一种以硼酸频哪醇酯为识别受体的超灵敏高选择过氧化亚硝酸盐比色比率荧光探针的制作方法

本发明涉及硼酸频哪醇酯作为识别受体的罗丹明类化合物作为过氧化亚硝酸盐比色比率荧光探针，其可在特定条件下对过氧化亚硝酸盐快速高选择性识别中应用，或者其可测定样品中过氧化亚硝酸盐的浓度。

背景技术：

过氧化亚硝酸盐是由一氧化氮和过氧化物反应所生成的活性氧化剂，具有杀菌消毒的作用，在人体免疫系统中发挥重要的作用。若过氧化亚硝酸盐异常积累，其以及二级代谢物可以和蛋白质类、脂类及核酸类物质反应，进而促进细胞毒性作用导致细胞死亡和促进炎症反应，可以引起阿尔茨海默病、关节炎、自身免疫性疾病等其他病症从而对人类健康构成巨大威胁。因此，检测生物体内过氧化亚硝酸盐的浓度已经成为一个重要的课题。

当前，常见的过氧化亚硝酸盐的检测手段主要是电化学方法(如阳极溶出伏安法、氧化还原电位法等)。但这种手段在实际应用中既昂贵又繁琐，且常常需要特殊的实验仪器以及高技能专业人员进行操作。因此，高效、廉价、简捷的过氧化亚硝酸盐检测手段成为重要的研究课题。

在各种离子/分子的检测方法中，比色荧光探针检测法由于操作简单，可在现场进行使用，选择性和灵敏度高，检测范围广，响应时间快速，检测过程对样品没有破坏而极为引人注目。但是目前报道的荧光探针仍存在一些问题，包括灵敏度不理想、选择性差、ph稳定性差以及合成复杂等。总之，发展高灵敏度高选择性、合成简单的比色荧光探针是本领域技术人员急需解决的问题。

技术实现要素：

本领域急需一种制备简单的快速高灵敏高选择性识别过氧化亚硝酸盐的比色荧光探针，从而能够有效检测过氧化亚硝酸盐。为此，本发明合成了一类新颖的过氧化亚硝酸盐的比色荧光探针，其合成步骤简单、灵敏度高、稳定性高、和/或选择性高，和/或能够快速识别过氧化亚硝酸盐。

具体而言，本发明提供了一种过氧化亚硝酸盐比色荧光探针，其为罗丹明类化合物，以硼酸频哪醇酯为特异性识别受体，其结构如下：

优选的，本发明的荧光探针是：

在本发明的过氧化亚硝酸盐比色荧光探针的制备方法中，反应温度是25－120℃；反应时间是2-24h；和/或罗丹明类化合物与4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯的摩尔比为约1：1至1：2，优选为1：1.5或1：1.6。

本发明还提供了用于检测样本(例如河水样本)中过氧化亚硝酸盐浓度的检测制剂或试剂盒，其包含本发明的探针。优选地，本发明的检测制剂或试剂盒还包含产品的使用说明书。还优选地，本发明的试剂盒还包含用于测定样本中的过氧化亚硝酸盐浓度的缓冲剂。

本发明还提供了检测样本(例如河水样本)中过氧化亚硝酸盐浓度的方法，其包括将本发明的探针与待测样本接触的步骤。

本发明还提供了本发明的探针在制备用于检测样本(例如河水样本)中过氧化亚硝酸盐浓度的制剂中的用途。

本发明还提供了本发明的探针在制备用于检测样本(例如河水样本)中过氧化亚硝酸盐浓度的试剂盒中的用途。

本发明的过氧化亚硝酸盐荧光探针可与过氧化亚硝酸盐进行作用，产生荧光光谱的变化，从而实现对过氧化亚硝酸盐的定量检测

具体而言，本发明的过氧化亚硝酸盐荧光探针分别与过氧化氢、次氯酸、溴离子以及其他离子进行作用均不能导致荧光光谱的明显改变，从而实现对过氧化亚硝酸盐的选择性识别。

可选择地，本发明的过氧化亚硝酸盐荧光探针的稳定性好，进而能够长期保存使用。

进一步的，本发明的过氧化亚硝酸盐荧光探针是快速高选择性过氧化亚硝酸盐比色比率探针，且合成简单，有利于商业化的推广应用。

附图说明

图1是不同浓度过氧化亚硝酸盐(0－8μm)对探针(5μm)吸收光谱的影响及定量线性关系。

图2是不同浓度hg²⁺(0－2μm)对探针(5μm)荧光光谱的影响及线性定量关系。

图3是探针(5μm)对过氧化亚硝酸盐(5μm)响应时间的测试结果。

图4是不同分析物对探针(5μm)荧光光谱的影响。其中：1.空白；2.钾离子k⁺；3.钙离子ca²⁺；4.钠离子na⁺；5.镁离子mg²⁺；6.铝离子al³⁺；7.锌离子zn²⁺；8.铁离子fe³⁺；9.亚铁离子fe²⁺；10.铜离子cu²⁺；11.硝酸根离子no3^-；12.亚硝酸根离子no2^-；13.半胱氨酸cys；(3mm)14.谷胱甘肽gsh(3mm)；15.过氧化氢h2o2(200μm)；16.过氧化叔丁醇tbhp；17.羟基自由基·oh；18.过氧叔丁醇自由基·o^tbu；19.一氧化氮no；20.单线态氧¹o2；21.超氧化钾ko2；22.次氯酸钠naclo；23.碳酸根co3^2-；24.亚硫酸氢根hso3^-；25.碳酸氢根hco3^-；26.溴离子br^-；27.硫离子s^2-；28.过氧化亚硝酸盐onoo^-。

