一种高纯度奥利万星关键中间体A82846B的制备方法与流程

本发明属于工业微生物
技术领域：
，更具体的涉及一种高纯度奥利万星关键中间体a82846b的制备方法。
背景技术：
：糖肽抗生素是由微生物产生，或由微生物产生并进行部分修饰的一大类物质。在上世纪九十年代发现的糖肽中，包括称作a82846a（也称作ereomomycin）、a82846b（也称作氯东方霉素chloroorienticina）、a82846c（也称作东方霉素orienticinc）及东方霉素a。已经对天然存在的糖肽进行了多种修饰，其中一种是对糖肽中的反应性胺的还原烷基化的修饰。奥利万星(oritavancin)，是在第一代糖肽抗生素万古霉素的基础上开发的第二代糖肽抗生素，其作用机制是通过阻断肽聚糖生物合成时转糖苷作用抑制细菌细胞壁的形成。故该类化合物对细菌细胞具有高度的特异性，能迅速杀灭细菌而对人体正常细胞影响较小，因而疗效好，安全性高。2014年8月，fda批准奥利万星用于由敏感革兰氏阳性菌导致的急性细菌性皮肤和皮肤结构感染成人患者的治疗。奥利万星是一种单剂量治疗方案的抗生素，具有良好的市场前景。a82846b，是合成奥利万星的关键中间体，可由东方诺卡菌(nocardiaorientalis)发酵产生。除a82846b外，东方诺卡菌发酵时还会产生两种主要成分a82846a和a82846c，它们的结构式如下：。由式可知，三种物质结构非常接近，分离纯化工作比较困难。目前，关于奥利万星关键中间体a82846b提取分离的文献报道较少。欧洲专利ep0280570a2及美国专利us4845194公开了三种物质的分离方法，其中a82846b的分离方法为：将发酵液通过阳离子（nh4+）交换树脂进行初步富集，然后通过制备性高效液相色谱柱分离，最后经过hp20ss树脂精制。专利中主要进行了此3步纯化，后面的两个步骤的收率仅为29%，总收率更低。cn87106483a也公开了一种a82846的回收方法，包括将其吸附于阳离子交换树脂上，如dowexxf5-43278，dowex-50或大网状树脂ir-120；再用合适的溶剂，如稀nh4oh溶液，将活性物质从树脂上洗脱下来，浓缩后将其吸附在一个大网状树脂上，如diaionhp-20和大网状树脂xad-4上，然后用合适的溶剂洗脱，得到a82846，并公开了，采用同样的方法步骤分离得到个别组分a82846a,a82846b,a82846c。该方法多次从树脂上洗脱分离，操作方法繁琐，有机溶剂用量大，需要处理大量废液。综上所述，现有技术普遍存在如下缺点：1）总收率低，对工业生产效率产生影响；2）需要多步树脂分离等工艺，增加了操作步骤和生产成本，且需要更多的有机溶剂，对操作人员的身体健康构成威胁，且对环境造成污染，不适合工业化大规模生产；3）现有技术中公开的方法均涉及采用采用阳离子交换树脂进行吸附，发明人通过大量多次试验研究发现，阳离子树脂的吸附效率非常低，出现吸附不上去，漏吸附现象，导致收率降低；并且，色素无法除去。因此，本领域急需找到一种高纯度的奥利万星关键中间体a82846b的制备方法，降低生产成本，简化操作步骤，降低环境污染，提高收率，满足工业化生产的需求。技术实现要素：为了达到上述目的，本发明提供了一种高纯度奥利万星关键中间体a82846b的制备方法，包括以下步骤：一种高纯度奥利万星关键中间体a82846b的制备方法，包括以下步骤：1）将发酵液ph为调节至10~11，然后固液分离得到滤液；2）将滤液ph调节至9.0-9.5后导入大孔吸附树脂进行富集；3）将步骤2）的树脂净化，然后用解吸液进行解吸并收集组分，得到a82846b解吸混合液；4）将a82846b解吸混合液进行浓缩后，进行反相填料层析分离，用极性溶剂与盐水的混合液进行解吸；5）将层析分离得到的解吸液浓缩；6）将浓缩液搅拌结晶，过滤并干燥，得到高纯度的奥利万星关键中间体a82846b产品。