猪瘟病毒配体表位多肽SE242及其应用的制作方法

本发明属于分子病理学与免疫学技术领域，具体涉及猪瘟病毒配体表位多肽se242及其应用。

背景技术：

猪瘟(csf)是由猪瘟病毒(csfv)感染引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。是猪最严重的传染病之一，给养猪业造成巨大的经济损失，被世界动物卫生组织列为烈性传染病，也是我国农业部规定的一类传染病。csfv属于黄病毒科、瘟病毒属成员之一，其基因组为线状单股正链rna，可以编码12种成熟病毒蛋白，其中c、erns、e1和e2为结构蛋白，其余为非结构蛋白。结构蛋白erns、e1和e2在病毒对宿主细胞的识别、吸附及病毒抗原性上具有重要作用。因此，对csfv结构蛋白的研究主要集中在此三种蛋白上。

病毒配体通常是指与病毒受体发生特异性结合的病毒表面分子，即病毒的吸附蛋白。病毒受体是指位于宿主细胞表面能够识别病毒配体并与之发生特异性结合的分子复合物。病毒配体与靶细胞表面病毒受体的特异性结合是病毒感染的关键环节，所以阻断这两者的结合可以有效抑制病毒性疾病感染的发生。近年来，以病毒受体或病毒配体作为抗病毒药物的靶点，筛选抗病毒的多肽药物和疫苗成为研究的热点。

中国专利公开了猪瘟病毒csfve2蛋白配体表位多肽及其应用(cn2011101126535)，其公开的多肽氨基酸序列为

vhasderlgpmpcrpkeigssagpvrktsctfnyaktgknkyyeprdsyf，其分子量为5.73kda；并以pk-15细胞为靶细胞，通过csfv的感染、收获，测定了csfv的tcid50和感染比，进行合成多肽与靶细胞的结合试验、病毒阻断试验和多肽阻断csfv感染靶细胞的试验，筛选了特异性结合靶细胞的能够抑制病毒感染的配体表位多肽，对csfve2蛋白配体表位进行了初步定位。但是由于上述专利的多肽氨基酸序列较长，配体定位不够精确，在实际应用过程中合成成本过高，其应用推广受到很大的限制，因此对配体表位多肽的精确定位显得尤为重要。目前，尚未见e2蛋白配体表位精确定位的相关报道。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明的目的是提供猪瘟病毒配体表位多肽se242及其应用，该多肽可以有效结合pk-15细胞，并且se242和pk-15细胞的结合可以被csfv阻断，确定se242为csfv结合靶细胞的配体表位。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

猪瘟病毒配体表位多肽se242，所述的多肽se242的氨基酸序列为：sagpvrktsctfnyaktgknkyyeprdsyf。

一种猪瘟病毒配体表位多肽se242结合pk-15细胞和cfsv阻断se242结合pk-15细胞试验中的应用。

一种猪瘟病毒配体表位多肽se242在抑制cfsv感染pk-15细胞中的应用。

一种猪瘟病毒配体表位多肽se242在研制抑制csfv感染靶细胞的药物或疫苗中的应用。

本发明的有益效果：

1、本发明设计合成位于se24多肽上的短肽，得到了多肽se242。多肽se242与pk-15细胞的结合和阻断试验结果显示，多肽se242结合pk-15细胞的平均荧光强度显著高于fitc对照组，csfv阻断se242结合pk-15细胞的平均荧光强度明显低于结合试验，证实多肽se242能够有效结合pk-15细胞，并且se242和pk-15细胞的结合可以被csfv阻断，确定se242为csfv结合靶细胞的配体表位。同时，本发明se242结合pk-15细胞平均荧光强度高于se24，被csfv阻断效果显著高于se24，证明配体表位se242特异性比se24强。

2、本发明公开的多肽氨基酸序列较短，对猪瘟病毒结合靶细胞的配体表位进一步精确定位，在实际应用中比现有技术公开的多肽成本大幅降低。

3、本发明通过结合试验和阻断试验相互印证，csfv与pk-15细胞的病毒受体结合后，阻止了多肽与病毒受体的结合，进而证明多肽se242和csfv结合在同类细胞受体。提示该多肽是预防和治疗猪瘟的理想药物靶标，为进一步开发和研制新型抗病毒药物和疫苗奠定基础。同时为猪瘟的防治提供了新的途径。