图5是探针对过氧化亚硝酸盐的裸眼检测，其中探针浓度为20μm，过氧化亚硝酸盐浓度分别为0、10、15、20μm，测试体系为乙醇：水(1:9，v/v)，pbs(20mm,ph＝7.4)测试温度为25℃。

具体实施方式：

本发明提供了上述快速高选择性过氧化亚硝酸盐荧光探针的合成路线、方法及其光谱性能。

本发明的过氧化亚硝酸盐荧光探针是一类以硼酸频哪醇酯为识别受体的罗丹明类化合物，其具有以下结构通式

上式中：r1，r2，r3，r4，r5，r6，r7，r8，r9，r10，r11，r12，r13，r14，r15和r16为氢原子，直链或支链烷基，直链或支链烷氧基，磺酸基，酯基，羧基；r1，r2，r3，r4，r5，r6，r7，r8，r9，r10，r11，r12，r13，r14，r15和r16可以相同或不同。

该类过氧化亚硝酸盐比色比率荧光探针的合成路线和方法如下：

具体地，本发明的荧光探针可以通过如下方法制备，将一定摩尔比(例如1：1－1：2)的罗丹明类化合物(例如1,6-二羟基萘和4-二乙氨基酮酸的合成产物)和4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯溶于二甲氨基甲酰胺(dmf)中，再加入碳酸铯和碘化钾，然后室温下搅拌一段时间(例如24h)，然后萃取、旋蒸得到粗产品。使用二氯甲烷：甲醇(30:1，v/v)体系进行柱色谱分离，得到浅粉色纯净产品588.6mg，产率为90﹪。

因此，本发明还提供了4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯在制备用于检测过氧化亚硝酸盐的比色比率荧光探针中的用途。

本发明还提供了罗丹明类化合物(例如1,6-二羟基萘和4-二乙氨基酮酸的合成产物)在制备用于检测过氧化亚硝酸盐的比色比率荧光探针中的用途。

本发明的快速超灵敏高选择性识别过氧化亚硝酸盐比色比率荧光探针的显著特征是能够快速高选择性地识别过氧化亚硝酸盐，能够准确对过氧化亚硝酸盐进行定量分析。

下面将通过借助以下实施例来更详细地说明本发明。以下实施例仅是说明性的，应该明白，本发明并不受下述实施例的限制。

实施例1

(方案1)将460mg(1.0mmol)罗丹明类化合物(例如1,6-二羟基萘和4-二乙氨基酮酸的合成产物)、297mg(1.0mmol)4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯、977mg(3.0mmol)碳酸铯和160mg(1.0mmol)碘化钾溶于6ml二甲氨基甲酰胺(dmf)中，然后常温搅拌24h，之后萃取旋蒸得到粗产品，最后使用二氯甲烷：甲醇(30:1，v/v)体系进行柱色谱分离，得到纯净产品569mg，产率为87﹪。

(方案2)将460mg(1.0mmol)罗丹明类化合物(例如1,6-二羟基萘和4-二乙氨基酮酸的合成产物)、356.4mg(1.2mmol)4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯、977mg(3.0mmol)碳酸铯和160mg(1.0mmol)碘化钾溶于6ml二甲氨基甲酰胺(dmf)中，然后常温搅拌24h，之后萃取旋蒸得到粗产品，最后使用二氯甲烷：甲醇(30:1，v/v)体系进行柱色谱分离，得到纯净产品582mg，产率为89﹪。

(方案3)将460mg(1.0mmol)罗丹明类化合物(例如1,6-二羟基萘和4-二乙氨基酮酸的合成产物)、445.5mg(1.5mmol)4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯、977mg(3.0mmol)碳酸铯和160mg(1.0mmol)碘化钾溶于6ml二甲氨基甲酰胺(dmf)中，然后常温搅拌24h，之后萃取旋蒸得到粗产品，最后使用二氯甲烷：甲醇(30:1，v/v)体系进行柱色谱分离，得到纯净产品589mg，产率为90﹪。

(方案4)将460mg(1.0mmol)罗丹明类化合物(例如1,6-二羟基萘和4-二乙氨基酮酸的合成产物)、475.2mg(1.6mmol)4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯、977mg(3.0mmol)碳酸铯和160mg(1.0mmol)碘化钾溶于6ml二甲氨基甲酰胺(dmf)中，然后常温搅拌24h，之后萃取旋蒸得到粗产品，最后使用二氯甲烷：甲醇(30:1，v/v)体系进行柱色谱分离，得到纯净产品588.6mg，产率为90﹪。

