本发明属于生物除臭技术领域，具体涉及一种复合微生物除臭剂及其制备方法。
背景技术：
恶臭是指一切刺激嗅觉器官引起人们不愉快及损害生活环境的气体物质，它是大气污染的一种形式。恶臭已成为当今世界七种典型公害中的一种并且已引起世界各国和人们的广泛关注。恶臭气体的种类主要有H2S、SO2、硫醇、氨、胺类、卤代烃等。恶臭气体主要来源有生活源与工业源。生活源是指日常生活中产生的恶臭，如家用卫生间、公厕、污水处理厂、垃圾转运站等；工业源是指工业生产中产生的恶臭，如造纸厂、化工厂、制药厂、农药厂、养殖厂、屠宰场、畜牧场污水处理厂等。不同的恶臭气体对周边环境造成极大的危害，严重影响了周边居民的身体健康因此，迫切需要加强对恶臭气体的治理。
目前除臭研究工作主要集中在物理除臭、化学除臭和生物除臭三方面，生物除臭以除臭效率高、无二次污染、操作简单、成本低廉，成为目前治理恶臭环境的一个重要研究方向。
申请号为201310442504.4的发明专利公开了一种生产除臭微生物制剂的方法，该方法通过将嗜热链球菌、恶臭假单胞菌、沼泽红假单胞菌、短小芽抱杆菌和屎肠球菌进行发酵，然后冷冻干燥，按比例混合后制成除臭剂，可消除不同环境中的恶臭气体。但是由于该生物除臭剂需要将五种不同微生物单独分别发酵后再混合制备而成，因此生产过程复杂，增加了生物除臭剂的生产成本。申请号为01129774.3的发明专利公开了一种微生物除臭剂及其制备方法与应用，该生物除臭剂仅由酵母菌属中的产朊酵母和小椭圆酵母两种酵母混合发酵制备而成，因此限制了该生物除臭剂的应用范围。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术中存在的缺陷和不足，利用从江西抚州市生活垃圾填埋场的土壤中分离选育而得到的一株解淀粉芽孢杆菌，提供一种除臭效果好、应用范围广、生产成本低的复合微生物除臭剂及其制备方法。
本发明采用如下技术方案，来实现发明目的。
一种复合微生物除臭剂，为微生物发酵液，所述的微生物由解淀粉芽孢杆菌、胶红酵母、粪肠球菌和巴氏醋杆菌组合而成的混合菌；混合菌的活菌总数不少于3.0×1010cfu/mL。
所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，从江西抚州市生活垃圾填埋场的土壤中分离选育而得，菌株号为SQ-001，菌株SQ-001已于2016年8月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号楼，邮编100101，菌株保藏编号为CGMCC No.12917。
所述的胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)，来源并购买于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，胶红酵母菌的菌株保藏编号为CGMCC No.2.4008。
所述粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，来源并购买于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，粪肠球菌的菌株保藏编号为CGMCC No.1.2024。
所述巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)，来源并购买于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，巴氏醋杆菌的菌株保藏编号为CGMCC No.1.2830。
本发明还同时提供了一种复合微生物除臭剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)种子的扩大培养：将解淀粉芽孢杆菌，胶红酵母，粪肠球菌，巴氏醋杆菌分别接种于含碳源和氮源的种子培养基中，经搅拌培养得到适用于发酵接种的种子液，分别为巴氏醋杆菌种子液、解淀粉芽孢杆菌种子液、胶红酵母种子液和粪肠球菌种子液；
(2)混菌液体的发酵培养：将步骤(1)中获得的巴氏醋杆菌种子液，接种于含碳源、氮源、无机盐的发酵培养基中，经搅拌培养后，再分别接入步骤(1)中获得的解淀粉芽孢杆菌种子液、胶红酵母种子液和粪肠球菌种子液，继续发酵培养，得到混菌发酵液；
(3)复合微生物除臭剂的获得：调整步骤(2)得到的混菌发酵液的pH值至2.5～3.5并抽真空，得到含有休眠活菌的液体复合微生物除臭剂。
步骤(1)所述的含碳源和氮源的种子培养基，其碳源选自葡萄糖、麦芽糖、甘油、可溶性淀粉的一种或几种，碳源含量为1～5g/100mL；其氮源选自酵母膏、蛋白胨、玉米浆、大豆粉、硫酸铵的一种或几种，氮源含量为0.5-～5g/100mL，种子培养基的pH优选范围为pH5.5～7.0。
步骤(2)所述的含碳源、氮源、无机盐的发酵培养基，其碳源选自葡萄糖、麦芽糖、甘油、可溶性淀粉、糖蜜的一种或几种，碳源含量为2～5g/100mL；其氮源选自酵母膏、蛋白胨、玉米浆、大豆粉、玉米粉、蚕蛹粉的一种或几种，氮源含量为1～6g/100mL；其无机盐包含镁盐、磷酸盐，无机盐含量为0.001～0.2g/100mL；镁盐选自硫酸镁或氯化镁；磷酸盐选自磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠中的一种或几种。