其中，步骤6）中，先向浓缩液中加入nacl，然后搅拌，低温结晶；优选所述nacl用量为20-30%（m/v），所述的低温为2-8℃；更优选所述nacl用量为24-26%（m/v），所述的低温优选为4-6℃。步骤1）中优选，将发酵液ph调节至10-10.5，步骤2）中将滤液ph调节至9.2~9.5；其中ph调节剂为本领域常规的酸碱调节剂，如氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、氨水等。所述的固液分离方法优选为离心、板框压滤、或减压抽滤。步骤2）中所述的大孔吸附树脂独立的选自弱极性或非极性树脂；优选为lx18、xad1600、hp20、或hz816，其吸附量为5-10g/l，优选6-8g/l。步骤3）中所述的树脂净化是采用ph为7-9的纯化水净化树脂柱，优选用量为2-4bv。步骤3）中所述的解吸液为0.5%-1.5%（v/v）醋酸水溶液，优选解析液为1%醋酸水溶液，其用量为2-5bv。步骤4）中所述的浓缩方式为纳滤，浓缩至浓度为20-50mg/ml。步骤4）中所述的反相填料为采用聚苯乙烯或聚丙烯酸酯及其衍生物制备的聚合物微球、odsc18或fraclite800；所述的解吸液，以解析液总体积计算，盐水为0.5%-1%（w/v）nh4h2po4；极性溶剂为甲醇或乙腈，其浓度为2-10%（v/v），优选甲醇或乙腈浓度为2-5%（v/v），解吸液用量为3-5bv。上述方法中，步骤6）过滤后得到的固体干燥方法优选为真空干燥，温度控制在30-45℃，干燥时间为4~16h。上述方法中，进一步优选，还包括，将得到奥利万星关键中间体a82846b进行脱盐处理，以方便用于制备奥利万星；所述的脱盐方法包括，将上述方法中纯化得到的奥利万星关键中间体a82846b采用甲醇、乙醇或异丙醇溶液进行结晶，脱去a82846b的盐，以用于后续制备奥利万星；其中所述甲醇、乙醇或异丙醇溶液优选浓度不低于75%的甲醇、乙醇或异丙醇溶液，更优选80%，83%，85%，90%，95%或99%的乙醇；或者，在步骤6）之前，将步骤4）层析分离得到的解吸液导入大孔吸附树脂进行脱盐处理，用树脂净化，用10-40%（v/v）的甲醇或乙腈水溶液进行解吸，将得到的脱盐解析液浓缩；其中，所述大孔吸附树脂选自lx18、xad1600、hp20和hz816；所述的树脂净化是采用ph为7-9的纯化水净化树脂柱。相对于现有技术，本发明的主要优点在于：1、本发明提供了一种成本低廉的纯化奥利万星关键中间体a82846b的新方法；2、本发明提供的方法具有纯化条件温和、产品收率高、产品纯度高；工艺步骤简化，溶剂用量大大减少，对环境污染小等特点，在较大程度上简化了工艺操作，并减轻对设备的要求，降低了生产成本；3、本发明提供的方法能够得到较稳定的目标产物，有利于终产品的质量控制，适宜于工业化生产；4、本发明提供的方法提取的目标产物——关键中间体a82846b，完全可以满足向新型糖肽类化合物奥利万星合成的要求，便于进行规模化合成奥利万星；5、本发明提供的技术方案在上大孔吸附树脂前先进行ph调节并采用弱极性或非极性树脂特别是lx18、xad1600、hp20、或hz816替代现有技术中阳离子交换树脂，克服了大孔吸附树脂吸附效率低，漏吸附导致产品收率降低的缺陷；6、采用本发明的技术方案较大程度的除去了产品中的色素，进而使得产品质量得到提高。7、本发明技术方案采用甲醇、乙醇或异丙醇溶液对纯化后的a82846b精粉进行结晶处理，可以显著除去a82846b精粉的盐，从而满足后续奥利万星的制备需求。附图说明图1为实施例1中a82846b发酵液滤液的hplc图谱，其中主成分保留时间为18.561，峰面积为13379391，峰面积%为31.843%；图2为实施例1中a82846b一次解吸混合液的hplc图谱，其中主成分保留时间为17.829，峰面积为35327795，峰面积%为60.021%；图3为实施例1中a82846b二次解吸混合液的hplc图谱，其中主成分保留时间为19.674，峰面积为14678766，峰面积%为94.851%；图4为实施例1中a82846b湿晶体的hplc图谱，其中主成分保留时间为21.639，峰面积为15056710，峰面积%为94.857%；图5为实施例1中a82846b干精粉的hplc图谱，其中主成分保留时间为21.453，峰面积为4382450，峰面积%为94.794%。