检测细胞RAI2基因启动子区DNA甲基化状态的引物对及试剂盒的制作方法

本发明涉及一种用于检测细胞rai2基因启动子区甲基化状态的引物对及试剂盒。

背景技术：

结直肠癌是世界第三大常见肿瘤，是肿瘤所致死亡的第四大主因(haggarf.a.,bousheyr.p.colorectalcancerepidemiology:incidence,mortality,survival,andriskfactors.clinicsincolonandrectalsurgery.2009；22(4):191–197)。结直肠癌也是中国常见的恶性肿瘤之一，近年来其发病率明显上升，由恶性肿瘤的第4位上升为第3位。其中以结肠癌增加为著，并且右侧结肠癌亦呈明显增长趋势。右侧结肠癌由于该部位解剖特点及肿瘤的生物学特性，确诊时患者病期多为晚期。

结直肠癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤，目前由于尚缺乏早期诊断和治疗的有效方法，病人预后常不良。因此针对结直肠癌的诊断和治疗手段，尤其是对肿瘤的早期诊断、残留病灶及复发的检测方法仍然十分有限，是目前迫切需要解决的问题。

随着后基因组时代的到来，表观遗传学(epigenetics)已成为生命学科的研究前沿。表观遗传学是指dna序列不发生改变的可遗传的基因表达变化的学科，它可以解释一些经典遗传学所不能解释的问题，例如：单卵双生的姊妹具有完全相同的基因型，在不同的环境下长大后其性格特征及对疾病的易感性不同。在消化系统肿瘤中，表观遗传学研究主要集中在dna甲基化上。基因启动子区cpg岛高甲基化可导致抑癌基因表达沉默进而导致肿瘤发生。dna甲基化是指在甲基化转移酶的作用下,以s-腺苷甲硫氨酸为甲基供体,将甲基转移到cg二核苷酸胞嘧啶的5号碳原子上，形成5甲基胞嘧啶。dna甲基化异常是细胞癌变过程中早期频发事件，因此特异基因的甲基化可作为癌症早期诊断的分子标志物、治疗靶点或判断预后手段。目前有许多检测甲基化的方法，如：一、亚硫酸氢钠法(sodiumbisulfite)，包括亚硫酸氢钠法依赖的基因测序法、亚硫酸氢钠联合限制性内切酶分析法(cobra)、甲基化特异性pcr(methylationspecificpcr，msp)、甲基化敏感的单核苷酸扩增法(ms-snue)等；二、甲基化敏感的限制性内切酶法，包括southern法、甲基化敏感的限制性图谱(msrf)、限制性标记基因组扫描技术(rlgs)、差异性甲基化杂交分析(dmh)、甲基化cpg岛扩增子分析(mca)等。但多数方法缺乏稳定性和可靠性。值得一提的是ms-pcr，自1996年herman发明了此项技术后，大大简化了dna甲基化的检测方法，使得表观遗传学研究更加迅速的向前发展，其突出的优点在于高特异性、高灵敏度、操作简便、费用及耗时均较少、不受限制性内切酶的限制。目前ms-pcr已成为常规方法及金标准，尤其在临床标本检测方面已作为首选。ms-pcr的基本原理是：dna经过亚硫酸盐硫化修饰后，cpg岛上没有发生甲基化的cg二核苷酸中的胞嘧啶就转化为尿嘧啶，因胸腺嘧啶和尿嘧啶互补，可用胸腺嘧啶替代尿嘧啶设计引物。针对基因启动子区特定位点分别设计甲基化引物及非甲基化引物，进行pcr扩增后，凝胶电泳显示结果，即可分辨出甲基化、非甲基化或部分甲基化。