优选地，发酵培养基配方为：葡萄糖2.5～3.5g/100mL、酵母膏0.2～0.5g/100mL、玉米浆2.5～5.0g/100mL、磷酸二氢钾0.02～0.08g/100mL、硫酸镁0.01～0.05g/100mL，余量为水，pH为5.5～7.0。
步骤(1)和(2)所述的搅拌培养，其参数优选为：搅拌转速120-200rpm、培养温度28-37℃，培养时间12-36h。
步骤(3)所述的抽真空为：在0.05～0.088MPa真空度下，将发酵液保持15～20min，以去除发酵液中的空气和部分水份。
步骤(3)所述的液体复合微生物除臭剂，其混合菌活菌总数不少于3.0×1010cfu/mL。
本发明中解淀粉芽孢杆菌菌株SQ-001经中国科学院微生物研究所检测鉴定，其16S rRNA基因序列和atpA基因序列如下：
16S rRNA基因序列:
TCAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTAGGAGCCAGCCGCA
atpA基因序列:
GGCGACGCTTCAGTTCACGGTATGAAGCCAGGTCAAGACGCAATGTTCCAGCTACCTTTTTCATCGCTTTGATTTGGGCTGATCCGCCGACACGGGATACGGATAATCCGGCATTGATCGCAGGACGCACGCCTGAGAAGAATAGGTCGGATTGAAGGAAAATCTGTCCGTCAGTAATGGAAATGACGTTTGTCGGGATATAAGCGGAGATATCTCCTGCTTGTGTTTCGACGAACGGCAGCGCCGTAATTGATCCTGCGCCTTTTGCGTCACTCAGCTTGGCTGCGCGCTCAAGCAGACGGGAGTGAAGATAGAATACATCCCCAGGGAATGCTTCACGGCCCGGCGGACGGCGAAGAAGCAATGACAGCTCACGGTAAGCGGCCGCTTGTTTGGATAAATCATCATATACGACGAGAACGTGCTTGCCGTTGTACATGAATTCTTCACCCATTGTCACCCCTGCATACGGTGCAAGGTAAAGAAGCGGAGCCGGCTGTGAAGCGGACGCCGTCACGACAATCGTGTAATCAAGCGCGCCATGCTTACGAAGTGTTTCCACCACGCCGCGCACTGTAGATTCTTTTTGACCGATCGCTACGTACACACAGATCATGTCTTGATCTTTTTGGTTTAAGATTGTATCAATCGCAACAGATGTTTTACCTGTCTGACGGTCACCGATAATCAGCTCACGCTGTCCGCGGCCGATCGGAATTAACGCGTCAATCGCTTTGATACCCGTTTGCAGCGGCTCATGTACCGATTTACGGTCCATTACGCCTGGAGCCTGGCTTTCGATCGGACGTGTTTTGCTTGTCAGAATCGGACCCAGTCCGTCTACCGGCTGTCCTAACGGGTTGACGATACGTCCGATTAATTCTTCACCTACAGGAACTTCCATGATGCGGCCCGTTCTTTTGACCTCATCACCTTCACGGATATCTCTGTAAGGTCCTAAGATAACGATACCTACGTTGGATTCTTCAAGGTTTTGAGCCATACC。
有益效果：
本发明所得到的液体复合微生物除臭剂，可以有效分解产生臭味的生物有机质，协同吸收利用各种恶臭气体，除臭效果好，应用范围广。这是因为本发明将解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.12917，胶红酵母CGMCC No.2.4008，粪肠球菌CGMCC No.1.2024，巴氏醋杆菌CGMCC No.1.2830分别接种于种子培养基进行扩大培养，然后再接种于发酵培养基进行发酵培养，通过混菌发酵技术得到具有除臭功能的微生物组合物，并且该复合微生物菌种活菌总数不少于3.0×1010cfu/m数量级，使发酵液同时可以分解蛋白质、脂肪和淀粉这些产生臭味的生物有机质中的主要成分。同时，由于解淀粉芽孢杆菌、胶红酵母、粪肠球菌和醋酸菌之间的协同作用，能够将H2S、SO2、硫醇、氨、胺类等恶臭气体作为营养物质利用或者通过吸附作用将不同恶臭气体给吸附。
本发明所得到的液体复合微生物除臭剂，货架期长，保藏方便。在本发明中，我们通过抽真空的方法使发酵液中的微生物菌株处于休眠，大幅增加了微生物除臭剂的货架期，便于保藏。
本发明生产工艺简单，活菌总量高，生产成本低，有利于大规模推广应用。本发明由于采用了混菌发酵工艺，使得在液态发酵体系中由于不同菌株间的协同生长作用，大幅度提高了发酵液中总菌数量；另一方面，因为采用了混菌发酵工艺，一次发酵就可以得到不同微生物组合物，缩短了生产周期、提高生产设备的利用率，降低了生产成本，有利于大规模推广应用。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
解淀粉芽孢杆菌的菌株来源、菌株分离、基因序列测定：
