，而且上样量有限，成本较高。此外，由于红茶中茶黄素的含量低，依靠红茶为原料提取茶黄素成本过高，有研究表明用酶促氧化反应法可得到茶黄素粗品，但功能活性的物质基础是高纯茶黄素，因此有必要研究如何快速、简便、节省能源制得高纯茶黄素。技术实现要素：本发明的发明目的在于克服现有技术中大孔吸附树脂法和聚酰胺树脂法的不足，提供一种高纯度茶黄素复合物的纯化方法，能够高效、简便、低成本地制得高纯度茶黄素复合物。本发明提供的一种制备茶黄素复合物的方法，所述方法包括：（a）提供茶黄素粗品；（b）将茶黄素粗品溶解于特定的极性有机溶剂水溶液中，上样于装有mci树脂的层析柱，先用2~4bv20~40%体积浓度的所述极性有机溶剂水溶液洗脱，再用50~80%体积浓度的所述极性有机溶剂水溶液洗脱，收集50~80%体积浓度的洗脱液，其中所述极性有机溶剂水溶液为乙醇水溶液、甲醇水溶液或丙酮水溶液；以及（c）回收洗脱液中的有机溶剂，提取，干燥得所述茶黄素复合物。在一些实施方式中，所述步骤（c）中的提取是指以等体积的乙酸乙酯充分萃取，并回收酯层中的乙酸乙酯。在一些实施方式中，步骤（c）中的回收为在35~45℃真空干燥。在一些实施方式中，步骤（b）中的洗脱速度为以0.8~1.2bv/h。在一些实施方式中，步骤（b）中的mci树脂选自chp20/p20、chp20/p30、chp20/p50、chp20/p70、chp20/p120、chp50/p30、chp50/p20、csp50/p10、chp07/p120、cmg20/p10、cmg20/p30和cmg20/p150。优选地，所述mci树脂选自chp20/p20、chp20/p30、chp20/p50、chp20/p70、chp20/p120、chp50/p30、chp50/p20、csp50/p30和chp07/p120。更优选地，所述mci树脂为chp20/p20、chp20/p30、chp20/p50、chp20/p70、chp20/p120、chp07/p120中的一种。所述mci树脂可购自例如三菱化学株式会社（日本，东京）。在一些实施方式中，步骤（a）中所述茶黄素粗品是经酶法制备或化学法制备，或市售所得。在一些实施方式中，所述茶黄素粗品是将绿茶提取物经多酚氧化酶氧化反应后所得。在一些实施方式中，所述茶黄素粗品是将绿茶提取物经化学氧化剂氧化反应后所得。市售的茶黄素粗品规格不一，可购自不同厂商，如西安昌岳生物科技有限公司所售红茶提取物。本发明另一方面提供一种制备茶黄素类单体化合物的方法，所述茶黄素类单体化合物选自以下化合物中的任何一种：茶黄素、茶黄素-3-没食子酸酯、茶黄素-3′-没食子酸酯、茶黄素双没食子酸酯和表茶黄棓灵-3-没食子酸酯，所述方法包括：（i）按权利要求1所述的方法制备茶黄素复合物；以及（ii）从所述茶黄素复合物中分离得到纯化的任一所述茶黄素类单体化合物。本发明的方法使用了mci树脂对茶黄素样品进行纯化分离，回收率趋近100%，不存在死吸附，对部分纯度不高的茶黄素复合物可再次进行柱层析分离，重复利用度高，不损失样品。现有技术中尚未有任何一种色谱填料柱能对茶黄素回收率达100%，因而mci层析柱特别适合用于茶黄素的高效提取纯化。特别重要的是，本发明的方法在提高回收率的同时，制备所得产品中茶黄素复合物的纯度超过85%，甚至达到90%以上。本发明的方法中使用的mci树脂与大孔吸附树脂、聚酰胺树脂相比分离性能更高，吸附量大，即可增加上样量。此外，该树脂ph适用范围广（ph2-ph12或全范围），可在中性、酸性、碱性条件下使用，对其使用寿命影响不大。