rai2基因最初是在胚胎源性肿瘤中被发现受维甲酸(retinoicacid)诱导表达的7个基因之一(jonklj,dejongeme,vervaartjm,wissinks,kruijerw.isolationanddevelopmentalexpressionofretinoic-acid-inducedgenes.devbiol.1994；161(2):604–614.)。walpolesm等人证实rai2定位于x染色体短臂2区2带，即xp22。并发现rai2可表达长约2.5kb的rna转录本，而其rna水平的表达可在4种胚胎组织(包括脑、肺、肾和心脏)和8种成体组织(包括心脏、脑、胎盘、肺、骨骼肌、肾脏、胰腺和视网膜)中检测到(walpolesm,hiriyanakt,nicolaoua,binghamel,durhamj,vaudinm,rossmt,yatesjr,sievingpa,trumpd.identificationandcharacterizationofthehumanhomologue(rai2)ofamouseretinoicacid-inducedgeneinxp22.genomics.1999feb1；55(3):275-283)。有文献报道rai2的缺失或可导致楔形牙综合征，但尚存争议(walpolesm,roncen,graysonc,dessayb,yatesjr,trumpd,toutaina.exclusionofrai2asthecausativegenefornance-horansyndrome.humgenet.1999may；104(5):410-411.；liaohm,niudm,chenyj,fangjs,chensj,chench.identificationofamicrodeletionatxp22.13inataiwanesefamilypresentingwithnance-horansyndrome.jhumgenet.2011jan；56(1):8-11.)。而rai2与肿瘤及其他疾病的关系鲜有报道。最近一项研究发现rai2在er(estrogenreceptor，雌激素受体)阳性的乳腺癌细胞中高表达，而在高侵袭性间叶细胞样细胞系中低表达，并进一步证实rai2可通过抑制akt信号通路抑制乳腺癌的侵袭和转移，rai2可通过2个高度保守的结构域(称为aldls结构域)与ctbp(c-terminalbindingprotein-2)蛋白直接作用，调控下游基因如grhl2、foxoa1和gata3等的表达，从而参与调控细胞分化、侵袭迁移等行为。而rai2低表达的乳腺癌和结直肠癌患者预后较差(werners,brorsb,eickj,marquese,pogenbergv,parreta,kemmingd,woodaw,edgrenh,neubauerh,streichertt,riethdorfs,bediu,baccellii,jückerm,eilsr,fehmt,trumppa,johnsensa,j,wilmannsm,müllerv,pantelk,wikmanh.suppressionofearlyhematogenousdisseminationofhumanbreastcancercellstobonemarrowbyretinoicacid-induced2.cancerdiscov.2015may；5(5):506-519.)。

本发明首次通过msp的方法在结直肠癌中成功验证了细胞rai2启动子区的高甲基化。预实验结果提示rai2基因可能是结肠癌中的新的抑癌基因，此外rai2基因的启动子区高甲基化状态可能是一个新的肿瘤分子标记物。本发明人应用msp方法对大量结肠癌肿瘤组织标本以及正常的结肠组织标本进行检测，以明确rai2基因启动子区甲基化状态。

技术实现要素：

本发明的目的是提供检测细胞rai2基因启动子区甲基化状态的引物，即用于检测rai2基因启动子区甲基化和非甲基化状态的一对特异性引物对，其包括甲基化引物和非甲基化引物，同时，本发明还提供一种含有上述甲基化引物或非甲基化引物的试剂盒。

本发明提供一种用于检测细胞rai2基因启动子区甲基化状态的引物对，包括甲基化引物和非甲基化引物，其中，所述甲基化引物的上游引物核苷酸序列为：5'-gggcgtcgtacgtagatatatattc-3'，下游引物核苷酸序列为：5'-ctaaaactctccgatctaacctcg-3'；所述非甲基化引物的上游引物核苷酸序列为：5'-ggtgttgtatgtagatatatatttgt-3'，下游引物核苷酸序列为：5'-taaaactctccaatctaacctcacc-3'。

本发明还提供一种用于检测消化系统肿瘤细胞的试剂盒，其中，该试剂盒含有上述甲基化引物或非甲基化引物。

本发明具有如下优点：利用本发明所述引物及试剂盒检测结直肠组织细胞，在结直肠癌组织细胞中rai2基因启动子区呈高甲基化状态，甲基化率为48.98％，而在正常结直肠组织细胞中，rai2基因启动子区呈非甲基化状态，表明该基因启动子区的甲基化状态对于结直肠癌细胞具有特异性；同时应用本发明所述引物及试剂盒、反应体系及反应条件可使检测结直肠癌细胞的灵敏度达到0.1％，即1000个细胞中有1个甲基化的细胞就能够被检测出，这说明rai2基因启动子区甲基化状态可作为结直肠癌的一个新的分子标志。本试剂盒首次选用rai2基因作为目标基因，该基因是本发明人应用msp技术率先在结直肠癌中筛选出的启动子区呈高甲基化状态的基因，具有首创性。因此，应用本发明引物及试剂盒来检测rai2基因启动子区高甲基化状态可作为结直肠癌诊断、疗效观察、预后判断、残留病灶及复发检测等的有力手段，而且，操作简便、稳定性好，具有深远的临床意义和推广性。

