能矿化固定重金属离子的菌LRP3及其应用的制作方法

本发明属于应用环境微生物
技术领域：
，具体涉及一种能通过生物矿化作用快速固定重金属离子的菌LRP3，及其在治理重金属污染环境中的应用。
背景技术：
：由于污水灌溉、工业生产废水污染和高重金属含量有机肥的大量使用，土壤中重金属的含量逐渐增加，已经成为严重影响土壤和水环境质量的一类重要污染物。重金属在环境中无法被降解，并且在土壤及水体中又可通过各种物理、生物和化学过程而滞留，其活性也会随着环境条件的改变其活性又会发生变化，因此重金属污染环境的治理存在难度大和易反复的缺点。目前土壤中重金属污染的治理方法包括物理、化学、生物法以及联合方法等。物理化学法主要是通过挥发等物理过程，化学法主要是通过投加化学试剂，产生化学反应来降低污染物的毒性，这两种方法存在成本高、易二次污染、土壤生产功能丧失或下降等缺点。生物法包括植物法、微生物法和二者的联合方法等，由于植物生长需要一定的土壤环境质量及受到生长周期的影响，在我国北方尤其是东北地区，植物修复存在修复时间短、效果差等缺点。微生物法是利用微生物的吸附、吸收和代谢等过程降低土壤中重金属的有效性或水相中重金属离子的浓度，但重金属被微生物吸附或吸收后会随着细胞的死亡而再次释放。自然界中存在一类微生物，他们可以通过代谢活动降解含磷有机物从而释放大量的磷酸根离子，在特定的条件下通过成矿作用形成性质稳定的结晶物质。如果将这类微生物在特定条件下进行富集培养并通过人工干预来强化其对环境中重金属的固定作用，将会实现土壤重金属污染的快速高效修复，而且存在环境友好、不易产生二次污染、成本低和可实现边修复边生产的优点。如钱春香等人利用枯草芽孢杆菌进行土壤中重金属离子的矿化固定研究，通过这些菌剂的使用能够将铜、锌等重金属矿化成稳定的矿物态，从而降低其环境危害性。外源微生物进入土壤后，由于受到土壤组成及土著微生物竞争的影响，在土壤中的定植能力较差，因此影响了土壤中重金属的长期矿化效果。如果针对特定地域的土壤及使用功能，分离出在土壤中具有数量优势，且能对重金属进行生物矿化的菌株，不仅可通过使用发酵液来快速稳定土壤中的重金属，而且还能通过微生物定植后的自然矿化过程来延长土壤中重金属离子的稳定效果，而后者对于实现重金属中轻度污染土壤边修复边生产尤为重要。技术实现要素：本发明的目的是为解决重金属污染土壤修复过程中存在的效果不稳定、成本高和易二次污染的问题，提供一种能矿化固定重金属离子的菌LRP3及其应用。本发明能矿化固定重金属离子的菌LRP3，为保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCCNO.13347的拉恩氏菌Rahnellasp.。该菌LRP3是从环境中分离出能通过分泌植酸酶和碱性磷酸酶来降解植酸，从而释放磷酸根的土著微生物，其发酵产物可通过生物矿化作用来快速沉淀固结土壤和水溶液中的重金属离子，形成性质稳定的矿化产物，并且该菌还可定植于土壤中，增强土壤中重金属的自然矿化过程。本发明能矿化固定重金属离子的菌LRP3通过以下方式获得：1、菌株的筛选(1)蔬菜根际土壤优势菌的筛选2015年从长春市市郊、敦化、延吉和辽源等地长期使用有机肥的设施蔬菜生产基地内采集300个含有根际土壤的小白菜整株样品，采用抖根法分别收集每株蔬菜的根际土壤，将涵盖所有采样点的50个根际土壤样品为一组制备混合土样，共获得6个混合土样。每个混合土样称取10g加入到盛有90mL无菌水的250mL三角瓶中，在25℃和180rpm条件下振荡1-2h，然后静置30min。取1mL上部悬浊液加入装有9m：无菌水的试管中，梯度稀释至10-6。分别取10-4、10-5、10-6三个稀释度的悬浊液0.2mL涂布于牛肉膏蛋白胨培养基上，筛选出数量较多的22株细菌。(2)产植酸酶和碱性磷酸酶菌株的筛选将步骤(1)获得的菌株分别接种至培养基中培养，定期测定培养液的OD600、磷酸根离子浓度、植酸酶、磷酸酶和培养液的pH。具体实验步骤如下：a.