附图说明

图1为细胞免疫化学染色技术检测培养繁殖的csfv(200×)。图中，a为感染csfv的pk-15细胞；b为空白对照细胞。

图2为多肽se242的lc-ms/ms图谱。横坐标表示离子的质荷比值(m/z)，纵坐标表示离子流的强度(最强离子流强度为100％)。

图3为多肽se242与pk-15细胞结合与阻断试验结果。图中，a为fitc对照；b为多肽se242与pk-15细胞结合；c为csfv阻断多肽se242与pk-15细胞的结合。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

实施例1

本发明对所用的猪瘟病毒石门株(细胞毒)进行多项指标测定，以确定该株石门株(细胞毒)csfv能够满足本发明的使用要求。

1、csfv的elisa效价测定

将猪瘟病毒石门株(细胞毒)感染培养好的单层pk-15细胞，37℃经48-56h培养后收获病毒，反复冻融3次破碎细胞裂解出病毒，4℃、3000rpm离心10min，弃去沉淀，上清即为繁殖病毒液。用猪瘟病毒抗原检测试剂盒(serelisahcvagmonoindirect产品)检测收获的病毒液。将病毒液1:50、1:100、1:200、1:400倍稀释，每个稀释度均做6个重复，检测结果见表1。以与阴性对照od450值的比值为2.2倍且总值≥0.2的稀释度为病毒的效价，从表中可以看出，病毒液的效价为1:200。

表1检测猪瘟病毒的效价

注：“+”代表阳性，“－”代表阴性。

2、csfv的tcid50测定

检测病毒培养物的感染力，即毒力。病毒毒力的测定有2种方法，一种方法是采用实验动物测定半数致死量(ld50)或在鸡胚上测定半数鸡胚感染量(eld50)；另一种方法是在组织细胞上测定半数细胞培养物感染量(tcd50又称tcid50)。tcid50可以用reed-muench两氏法、内插法、karber法计算。本发明采用固定pk-15细胞稀释病毒法计算繁殖病毒的tcid50，结果见表2，在病毒液稀释度为10^-1、10^-2、10^-3时，接种的4孔细胞全部感染，稀释度为10^-4是，有2孔感染，稀释度为10^-5、10^-6时全部不感染，正常细胞作为空白对照全部不感染。按照上述试验结果利用reed-muench两氏法计算tcid50。

表2固定pk-15细胞稀释病毒法计算csfv的tcid50

本试验中高于50％病毒稀释度的对数为–3，距离比例为0.5，稀释度对数之间的差为–1。

logtcid50＝0.5×(–1)+(–3)＝–3.5

tcid50＝10^-3.5，含义为将病毒液稀释10^3.5倍，每孔接种100μl病毒液，可使半数细胞发生感染。

3、csfv感染复数(moi)的测定

感染复数或感染比(multiplicityofinfection)：指在一个系统中感染病毒的细胞数与细胞总数之比。将2×tcid50csfv感染pk-15细胞后，用细胞免疫化学染色技术检测培养繁殖的csfv，csfv感染pk-15细胞后显棕红色(图1a)，正常对照pk-15细胞不显色(图1b)。计算moi时要计数感染细胞和96孔细胞培养板每孔的细胞总数，然后分析试验结果。细胞计数时，取一滴细胞悬液于细胞计数板上，在倒置显微镜下计算斜对角线上四个大方格里的细胞总数，计算公式为：

每孔细胞总数＝n/4×稀释倍数×10⁴×细胞液毫升数(n为四个大方格的细胞总数)。

结果：96孔细胞培养板中感染的每孔细胞平均数为150个；计数板四个大方格的细胞总数为280个，每孔细胞液毫升数为0.1ml，稀释倍数为10^-1倍，经计算得知每孔细胞的总数为7.0×10³个，所以培养繁殖病毒的moi为：1:47。

4、结论

通过测定csfv的elisa效价、tcid50和感染复数(moi)，证实了该株石门株(细胞毒)csfv可以满足本发明研究的需要。

实施例2、合成多肽

研究表明，多肽se24(氨基酸序列：cvhasderlgpmpcrpkeigssagpvrktsctfnyaktgknkyyeprdsyf)可以有效结合pk-15细胞，可以有效抑制csfv感染pk-15细胞，且csfv可以阻断se24结合pk-15细胞，因此证实多肽se24为猪瘟病毒csfve2蛋白配体表位多肽。为进一步精确定位多肽se24上的配体表位信息，设计并合成了位于多肽se24上的1条短肽，合成肽se242的lc-ms/ms图谱见图2，序列如下：

se242：sagpvrktsctfnyaktgknkyyeprdsyf(seqidno.1)