附图说明

图1以硫化修饰后的人外周血淋巴细胞dna(非甲基化对照)，硫化修饰后的结肠癌细胞系rko细胞dna(甲基化对照)和去离子水(阴性系统对照)建立对照体系。分别用甲基化引物及非甲基化引物对结直肠癌组织标本进行msp检测，同时检测正常结直肠组织dna。扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果如图所示。

crc1-crc8分别代表结直肠癌组织样本，nc1、nc2、nc3、nc4和nc5为正常结直肠组织样本5例；rko为甲基化(m)的结直肠癌细胞系，此处作为甲基化对照；nl为非甲基化(u)阳性的正常人外周淋巴细胞样本，此处作为非甲基化对照；ddh2o(去离子水)为双阴性的体系对照，用以评估体系是否存在pcr产物的污染，如ddh2o检测的结果为双阴性(m和u均为阴性)，则体系结果可信。u代表非甲基化结果；m代表甲基化结果；marker为dl2000marker(分子量标准)，上下两条带分别代表200bp和100bp；本体系扩增产物大小，u带为166bp，m带为168bp。

图2将结肠癌细胞系rko的dna(rai2基因启动子区100％甲基化)与正常人外周血淋巴细胞的dna(rai2基因启动子区100％非甲基化)按比例混合，进行硫化修饰，此后用甲基化引物进行扩增，扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果(分别扩增，混合点样)如图所示。

具体实施方式

经过反复的试验与推敲，本发明人选出一对特异性很好的甲基化引物对及非甲基化引物对，应用敏感度较高的琼脂糖凝胶电泳技术作为结果的检出手段，得出可靠的实验结果，实验结果表明：rai2基因启动子区的高甲基化状态在人类消化系统肿瘤中具有较高的特异性。利用所述引物对及试剂盒检测细胞rai2基因甲基化状态的灵敏度高，解决了上述现有技术中其他方法的检出率低、结果难以分析、仅能显示大体的基因学异常等一系列技术问题，因此，本发明所述的引物及试剂盒可用于消化系统肿瘤的早期诊断、疗效判定等。

本发明提供的用于检测细胞rai2基因启动子区甲基化状态的引物对，包括甲基化引物和非甲基化引物，其中，所述甲基化引物的上游引物核苷酸序列如seqidno.1所述，即：5'-gggcgtcgtacgtagatatatattc-3'，下游引物核苷酸序列如seqidno.2所述，即：5'-ctaaaactctccgatctaacctcg-3'；所述非甲基化引物的上游引物核苷酸序列如seqidno.3所述，即：5'-ggtgttgtatgtagatatatatttgt-3'，下游引物核苷酸序列如seqidno.4所述，即：5'-taaaactctccaatctaacctcacc-3'。

利用上述甲基化引物，以硫化修饰后的dna为模板进行msp扩增，如果rai2基因启动子区存在甲基化，则会得到168bp大小的片段；如果rai2基因未发生甲基化，则不产生扩增产物。基于此，本申请将该引物称为甲基化引物。所述甲基化引物，其上游引物的tm72.00，gc含量59.29％，下游引物的tm66.67，gc含量59.82％。

利用该非甲基化引物，以硫化修饰后的dna为模板进行msp扩增，如果rai2基因未发生甲基化，则会得到166bp大小的片段。基于此，本申请将该引物称为非甲基化引物。所述非甲基化引物，其上游引物的tm73.08，gc含量50.87％，下游引物的tm68.00，gc含量59.15％。

本发明提供的用于检测消化系统肿瘤细胞的试剂盒含有上述甲基化引物或非甲基化引物。

进一步，本发明的试剂盒还含有甲基化对照msp模板，该模板为硫化修饰后的细胞rai2基因启动子区为100％甲基化的肿瘤细胞dna。在此，对该肿瘤细胞没有特别的限制，只要满足“硫化修饰后的细胞rai2基因启动子区100％甲基化”即可。

进一步，本发明的试剂盒还含有非甲基化对照msp模板，该模板为硫化修饰后的细胞rai2基因启动子区为100％非甲基化的正常细胞dna。在此，对该正常细胞没有特别的限制，只要满足“硫化修饰后的细胞rai2基因启动子区100％非甲基化”即可，例如可以为正常外周血淋巴细胞、正常组织细胞等。