取一环保存于4℃冰箱中的单菌株(保存时间不超过7天)接种至100mL牛肉膏蛋白胨培养基中，在25℃和160rpm下培养24-36h，然后转移至离心管中在4℃和8000rpm下离心5min，倒掉上清液，每个离心管中加入50mL无菌水，漩涡振荡10s，然后再离心去掉上清液，反复清洗2-3遍，再将菌体细胞悬浮于无菌水中，制备成含有107-108个细胞/mL的菌悬液。b.按照2％的比例将菌悬液接种至培养基中，在25℃和160rpm下培养27h，每隔3h采集样品测定OD600、pH、酶活性和磷酸根离子的浓度，筛选出综合效果较好的株菌。每100mL所述培养基的组成为：植酸钠0.15-0.2g、牛肉膏0.2-0.3g、蛋白胨0.3-0.5g、氯化钠0.3-0.5g，余量为水，pH为7.0-7.2。(3)重金属耐性菌株的筛选将步骤(2)中获得的菌株分别接种至含有不同浓度重金属离子的牛肉膏蛋白胨培养基中培养，筛选出在高浓度重金属的培养基中能良好生长的菌株为目标菌。具体步骤如下：a.制备0.1mol/L的Cu、Pb、Cd贮备液，然后逐级稀释，再加入到牛肉膏蛋白胨培养基中，使得Cu、Zn、Pb和Cd的最终浓度分别为1.0mmol/L、1.0mmol/L、0.5mmol/L和0.1mmol/L。b.按照步骤(2)中的方法制备菌悬液，以2％的比例接种至含重金属的培养基中，在25℃和160rpm下振荡培养39h，测定OD600，最终筛选出耐重金属的菌株。命名为LRP3。(4)矿化产物分析将步骤(3)获得的菌株加入到培养基中培养获得发酵物，然后将重金属溶液加入到发酵物中矿化沉淀，收集沉淀物，进行电镜扫描、X-射线衍射和红外光谱分析。具体步骤如下：a.按照步骤(2)的方法制备菌悬液，以2％的比例接种至200mL的培养基中在25℃和160rpm下培养12-15h。利用氯化铜、氯化隔和氯化铅制备0.1mol/L的重金属溶液。在室温下向200mL发酵液中分别快速加入5mL、10mL、10mL的重金属溶液，静置1-2h，期间观察沉淀过程和溶液颜色变化。沉淀结束后，将沉淀产物过滤后转移至培养皿中放入烘箱，在50℃下烘干至恒重。将烘干的样品用玛瑙研钵研磨后过孔径为300目的筛子用于X-射线衍射测定。将烘干的样品取一部分，用于电镜扫描分析。将上清液过0.45微米的滤膜后用石墨炉原子吸收分光光度计测定Pb以及空气乙炔原子吸收分光光度计测定Cu、Zn和Cd的浓度。通过粒径大小和矿化产物的生成与否来筛选出耐重金属磷酸盐矿化菌。通过上述步骤本发明筛选出了能在培养基中快速生长和产碱的菌株LRP3。从附图1、2可以看出菌株LRP3在培养基中可同时产植酸酶和碱性磷酸酶，最大活性分别可达到50U/mL和1.87U/mL发酵液。附图3表明溶解性磷酸根离子的浓度也随着菌体细胞的生长而增加，最大浓度为287mg/L。菌LRP3对重金属的抗性如下表所示：重金属最大耐受浓度(mg/L)Cu115Zn105Pb160Cd75可以看出对重金属Cu、Zn、Pb、Cd的最高耐受浓度分别为115mg/L、105mg/L、160mg/L和75mg/L。附图4、5的X-射线衍射图表明Cu和Zn的矿化产物的分子式分别为Cu2(PO4)(OH)和Zn2(PO4)(OH)。从附图6、7的电镜扫描图可看出Cd和Cu的矿化产物具有整齐的晶体排布，平均粒径分别达到2μm和10μm。从附图8的红外光谱图中可以看出Cu、Zn、Pb和Cd的矿化产物中同时存在-OH和P-O基团。以上结果表明菌株LPR3发酵液能够通过生物矿化作用降低重金属的活性。2、菌株的鉴定和保藏从菌落特征、细胞形态、革兰氏染色征和16SrRNA基因序列分析等多个角度对菌株LRP3进行了鉴定。结果表明，在牛肉膏蛋白胨固体平板上生长24小时后，菌株LRP3呈乳白色不透明的圆形菌落,直径1.5mm左右，中央隆起，表面及边缘均光滑，粘而附于培养基上。革兰氏染色镜检为阴性菌,细胞成杆状，可形成不同长度的链状，静止期成球形，常成对，无芽孢。