最后，该树脂具备了凝胶和大孔树脂的优点，即可以根据化合物极性差别进行分离，又可以根据分子量不同进行分离，所以分离效果更好，除杂能力更强。附图说明图1为绿茶多酚提取物的hplc图谱。图2为茶黄素粗品的hplc图谱。图3为茶黄素粗品hplc图谱的放大图。图4为高纯茶黄素复合物的hplc图谱。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明作进一步的解释说明，但具体实施例并不对本发明作任何限定。除非特别说明，实施例中所涉及的试剂、方法均为本领域常用的试剂和方法。所用试剂如乙酸乙酯、乙醇、甲醇、丙酮等均为分析纯。实施例中所使用的常规原料和仪器如下：高效液相色谱仪：日本岛津公司shimadzulc-20a高效液相色谱仪，含lc-20ab二元高压泵，il-20a自动进样器，spd-m20a二级管阵列检测器以及shimadzulc-solution色谱工作站。hplc色谱分析参数：色谱柱为c18（4.6mmi.d.×250mm,5μm），流动相a为乙腈-乙酸乙酯（体积比7:1），流动相b为2%乙酸，等度洗脱，流动a为23%，流速1ml/min；柱温为室温；检测波长为280nm；进样体积为10μl。玻璃层析柱：5.5cm×30cm。在本发明中，“茶黄素复合物”是指含有茶黄素、茶黄素-3-没食子酸酯、茶黄素-3′-没食子酸酯、茶黄素双没食子酸酯和表茶黄棓灵-3-没食子酸酯的复合物，该复合物中可能还包含其他物质。在本发明中，“茶黄素粗品”是指红茶提取物、或从天然来源材料（如茶叶，例如绿茶）提取物经酶法或化学法制备得到的含有一种或多种茶黄素类化合物的混合物。实施例1茶黄素粗品为绿茶多酚提取物（儿茶素类成分>80%，其中表没食子儿茶素没食子酸酯egcg>40%）经多酚氧化酶反应生成，经测定，其茶黄素复合物总含量为4.06%（其中tf1为0.67%，tf2a为1.20%，tf2b为0.86%，tf3为0.88%，tf4为0.45%）。按19g茶黄素粗品（含茶黄素复合物770mg）加50ml30%体积浓度的乙醇水溶液的比例，将上述茶黄素粗品用乙醇水溶液溶解，上样于装有mcichp20p的层析柱（5.5cm×30cm），先用2bv30%体积浓度的乙醇水溶液以1.0bv/h的流速洗脱，再用70%体积浓度的乙醇水以1.0bv/h的流速洗脱，收集70%体积浓度的乙醇水洗脱液，将洗脱液在30℃真空浓缩，回收乙醇；再用等体积的乙酸乙酯充分萃取，酯层在45℃真空干燥，回收乙酸乙酯，干燥得高纯茶黄素复合物粉末877.40mg（纯度85.78%，其中tf1为12.42%，tf2a为21.15%，tf2b为18.90%，tf3为19.02%，tf4为14.29%），回收率97.74%（高纯茶黄素复合物中茶黄素复合物的量/粗品中茶黄素复合物的量*100%）。绿茶多酚提取物、茶黄素粗品、高纯茶黄素复合物的hplc图谱见图1至图4。实施例2茶黄素粗品为绿茶多酚提取物经多酚氧化酶生成，其茶黄素复合物含量为8.65%（其中tf1为0.98%，tf2a为2.30%，tf2b为2.32%，tf3为2.11%，tf4为0.93%）。按16g茶黄素粗品（含茶黄素复合物1.38g）加40ml40%体积浓度的乙醇水溶液的比例，将上述茶黄素粗品用乙醇水溶液溶解，上样于装有mcichp20p的层析柱，先用4bv40%体积浓度的乙醇水溶液以1.0bv/h的流速洗脱，再用60%体积浓度的乙醇水以1.0bv/h的流速洗脱，收集60%体积浓度的乙醇水洗脱液，将洗脱液在30℃真空浓缩，回收乙醇；再用等体积的乙酸乙酯充分萃取，酯层在45℃真空干燥，回收乙酸乙酯，干燥得高纯茶黄素复合物粉末1.39g（纯度91.83%，其中tf1为12.35%，tf2a为26.67%，tf2b为18.37%，tf3为18.44%，tf4为16.01%），回收率92.49%。