进一步，本发明的试剂盒还含有作为阴性系统对照的去离子水。

进一步，本发明的试剂盒还含有msp反应所需的下列成分：50mmmgcl2，10×mspbuffer，10mmdntpmixture，hotstarttaq酶。

为更详细地了解本发明，以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。

实施例一

1、模板的制备(基因组dna的提取及硫化修饰过程)

dna的制备：获取结直肠癌样本及正常结直肠组织样本。在本实施例中各取结直肠癌8例(crc1-crc8)和5个正常结直肠组织样本(nc1-nc5)，应用酚-氯仿抽提的方法分别提取基因组dna，紫外分光光度仪测定吸光度(a)值确定其含量及纯度。

亚硫酸盐修饰：参考herman(j.g.herman,j.r.graff,s.myohanen,b.d.nelkinands.b.baylin,methylation-specificpcr:anovelpcrassayformethylationstatusofcpgislands,proc.natl.acad.sci.usa93(1996),9821–9826.)等报道的方法。取上述制备的基因组dna，经稀释后精确取2ugdna，加去离子水至终体积50ul，加入新鲜配制的2m的naoh5.5ul，37℃孵育15min。之后加入新鲜配制的10mm的氢醌30ul及3m亚硫酸氢钠520ul混合均匀(其内已加入新鲜配制的2m的naoh，计算方法：10ml3m亚硫酸氢钠中加入2m的naoh740ul)，50℃孵育16h，此后应用dna纯化试剂盒(promega公司产品)纯化并回收dna，应用50ul去离子水洗脱dna，向其内加入5.5ul3m的naoh使硫化后的dna处于不含二级结构的单链状态，加入1ul糖原和17ul7.5m乙酸铵，用3倍体积的无水乙醇沉淀dna，最终硫化修饰后的dna重新溶解在20ul去离子水中，得到dna模板，立即使用或-20℃保存。

2、msp扩增

以甲基化引物进行扩增的msp反应体系，以总体积25ul计，包括：

模板(硫化修饰后的dna)：2ul；

甲基化引物(50pmol/ul)：

上游引物(5'-gggcgtcgtacgtagatatatattc-3')：0.5ul，

下游引物(5'-ctaaaactctccgatctaacctcg-3')：0.5ul；

50mmmgcl2(invitrogen公司)：0.75ul；

10×mspbuffer(缓冲液，invitrogen公司)2.5ul；

10mmdntpmixture(invitrogen公司)：1.25ul；

hotstarttaq酶(invitrogen公司，浓度为5u/μl)：0.1ul；

去离子水：17.4ul

以非甲基化引物进行扩增的msp反应体系与以甲基化引物进行扩增的msp反应体系的不同之处仅在于：引物不同。具体地，以非甲基化引物进行扩增的msp反应体系，以总体积25ul计，包括：

非甲基化引物(10pmol/ul)：

上游引物(5'-ggtgttgtatgtagatatatatttgt-3')：0.5ul，

下游引物(5'-taaaactctccaatctaacctcacc-3')：0.5ul；

其余组分及其用量均与以甲基化引物进行扩增的msp反应体系中的相同。

以上仅分别列举了以甲基化引物和非甲基化引物进行扩增的msp反应体系中各组分的用量的一个例子，使用不同公司生产的mgcl2、mspbuffer缓冲液、dntpmixture、hotstarttaq酶时，反应体系中各组分的用量会有所不同，可以根据实际需要进行调整。本发明对msp反应体系中各组分的用量没有特别的限制，使用常规的用量即可。

利用上面建立的msp反应体系对制备的dna模板(8例结直肠癌组织样本crc1-crc8，5例正常结直肠组织样本nc1-nc5)分别进行扩增，并以与上述组织同时硫化修饰后的结肠癌细胞系rko细胞dna为甲基化对照(ivd)，以硫化修饰后的人外周血淋巴细胞dna为非甲基化对照(nl)，以去离子水作为阴性系统对照(h2o)，扩增程序为：95℃下预变性5min，接着进入循环，在95℃下变性30s，在60℃下退火30s，在72℃下延伸40s，共35个循环，之后，继续在72℃下延伸7min。