菌株来源：从江西抚州市生活垃圾填埋场的土壤中分离选育而得，菌株号为SQ-001，经中国微生物菌种保藏中心鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amgloliquefaciens)，并于2016年8月30日保藏于北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，该株解淀粉芽孢杆菌的菌株保藏编号为CGMCC No.12917。菌株SQ-001所述的菌株SQ-001，菌体呈杆状，革兰氏染色阳性，形成芽孢，不膨大；常规生理生化实验表明，是好氧菌，接触酶，氧化酶，VP试验呈阳性，在7％的NaCl中生长，PH5.7生长，水解淀粉，还原硝酸盐成亚硝酸盐。
所述的菌株SQ-001是通过下列具体分离步骤而获得的：
A标本采集：从江西抚州市生活垃圾填埋场的土壤中，采集土壤标本，保存备用；
B菌株分离：称取采集的土壤标本约10g放在已灭菌的研钵内，在无菌操作台上研磨至土壤颗粒较均一为止；称取1g研磨好的土样置于无菌试管中，加入9mL无菌水充分震荡30分钟制成1：10的土壤稀释液，从上述溶液中取出1mL加入9mL无菌水充分震荡成10-2的土壤稀释液，依此类推至10-3、10-4、10-5的土壤稀释液后备用，采用涂抹法或混菌法进行平板接种；所述的涂抹法为：分别吸取上述5个浓度的土壤稀释液0.05mL，分别加入已制好的含有NA培养基的无菌平板上，用灭菌和玻璃刮刀将稀释液均匀涂布开，设三个重复；所述的混菌法为：分别吸取上述5个浓度的土壤稀释液各1mL，分别加入无菌空白培养皿中，将已熔化的45-50℃的NA培养基倒入，轻轻摇转使样品和培养基混合均匀，待培养基凝固，设三个重复。
C纯化培养：将上述分离平皿，放入30℃培养箱中恒温培养3-7天至单菌落长出，将具有解淀粉芽孢杆菌菌落形态特征进行标记并及时挑取单菌落至NA培养基平板上，采用划线分离的方法进行纯化并入30℃培养箱中恒温培养，将纯化培养后的单菌落再转接至含有NA培养基的斜面管内，继续于30℃培养箱中恒温培养3-7天，得到单菌落斜面管；
D液体培养：从单菌落斜面管内逐一挑取解淀粉芽孢杆菌，接种于液体培养基中，在旋转式摇床150rpm转速下，32℃培养24h，活菌孢子数达到6×108左右，得到适于保存的种子；
E菌株保存：将上述经液体培养后的解淀粉芽孢杆菌种子加入经过高温灭菌的甘油，使甘油在种子液中的浓度为35％(V/V)，制成解淀粉芽孢杆菌甘油冻存管，放在-80℃冰箱保存，或放在-196℃液氮罐中进行超低温保存。
基因序列测定：将解淀粉芽孢杆菌甘油冻存管送外进行基因序列测定，经中国科学院微生物研究所检测鉴定，其16S rRNA基因序列和atpA基因序列，具体见SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
实施例2
复合微生物除臭剂的制备
(1)种子制备
种子培养基：葡萄糖2.5g/100mL，酵母膏0.5g/100mL，玉米浆2.5g/100mL，水，调pH为6.5。将解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.12917、胶红酵母CGMCC No.2.4008、粪肠球菌CGMCC No.1.2024和巴氏醋杆菌CGMCC No.1.2830菌接种于上述种子培养基中，在旋转式摇床150rpm转速下，32℃培养24h，即得适于接种的种子。
(2)混菌液体发酵培养
发酵培养基：葡萄糖2.5g/100mL，酵母膏0.3g/100mL，玉米浆,4g/100mL，磷酸二氢钾0.03g/100mL，硫酸镁0.03g/100mL。将(1)中获得的醋酸菌种子按照发酵液体积的6％接种于发酵培养基中，在旋转式摇床150rpm转速下，32℃培养12h后，再分别按照发酵液体积2％接入(1)中获得的解淀粉芽孢杆菌、胶红酵母和粪肠球菌种子，继续发酵培养30h即可获得混合微生物组合物。
(3)发酵结束后调整发酵液的pH值至3.0，然后将发酵液在0.06MPa真空度下保持
15min以去除发酵液中的空气，得到含有处于休眠状态活菌的微生物除臭剂。
实施例3
复合微生物除臭剂的制备
(1)种子制备
种子培养基：葡萄糖5g/100mL，酵母膏1g/100mL，玉米浆3g/100mL，水，调pH为6.0。将解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.12917、胶红酵母CGMCC No.2.4008、粪肠球菌CGMCC No.1.2024和巴氏醋杆菌CGMCC No.1.2830菌接种于上述种子培养基中，在旋转式摇床180rpm转速下，30℃培养24h，即得适于接种的种子。
(2)混菌液体发酵培养
发酵培养基：葡萄糖3g/100mL，酵母膏0.5g/100mL，黄豆粉4g/100mL，磷酸二氢钾0.05g/100mL，硫酸镁0.04g/100mL。将(1)中获得的巴氏醋杆菌种子按照发酵液体积的5％接种于发酵培养基中，在旋转式摇床170rpm转速下，30℃培养24h后，再分别按照发酵液体积6％接入(1)中获得的解淀粉芽孢杆菌、胶红酵母和粪肠球菌种子，继续发酵培养30h即可获得混合微生物组合物。
(3)发酵结束后调整发酵液的pH值至3.5，然后将发酵液在0.07MPa真空度下保持20min以去除发酵液中的空气，得到含有处于休眠状态活菌的微生物除臭剂。
实施例4