具体实施例下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不意味着对本发明有任何限制。实施例1奥利万星关键中间体a82846b发酵放罐40l，发酵单位为650ug/ml（26g），将发酵液用naoh溶液调节ph至10.5，搅拌2h后进行管式离心，得到36.8l离心液（hplc的图谱见图1），单位为630ug/ml（23g）。将离心液调节ph至9.3，然后将其导入hp20吸附树脂（规格为ф25*75），装量为3000ml，流速为1bv/h。树脂用ph为8的水净化9l后，再用8l1%醋酸水溶液进行解吸，流速2500ml/h，收集解吸组分，并将浓度较高的组分混合，组成一次解吸混合液（hplc的图谱见图2），然后将解吸混合液进行纳滤浓缩，浓缩至单位为39102ug/ml（21.9g）。将浓缩液导入已平衡好的c18柱（规格为ф25*75），用乙腈:0.5%nh4h2po4=2:98（v/v）进行洗脱，流速1500ml/h，将纯度为90%以上的组分混合，得到体积为8.5l二次解吸混合液（hplc的图谱见图3），单位为1361ug/ml（11.56g）。将二次解吸混合液导入hp20吸附树脂柱（规格为ф25*75），加入9l纯化水进行脱盐处理，用20%乙腈进行解吸，将得到的脱盐液进行浓缩，得到浓缩液150ml，单位为73423ug/ml（10.98g）。向浓缩液中加入35g氯化钠，搅拌至完全溶解，1h后，转入4℃冰箱，过夜结晶后抽滤，得到31.10g湿晶体（hplc的图谱见图4），将湿晶体进行真空干燥后，得到中间体a82846b干粉11.66g（hplc的图谱见图5和其数据见表5），其含量为85%，纯度为94.79%，总收率为35.88%。中间体a82846b的hplc检测方法：反相hplc分析采用的色谱柱为sb-c8柱（4.6mm×150mm×3.5um），柱温为30℃；流动相为a相0.1%的三氟乙酸（tfa）：乙腈=95：5（v/v），b相0.1%的三氟乙酸（tfa）：乙腈=85：15（v/v），采用梯度洗脱，其梯度洗脱见下表所示，流速为1.0ml/min；检测器为vwd或dad，测定波长为240nm；样品用水溶解并制成500ug/ml的溶液，进样量为20ul，运行30min。表1：梯度洗脱条件。实施例2奥利万星关键中间体a82846b发酵放罐33l，发酵单位为340ug/ml（11.22g），将发酵液用naoh溶液调节ph=10.3，搅拌2h后进行板框压滤，得到35l压滤液，单位为310ug/ml（10.85g）。将压滤液调节ph=9.2，然后将其导入lx18吸附树脂。树脂用ph为8的水净化9l后，再用8l0.5%醋酸水溶液进行解吸，并将浓度较高的组分混合，组成一次解吸混合液，然后将解吸混合液进行纳滤，浓缩至单位为35000ug/ml。将浓缩液导入已平衡好的c18柱，用洗脱液（乙腈:0.5%nh4h2po4=3:97（v/v））进行洗脱，收集纯度为90%以上的组分，得到二次解吸混合液。将二次解吸混合液进行减压旋蒸浓缩至80ml，单位为81250ug/ml，纯度为92.80%。向浓缩液中加入20g氯化钠，搅拌溶解1h后，转入4℃冰箱，过夜结晶后抽滤，得到17.40g湿晶体，将湿晶体加入85%乙醇进行搅拌打浆，抽滤得到12.50g打浆湿品，将湿品进行真空干燥后，研磨得到中间体a82846b干粉6.20g，其含量为82%，纯度为93.45%，总收率为45.32%。实施例3奥利万星关键中间体a82846b发酵放罐28.1l，发酵单位为420ug/ml（11.80g），将发酵液用naoh溶液调节ph=10.6，搅拌2h后进行离心，得到25.5l离心液，单位为432ug/ml（11.10g）。