3.msp反应产物的检测

msp产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，紫外透射分析仪检测并照相。

4.结果

图1以硫化修饰后的人外周血淋巴细胞dna(非甲基化对照)，硫化修饰后的结肠癌细胞系rko细胞dna(甲基化对照)，去离子水(阴性系统对照)建立对照体系，分别用甲基化引物及非甲基化引物对结直肠癌组织样本和正常结直肠组织样本进行msp检测。扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果(分别扩增，混合点样)如图所示。

marker为dl2000marker(分子量标准)

m标记的2、4、6、8、10、12、14、16泳道为甲基化引物扩增的产物；

u标记的1、3、5、7、9、11、13、15泳道为非甲基化引物扩增的产物；

crc1～crc8为结直肠癌组织样本，nc1-nc5为正常结直肠组织样本；另有ivd标记的为甲基化对照，nl标记的非甲基化对照，h2o阴性系统对照(去离子水)。

结果判读方法如下：

用甲基化引物(图中以m表示)进行扩增，有扩增产物，而用非甲基化引物(图中以u表示)进行扩增，无扩增产物的标本，判读为完全甲基化；

用甲基化引物及非甲基化引物进行扩增，均有扩增产物的标本，判读为部分甲基化；

用非甲基化引物进行扩增，有扩增产物，用甲基化引物进行扩增，无扩增产物的标本，判读为非甲基化。

部分甲基化及完全甲基化的标本均判读为甲基化。

如图1所示，结直肠癌crc1、crc2、crc4、crc6为部分甲基化；结直肠癌crc3、crc5、crc7、crc8为非甲基化；正常结直肠(nc1-nc5)均为非甲基化。对照体系反应正常，结果可信。

实施例二：临床标本检测

取98例结直肠癌临床组织标本和5例正常结直肠组织，进行msp扩增，模板制备、pcr扩增体系及条件、扩增产物的检测均与实施例一中的相同，检测结果请见下表1：

表1

实施例三：敏感度实验

将结直肠癌细胞系rko的dna(rai2基因启动子区100％甲基化)与正常结直肠组织细胞的dna(rai2基因启动子区100％非甲基化)按比例混合，进行硫化修饰(方法同实施例一)，再用甲基化引物进行msp。msp产物进行2％琼脂糖电泳，紫外透射分析仪测定并照相。

分组：

第1组：100％结直肠癌rko细胞dna+0％正常结直肠癌细胞dna

第2组：50％结直肠癌rko细胞dna+50％正常结直肠癌细胞dna

第3组：5％结直肠癌rko细胞dna+95％正常结直肠癌细胞dna

第4组：1％结直肠癌rko细胞dna+99％正常结直肠癌细胞dna

第5组：0.1％结直肠癌rko细胞dna+99.9％正常结直肠癌细胞dna

第6组：0％结直肠癌rko细胞dna+100％正常结直肠癌细胞dna

结果如图2所示：在1000个正常细胞中有5个结直肠癌细胞就可以被检测出，即用本发明的引物对及试剂盒检测结直肠癌细胞rai2基因启动子区的甲基化状态，其灵敏度可达到0.1％，灵敏度较高，可用来监测早期结直肠癌癌变。

实施例四：检测结肠癌细胞的试剂盒组成

检测结肠癌细胞的试剂盒包括以下成分，其中，进行1次ms-pcr的用量为：

1、甲基化引物：上游引物核苷酸序列为seqidno.1，下游引物核苷酸序列为seqidno.2，各为0.5ul。

2、非甲基化引物：上游引物核苷酸序列为seqidno.3，下游引物核苷酸序列为seqidno.4，各为0.5ul。

3、反应液2份，每份反应液包括：

(1)50mmmgcl2：0.75ul；

(2)10×mspbuffer：2.5ul；

(3)10mmdntpmixture：1.25ul；

(4)hotstarttaq酶：0.1ul。

一个试剂盒可以包括上述各成分进行多次ms-pcr的用量，如25次、50次、100次等，各成分的具体量视情况需要而定。

为防止出现msp扩增产物的假阳性，试剂盒还可包括以下几项组成：

a、甲基化对照msp模板：硫化修饰后的rai2基因启动子区为100％甲基化的结直肠癌rko细胞系dna，进行1次msp的用量为：2ul。

b、非甲基化对照msp模板：硫化修饰后的rai2基因启动子区为100％非甲基化的正常外周血淋巴细胞dna，进行1次msp的用量为：2ul。

c、阴性系统对照：去离子水，用以评估体系是否存在pcr产物的污染，如去离子水检测的结果为阴性(m和u均为阴性)，则体系结果可信，进行1次msp的用量为：2ul。

核苷酸序列表

<110>中国人民解放军总医院

<120>检测细胞rai2基因启动子区dna甲基化状态的引物对及试剂盒

<160>4

<210>1

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的序列

<400>1

gggcgtcgtacgtagatatatattc25

<210>2

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的序列

<400>2

ctaaaactctccgatctaacctcg24

<210>3

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的序列

<400>3

ggtgttgtatgtagatatatatttgt26

<210>4

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的序列

<400>4

taaaactctccaatctaacctcacc25