实施例3茶黄素粗品为市售祁门红茶提取物，经测定，其茶黄素复合物含量为7.26%（tf1为0.95%，tf2a为1.40%，tf2b为1.94%，tf3为2.18%，tf4为0.80%）。按15g茶黄素粗品（含茶黄素复合物1.09g）加40ml25%体积浓度的甲醇水溶液的比例，将上述茶黄素粗品用甲醇水溶液溶解，上样于装有mcichp20p的层析柱，先用2bv25%体积浓度的甲醇水溶液以1.0bv/h的流速洗脱，再用80%体积浓度的甲醇水以1.0bv/h的流速洗脱，收集80%体积浓度的甲醇水洗脱液，将洗脱液在30℃真空浓缩，回收乙醇；再用等体积的乙酸乙酯充分萃取，酯层在45℃真空干燥，回收乙酸乙酯，干燥得高纯茶黄素复合物粉末1.19g（纯度88.96%，其中tf1为10.22%，tf2a为28.76%，tf2b为19.26%，tf3为18.69%，tf4为12.03%），回收率97.25%。对比例1茶黄素粗品为取绿茶多酚提取物经多酚氧化酶反应生成，经测定，其茶黄素复合物总含量为4.06%（其中tf1为0.94%，tf2a为0.88%，tf2b为0.86%，tf3为0.51%，tf4为0.87%）。按8.6g茶黄素粗品（含茶黄素复合物349.2mg）加20ml20%体积浓度的乙醇水溶液的比例，将上述茶黄素粗品用乙醇水溶液溶解，上样于装有mcichp20p的层析柱，先用2bv20%体积浓度的乙醇水溶液以1.0bv/h的流速洗脱，再用90%体积浓度的乙醇水以1.0bv/h的流速洗脱，收集90%体积浓度的乙醇水洗脱液，将洗脱液在30℃真空浓缩，回收乙醇；再用等体积的乙酸乙酯充分萃取，酯层在45℃真空干燥，回收乙酸乙酯，干燥得精制茶黄素复合物粉末769.94mg（纯度45.34%，其中tf1为9.50%，tf2a为9.46%，tf2b为9.49%，tf3为5.80%，tf4为11.09%），回收率99.99%。对比例2茶黄素粗品为取绿茶多酚提取物经多酚氧化酶反应生成，经测定，其茶黄素复合物总含量为4.68%（其中tf1为0.60%，tf2a为1.53%，tf2b为1.01%，tf3为1.03%，tf4为0.51%）。15g茶黄素粗品（含茶黄素复合物702.00mg）加40ml50%体积浓度的乙醇水溶液的比例，将步骤s1中的茶黄素粗品用乙醇水溶液溶解，上样于装有mcichp20p的层析柱，先用2bv50%体积浓度的乙醇水溶液以1bv/h的流速洗脱，再用90%体积浓度的乙醇水以1.0bv/h的流速洗脱，收集90%体积浓度的乙醇水洗脱液，将洗脱液在30℃真空浓缩，回收乙醇；再用等体积的乙酸乙酯充分萃取，酯层在45℃真空干燥，回收乙酸乙酯，干燥得高纯茶黄素复合物产品466.21mg（纯度93.96%，其中tf1为10.22%，tf2a为30.76%，tf2b为20.26%，tf3为20.69%，tf4为12.03%）回收率62.40%。将实施例1-3及对比例1-2的茶黄素复合物纯度及回收率汇总于下表1中，从表1可以看出实施例1-3对茶黄素复合物的回收率大于90%，趋近100%，同时产品中茶黄素复合物的含量超过85%。表1各实施例茶黄素复合物回收率及精制产品中茶黄素含量比较茶黄素回收率（%）产品中茶黄素复合物含量（%）实施例197.7485.78实施例292.4991.83实施例397.2588.96对比例199.9945.34对比例262.4093.96当前第1页12