将离心液调节ph=9.5，取部分按体积等分为4份（每份5.5l，每份含产品2.35g，纯度为25.69%），分别导入已再生平衡好的4款树脂柱（hp20，lx18，xad1600，hz816），然后用1l纯化水净化树脂柱，用1.5%醋酸水溶液洗脱。收集浓度较高的组分，组成解吸混合液，送检，检测各项纯度结果如表2：表2：各种树脂初纯效果树脂名称树脂载样量上样量解吸混合液含产品量产品纯度收率hp209g/l2.35g2.20g25.0%93.6%lx189g/l2.35g2.09g24.3%88.9%xad16009g/l2.35g2.24g24.2%95.1%hz8169g/l2.35g1.97g30%83.8%实施例4奥利万星关键中间体a82846b发酵放罐40l，发酵单位为496ug/ml（19.84g），将发酵液静置3天后抽滤，得到38l抽滤液。抽滤液调节ph=9.3，将其导入xad1600吸附树脂。树脂用水净化9l后，再用8l1%醋酸水溶液进行解吸，并将浓度较高的组分混合，组成一次解吸混合液，然后将解吸混合液进行纳滤，浓缩至560ml，单位为33673ug/ml（18.85g）。将浓缩液导入已平衡好的c18柱，用乙腈3%进行洗脱，收集纯度为90%以上的组分，得到二次解吸混合液。将二次解吸混合液进行减压旋蒸浓缩至150ml，单位为73250ug/ml，纯度为93.80%。将浓缩液均分成4份（每份37.5ml，每份含产品2.75g）放入4只烧杯中，烧杯编号1-4，一边搅拌一边向各烧杯中分别加入15%，20%，25%，30%的氯化钠，搅拌溶解2h后转入4℃冰箱中过夜结晶。抽滤，得到湿晶体a，检测各项纯度如表3：表3：不同浓度的氯化钠对浓缩液的结晶效果序号氯化钠浓度湿晶体a纯度结晶母液浓度结晶收率115%95.03%37650ug/ml48.60%220%94.59%16201ug/ml77.88%325%94.48%11290ug/ml84.58%430%94.23%10215ug/ml86.05%实施例5将奥利万星关键中间体a82846b发酵放罐38l，发酵单位为467ug/ml（17.75g），按照实施例1的方法进行操作，得到湿晶体a重量为21g，其含量为29.5%（8.23g）。将湿晶体置于40℃烘箱中2h后得烘干品b，重量为18.2g，纯度为94.72%，含量为45%。将烘干品b按重量等分为3份（每份约6g），标记1-3号，向其中加入50ml不同浓度的乙醇，乙醇浓度分别为95%，90%，85%。搅拌处理1h后，抽滤，得到的固体于40℃烘箱中放置2h后得烘干品c，送检，检测各项纯度如表4：表4：不同浓度的乙醇对晶体的含量提高效果序号乙醇浓度烘干品c纯度烘干品c含量母液浓度收率195%95.03%78%820ug/ml98.48%290%94.59%83%1351ug/ml97.49%385%94.48%89%1817ug/ml96.60%从上上述实施例1和实施例5中，可看出，在纯化步骤该实施例显示，通过采用乙醇对晶型进行纯化，可以除去产品中的大部分盐的，即，显著提高了奥利万星关键中间体a82846b的含量。对比实施例1：采用现有技术方法进行纯化a82846b（使用阳离子树脂）奥利万星关键中间体a82846b发酵放罐32l，发酵单位为453ug/ml（14.49g），将发酵液用naoh溶液调节ph=10.5，搅拌2h后进行离心，得到28.5l离心液，单位为442ug/ml（12.59g）。将离心液调节ph=6.5，取部分按体积等分为3份（每份6l，每份含产品2.65g，纯度为27.39%），分别导入已处理平衡好的3款阳离子交换树脂柱（732、d113、d001），然后用1l纯化水净化树脂柱，用ph为10-11的碱水溶液洗脱。收集上柱废液、净化废液和洗脱液送检，结果如表5：表5：阳离子交换树脂初纯效果漏吸率：是指上柱废液及净化废液中含产品量占上样量的百分比值。当前第1页12