(方案5)将460mg(1.0mmol)罗丹明类化合物(例如1,6-二羟基萘和4-二乙氨基酮酸的合成产物1)、594mg(2.0mmol)4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯、977mg(3.0mmol)碳酸铯和160mg(1.0mmol)碘化钾溶于6ml二甲氨基甲酰胺(dmf)中，然后常温搅拌24h，之后萃取旋蒸得到粗产品，最后使用二氯甲烷：甲醇(30:1，v/v)体系进行柱色谱分离，得到纯净产品582.6mg，产率为89﹪。

实施例2

本发明的发明人进行了如下测试：不同浓度onoo^-(0-8μm)对探针(5μm)吸收光谱的影响以及定量线性关系。上述测定是在20mmpbs,ph7.4的含10％乙醇的水溶液中进行的，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且所有光谱测试都是在25℃下加入onoo^-作用3min后测得的。结果参见图1。

从图1可以看出，随着过氧化亚硝酸盐的浓度增加吸收光谱逐渐上升，并且溶液颜色由无色变为浅紫色。

实施例3

不同浓度onoo^-(0－2μm)对探针(5μm)荧光光谱的影响。上述测定是在20mmpbs,ph7.4的含10％乙醇的水溶液中进行的，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且所有光谱测试都是在25℃下作用3min后测得的。结果参见图2。

从图2可以看出，伴随着探针溶液中onoo^-浓度的增加，560nm处的荧光光谱逐渐下降，同时630nm处的荧光光谱逐渐升高，且在0-2μm的onoo^-浓度范围内，onoo^-的浓度和荧光强度的比值显现线性关系。因此，本发明的探针能利用比率荧光法精确地确定待测样本中过氧化亚硝酸盐的含量。

实施例4

探针(5μm)对onoo^-(5μm)响应时间的测试结果。上述测定是在20mmpbs,ph7.4的含10％乙醇的水溶液中进行的，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且所有光谱测试都是在25℃下测得的。结果参见图3。

从图3可以看出，加入等量过氧化亚硝酸盐后，荧光强度极速升高，并且在5秒之后保持最大值。

实施例5

不同分析物对探针(5μm)荧光光谱的影响。其中：1.空白；2.钾离子k⁺；3.钙离子ca²⁺；4.钠离子na⁺；5.镁离子mg²⁺；6.铝离子al³⁺；7.锌离子zn²⁺；8.铁离子fe³⁺；9.亚铁离子fe²⁺；10.铜离子cu²⁺；11.硝酸根离子no3^-；12.亚硝酸根离子no2^-；13.半胱氨酸cys；(3mm)14.谷胱甘肽gsh(3mm)；15.过氧化氢h2o2(200μm)；16.过氧化叔丁醇tbhp；17.羟基自由基·oh；18.过氧叔丁醇自由基·o^tbu；19.一氧化氮no；20.单线态氧¹o2；21.超氧化钾ko2；22.次氯酸钠naclo；23.碳酸根co3^2-；24.亚硫酸氢根hso3^-；25.碳酸氢根hco3^-；26.溴离子br^-；27.硫离子s^2-；28.过氧化亚硝酸盐onoo^-(5μm),它们的浓度(除特殊标注外)均为500μm。所有测试条件是20mmpbs,ph7.4的含10％乙醇的水溶液中进行的，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且所有光谱测试都是在25℃下作用3min后测得的。结果参见图4。具体地，移取50μl的探针储备液(1mm)放进10ml比色管中，然后加入1ml乙醇和5ml超纯水，再移取20μl上述分析物储备液加入比色管内，然后移取2.0ml的pbs溶液(ph7.4,100mm)加入比色管内，最后用超纯水定容至10ml。摇匀，静置3min，即可测定。结果如图4所示。

从图4可以看出，探针对过氧化亚硝酸盐具有很高的选择性，能够专一性地和过氧化亚硝酸盐进行反应，反应前后，荧光光谱有明显变化，而其他离子与探针作用后荧光强度并不发生明显变化。

实施例六

探针对过氧化亚硝酸盐的裸眼检测，见图5，其中探针浓度为20μm，过氧化亚硝酸盐浓度分别为0、10、15、20μm，测试体系为乙醇：水(1:9，v/v)，pbs(20mm,ph＝7.4)测试温度为25℃。

由图5可以得到，随着过氧化亚硝酸盐的浓度不断增加，溶液颜色逐渐由无色变为紫色，能够对过氧化亚硝酸盐进行方便快捷的裸眼检测。

虽然用上述实施方式描述了本发明，应当理解的是，在不背离本发明的精神的前提下，本发明可进行进一步的修饰和变动，且这些修饰和变动均属于本发明的保护范围之内。