复合微生物除臭剂的应用
在1L烧杯中加入200g新鲜牛粪，加入10mL本发明的复合微生物除臭剂，和粪便混匀后，用保鲜膜密封烧杯，同时以不加菌剂做对照，每组实验设置三个重复，5天后测定氨气、硫化氢和、吲哚等恶臭强度浓度。测定结果表明，加入复合微生物除臭剂组的恶臭去除率达到95％以上，而对照组对恶臭的去除率仅为10％左右。说明本发明的微生物制剂对牛粪具有很好的除臭效果，能有效的改善空气质量。
实施例5
复合微生物除臭剂的应用
取100g新鲜垃圾平摊于5个培养皿中后，加入20mL本发明的复合微生物除臭剂，放于塑料袋中，充气50L后扎紧密封。分别设置投复合微生物除臭剂和自来水作为对照。每个处理设3个重复。7天后测定氨气、硫化氢和、吲哚等恶臭强度浓度。测定结果表明，加入复合微生物除臭剂组的恶臭去除率达到90％以上，而对照组对恶臭的去除率仅为15％左右。说明本发明的微生物制剂对垃圾具有很好的除臭效果，能有效地改善空气质量。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都涵盖在本发明范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 江西顺泉生物科技有限公司
<120> 一种复合微生物除臭剂及其制备方法
<130> 12
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1416
<212> DNA
<213> 16S rRNA基因序列
<400> 1
tcagtcgagc ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac 60
acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat aactccggga aaccggggct aataccggat 120
ggttgtttga accgcatggt tcaaacataa aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg 180
acccgcggcg cattagctag ttggtgaggt aacggctcac caaggcgacg atgcgtagcc 240
gacctgagag ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg 300
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tgaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga acaagtgccg ttcaaatagg 420
gcggcacctt gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg 480
taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt 540
tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag ggtcattgga aactggggaa 600
cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg 660
gaggaacacc agtggcgaag gcgactctct ggtctgtaac tgacgctgag gagcgaaagc 720
gtggggagcg aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag 780
tgttaggggg tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga 840
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cgaagtcggt gaggtaacct ttaggagcca gccgca 1416
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<211> 1006
<212> DNA
<213> atpA基因序列
<400> 2
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caggacgcac gcctgagaag aataggtcgg attgaaggaa aatctgtccg tcagtaatgg 180
aaatgacgtt tgtcgggata taagcggaga tatctcctgc ttgtgtttcg acgaacggca 240
gcgccgtaat tgatcctgcg ccttttgcgt cactcagctt ggctgcgcgc tcaagcagac 300
gggagtgaag atagaataca tccccaggga atgcttcacg gcccggcgga cggcgaagaa 360
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