菌株LM1能利用D-葡萄糖、D-纤维二糖、不利用苯丙氨酸、鸟氨酸、赖氨酸以及精氨酸，能在柠檬酸盐(钠)、丙二酸盐中生长。氧化酶阴性，触酶阳性，不产硫化氢，可利用琥珀酸盐产碱，对卡那霉素无抗性，葡萄糖产酸。16SrRNA基因序列分析和同源性比较表明菌株LRP3与拉恩氏菌的同源性最高(见附图9)。综合上述结果，菌株LRP3被鉴定为拉恩氏菌。该菌株LRP3于2016年11月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，分类命名为：拉恩氏菌Rahnellasp.，保藏编号为CGMCCNo.13347，保藏日期：2016年11月28日。应用本发明菌LRP3治理重金属污染环境的研究试验：1、LRP3菌发酵液的制备将本发明菌LRP3菌株接种至牛肉膏蛋白胨培养基中富集培养，然后制备成细胞数量为107-108个细胞/mL的菌悬液，按照2％的比例加入到培养基中，在25℃和160rpm下培养12-15h，即得LRP3菌发酵液。每100mL所述的培养基的组成为：植酸钠0.15-0.2g、牛肉膏0.2-0.3g、蛋白胨0.3-0.5g、氯化钠0.3-0.5g，余量为水，pH为7.0-7.2。2、LRP3菌发酵液对养殖废水中重金属的矿化作用试验将上述制备的LRP3菌发酵液按照磷酸根与水溶态重金属离子总量的摩尔比为1:2-1:1.5的比例加入到采集的养猪场排放的废水样中，静置0.5-2h，离心后测定上清液中的重金属离子浓度，测定Cu、Pb、Zn和Cd离子浓度，计算出重金属的去除率。结果表明菌株LRP3对废水中重金属的去除率均可达到90％以上。3、LRP3菌发酵液对土壤中重金属的矿化固定效果及稳定性试验将上述制备的LRP3菌发酵液按照磷酸根与采用DTPA浸提液提取的有效态重金属的摩尔比为1:2-1:1.5的比例加入到长期使用畜禽粪便及有机肥的设施蔬菜生产基地0-20cm的表层土壤中，以2m*5m为一实验区，混合均匀，每天采集样品测定，确定效果稳定后再采集将矿化前后的土壤样品带回实验室，分别对其进行反复冻融和酸化处理，然后测定DTPA浸提液提取的有效态重金属的浓度，确定对重金属的固定效果及其稳定性。结果表明菌株LRP3对土壤中的有效态重金属Cu、Pb、Zn和Cd的去除率均达到了80％以上，并且固定效果不受到短期反复冻融和酸化的影响。通过上述对本发明菌LRP3的应用实验，证实该菌对重金属具有较高的抗性，可同时产生植酸酶和碱性磷酸酶来快速释放植酸中的磷酸根离子，进而通过生物成矿作用固定重金属离子。用该菌发酵液治理重金属污染的土壤，其操作简单，成本低，无二次污染，形成的矿化产物性质稳定，修复效果持久，不易反弹。该菌在土壤中定植能力强，不仅可通过自然过程实现土壤中重金属的长久矿化，还可应用于秸秆还田土壤，加速秸秆中植酸的降解，释放更多的活性磷，提高土壤肥力，以及通过中和作用降低土壤的酸化程度，从而改良酸性土壤。附图说明图1为本发明菌LRP3在培养基中的产植酸酶特性曲线图；图2为本发明菌LRP3在培养基中的产碱性磷酸酶特性曲线图；图3为本发明菌LRP3在培养基中的磷酸根释放特性曲线图；图4为本发明菌LRP3矿化固定重金属Cu的X-射线衍射图；图5为本发明菌LRP3矿化固定重金属Zn的X-射线衍射图；图6为本发明菌LRP3矿化固定重金属Cd的电镜扫描图；图7为本发明菌LRP3矿化固定重金属Cu的电镜扫描图；图8为本发明菌LRP3矿化固定重金属产物的红外光谱图；图9为本发明菌LRP3菌株的系统发育分析图。具体实施方式通过以下实施例的阐述以便对本发明更进一步理解。实施例1LRP3菌发酵液的制备首先将保存于4℃冰箱中的菌体细胞接种至牛肉膏蛋白胨培养基中培养24h，离心收集菌体细胞，将其悬浮于无菌水中制得107-108个细胞/mL的菌悬液。接着按照2％的接种量将菌悬液加入到上述培养基中在25℃和160rpm下培养12-15h，即得LRP3菌发酵液。