实施例3、se242与pk-15细胞的结合和阻断试验

取生长良好的pk15细胞，pbs洗3次，用1％胰蛋白酶进行消化细胞，约消化1min，弃掉消化液，加含10％胎牛血清的dmem进行悬浮，1000rpm离心5min，用适量pbs重悬pk15细胞，计数，调整细胞浓度至1.0×10⁶个/ml，备用。

se242与pk-15细胞的结合试验：

将上述pk15细胞悬液(细胞浓度为1.0×10⁶个/ml)，混合均匀后置于ep管中，每管中100μl，即细胞数达到1.0×10⁵个。于管中加入多肽se242(已fitc标记)使se242终浓度达到0.2mg/ml，同时设fitc阳性对照，做三个重复，冰上避光作用2h，pbs洗3次，每次洗1000rpm离心5min，最后一次离心后加800μlpbs重悬细胞，流式细胞仪检测，计数10000个细胞，判定分析结果。

csfv阻断se242与pk15细胞结合试验：

取1.0ml上述pk15细胞悬液(细胞浓度为1.0×10⁶个/ml)，加200μltcid50为10^-3.5的csfv液，混合均匀，4℃作用40min。离心弃掉csfv液，再用pbs洗2次，最后用pbs重悬细胞，混合均匀后分装于ep管中，使每管中细胞数达到1.0×10⁵个。

于管中加入多肽se242(已fitc标记)使se242终浓度达到0.2mg/ml，同时设fitc阳性对照，做三个重复，冰上避光作用2h，pbs洗3次，每次洗1000rpm离心5min，最后一次离心后加800μlpbs重悬细胞，流式细胞仪检测，计数10000个细胞，判定分析结果。

结合试验和阻断试验表明，多肽se242结合pk-15细胞的平均荧光强度显著高于fitc对照组，csfv阻断se242结合pk-15细胞的平均荧光强度明显低于结合试验(图3、表3)，证实多肽se242可以有效结合pk-15细胞，并且se242和pk-15细胞的结合可以被csfv阻断，确定se242为csfv结合靶细胞的配体表位。进一步精确了csfv结合靶细胞的配体表位信息，为研制抑制csfv感染靶细胞的药物或疫苗奠定基础。

表3多肽se242与pk-15细胞结合和csfv阻断多肽结合试验结果

注：同行数据肩标不同字母表示差异显著(p＜0.05)；肩标相同字母或无字母标注表示差异不显著(p＞0.05)。

表4se24、se242多肽与pk-15细胞结合和csfv阻断多肽结合试验结果比较

注：同行数据肩标不同字母表示差异显著(p＜0.05)；肩标相同字母或无字母标注表示差异不显著(p＞0.05)。

从表4可以看出se24、se242与pk15细胞结合试验荧光强度差异显著，se24、se242被csfv阻断试验荧光强度差异显著。se242与pk-15细胞结合和其结合被csfv阻断效果显著高于se24。

实施例4、其它短肽的结合验证

通过以上结合试验和阻断试验结果表明，se242可以有效结合pk-15细胞，csfv可以阻断se242结合pk-15细胞，为再进一步精确定位se24多肽上的配体表位信息，设计并合成了位于se24多肽上的3条短肽，序列如下：

se24-1：cvhasderlgpmpcrpkeig(seqidno：2)

se24-2：pkeigssagpvrktsctfnya(seqidno：3)

se24-3：tfnyaktgknkyyeprdsyf(seqidno：4)

上述3条短肽经过多次与pk-15细胞的结合试验，证实此三条短肽不与pk-15细胞结合。

本发明将se24多肽设计合成1条短肽se242后，该短肽仍然与靶细胞结合，且在结合试验和病毒阻断结合试验表明se242与靶细胞结合和其结合被猪瘟病毒阻断的效果明显高于se24。证明本发明的多肽se242具有很好的特异性和精确性。进一步将se24多肽设计合成3条短肽后，3条短肽均不与靶细胞结合，说明更精确定位csfv配体表位有待进一步筛选研究。

以上所述仅为本发明最佳的实施例，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>河南科技学院

<120>猪瘟病毒配体表位多肽se242及其应用

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