每100mL所述的培养基的组成为：植酸钠0.15-0.2g、牛肉膏0.2-0.3g、蛋白胨0.3-0.5g、氯化钠0.3-0.5g，余量为水，pH为7.0-7.2。实施例2使用本发明菌LRP3去除养殖废水中重金属离子的实验。采集长春市某养猪场排放的经固液分离后的养殖废水，取20mL废水加入到40mL实施例1制备的菌LRP3发酵液中，静止放置1h，在8000rpm下离心8-10min，取适量的上清液保存。将采集的原废水在相同条件下离心，保存上清液。同时测定矿化固结前后废水中的重金属离子，计算重金属的去除率，计算公式为(原废水中的重金属离子浓度-矿化后废水中的重金属离子浓度)/原废水中的重金属离子浓度。测试结果，废水中Cu、Zn、Pb、Cd离子的去除率分别为92％、91％、87％和92％。说明菌株LRP3能够通过吸附、生物矿化等过程高效快速去除水相中的重金属离子，与化学处理相比存在无二次污染等优势，在养殖废水处理中具有明显的应用优势。实施例3使用本发明菌LRP3矿化固定土壤中有效态重金属的实验及产物稳定性研究。在吉林省某处长期使用畜禽粪便及有机肥的设施蔬菜种植基地进行本发明菌LRP3对土壤中有效态重金属的矿化固定化研究，试验小区规格为2m×5m，经测定土壤中主要的重金属元素为Cu、Zn、Pb和Cd。将实施例1制备的菌LRP3发酵液以菌剂中磷酸根离子与0-20cm表层土壤中有效态重金属的摩尔比为1:1.5的比例向表层0-20cm的土壤中均匀喷洒发酵液，在矿化后的第3天采集土壤样品测定有效态重金属的量，计算出有效态重金属的降低率，计算公式为有效态重金属含量的降低率＝(原土壤中有效态重金属的含量-矿化后土壤中有效态重金属的含量)/原土壤中有效态重金属的含量。同时分别带回5kg原土和矿化后的土壤样品，取矿化后的土壤和未矿化的原土样10g土放入塑料瓶内，添加少许去离子水湿润，先在4℃冰箱中放入2h，然后放在-20℃冰箱中冷冻2h，取出后再放入4℃冰箱12h，再在-20℃中放置12h，反复冻融5次后测定土壤中有效态重金属的浓度。同时分别取矿化后的土壤和未矿化的原土样10g土放入培养皿中添加去离子水，达到田间持水量的70％，放入20℃的培养箱中培养，每隔1天向培养的土壤中加入pH为4.5的稀盐酸溶液2mL，培养7天后，采集土壤样品测定有效态重金属的含量，结果表明，菌LRP3发酵液对土壤中有效态Cu、Zn、Pb和Cd的去除率分别为85％、83％、80％和87％。对矿化后的土壤无论反复冻融还是酸化作用，土壤中有效态重金属的量基本无明显变化。表明菌株LRP3发酵形成的菌剂进入土壤中后能够通过生物矿化作用快速降低土壤中的有效态重金属的浓度减少有效态重金属的环境危害性，而形成的矿化产物由于性质稳定，对不利环境因素如反复冻融和酸化等具有较高的抗性，可持久地保持稳定效果，同时由于还具有无二次污染、环境友好和可实现污染土壤的边生产边修复，因此在土壤重金属污染修复方面具有较高的应用价值。实施例4使用本发明菌LRP3去除电镀废水中的重金属离子试验在吉林省某电镀工厂收集排出的未经处理的电镀废水，进行本发明菌LRP3对废水中重金属离子的去除研究。试验水样规格为100L，经测定废水中含有Cu、Zn、Pb和Cd的浓度分别为87mg/L、76mg/L、66mg/L和35mg/L。将实施例1制备的菌LRP3的发酵液以磷酸根离子与重金属离子摩尔比为2:1的比例向废水中加入发酵液后搅匀，沉淀0.5-1h后，取一部分废水以8000rpm离心20min后再次测定各重金属离子浓度。计算去除率：(去除前废水中重金属离子的浓度-去除后废水中重金属离子的浓度)/去除前废水中重金属离子的浓度×100％。结果表明，菌LRP3的发酵液对重金属离子Cu、Zn、Pb、Cd的去除率分别为91.3％-96.7％、92.2％97.2％、91.5％-96.2％、93.5％-97.7％。说明菌LRP3的发酵液对电镀废水中的重金属离子有高效的快速去除作用，且去除周期短、无需建造多级设施，降低了工程造价问题，对去除工业电镀废水中的重金属离子有很大的应用价值。当前第1页1 2 3