一种II型糖尿病相关基因KCNIP1拷贝数变异的检测方法与应用与流程

本发明涉及人类疾病分子生物学检测领域，具体涉及一种检测型糖尿病相关基因kcnip1拷贝数变异的方法与应用。

背景技术：

拷贝数变异（copynumbervariation，cnv）是基因组dna上一种亚显微水平的结构变异，涉及的基因组序列大小从1kb到多个mb，包括拷贝数增加（copynumbergain）和拷贝数减少（copynumberloss）。人类基因组中存在广泛的拷贝数变异，大部分cnv区域属于dna序列多态性范畴，是构成人类基础表型多样性的分子基础，有些cnv并不引起任何表型变化。然而，还有一些cnv能够扰乱功能基因的结构，影响基因表达，最终引起人类复杂疾病的发生。因此，鉴定出与疾病密切相关的cnv位点，对于疾病的筛查和诊断至关重要，具有重大的应用价值。

目前，cnv的检测技术主要包括：比较基因组杂交芯片（acgh），该技术是将未知样品与对照样品的基因组dna进行杂交，根据杂交信号差异在染色体或染色体亚带水平上发现cnv。但是，acgh技术的灵敏度在mb水平，对mb以下的小片段cnv则无法检出。此外，该技术操作繁琐、耗时长、成本昂贵，且需要的模板dna量大，不利于大范围推广。多重连接探针扩增技术（mlpa），该技术是2002年发展起来的一种cnv检测方法，其相对定量结果准确度高，但该技术操作繁琐、耗时长，探针制备过程也较为复杂。mlpa后期分析是通过毛细管电泳，通量较低且成本较高，另外操作过程种容易造成pcr产物的污染。高分辨熔解曲线分析（hrm），该技术是2003年发展起来的，其技术核心是通过准确的控制变温速率，根据核酸染料的指示，研究pcr产物的熔解温度，进而分析拷贝数变异。hrm技术具有快速、廉价、高通量等优点，然而该技术还存在如下缺点，首先由于其研究对象为杂合位点，大大增加了实验成本和设计难度。同时，微小差异的发生对熔解曲线的影响较小，有的甚至不会引起任何偏移，严重降低该技术的检测灵敏度。实时荧光定量pcr（qpcr），该技术核心是在pcr反应体系中加入sybrgreen荧光染料，pcr扩增过程中，染料分子能够特异性地渗入双链dna中并发射荧光信号，而未结合dna的sybrgreen不发射荧光，因此，实验中采集到的荧光信号与pcr产物的增加呈正相关，可通过检测sybrgreen的荧光强度反映模板dna的含量。采用qpcr技术进行cnv检测时，对目的片段（候选cnv区域）及参考基因（单拷贝）分别定量，然后根据log22^−δδct值（参照高通量技术的计算原则）确定所有待测样本的拷贝数变异情况。该技术具有实验成本低、无需设计合成探针、操作简单、使用方便等优点，但不适用于大量样本的高通量检测。

糖尿病被认为是世界上第五大严重危害人类健康的疾病，其中90%为非胰岛素依赖型糖尿病，又称为型糖尿病。该病属于复杂的代谢紊乱性疾病，其发病机制复杂，是遗传和环境互作的结果，其中遗传多态性可能是影响个体间疾病易感性的主要因素。由于型糖尿病的早期临床症状不明显，往往使患者延误最佳的治疗时机。因此，对人类基因组中与型糖尿病相关的变异位点进行探索和鉴定，将有利于该疾病的早期筛查和诊断，及时控制病程的进展。

kv通道蛋白1（kcnip1）基因，是kcnip家族成员之一。kcnip1蛋白通过与下游靶基因的调控元件直接结合，进而调控其表达，在调控胰腺β细胞胰岛素分泌过程中发挥了重要作用。lee等研究发现敲除kcnip1基因能够影响β细胞的复极化，促进胰岛素分泌（leehs，moon，s，yun，jhetal.genome-widecopynumbervariationstudyrevealskcnip1asamodulatorofinsulinsecretion.genomics2014;104:113-120.）。由此可见，kcnip1基因可能与糖尿病的发生有关。高通量测序发现kcnip1基因序列中存在1854bp的拷贝数变异，我们推测该cnv可能造成个体间糖尿病的易感性差异。然而，目前尚未见kcnip1基因cnv影响型糖尿病相关临床指征的文献报道。因此，研究kcnip1基因cnv与型糖尿病的关系，并鉴定出易感基因型，可以为型糖尿病的临床诊断提供科学依据，具有重大的实际意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于鉴定一种与型糖尿病易感性相关的cnv标记，并提供该cnv标记的检测方法，以此作为临床指标，应用于型糖尿病的早期筛查和诊断。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种ii型糖尿病相关基因kcnip1拷贝数变异的检测方法，以糖尿病患者和正常人的血液基因组dna为模板，以引物对p1（f1、r1）和p2（f2、r2）为引物，通过实时荧光定量pcr分别扩增kcnip1基因cnv区域和内参基因rnasep，根据定量结果分析kcnip1基因cnv在糖尿病患者和正常人中的分布差异，鉴定出该位点在糖尿病患者中的易感基因型。

本发明的所述与型糖尿病易感性相关的cnv标记，是指kcnip1基因候选区域chr5q35.1:170062275–170064128的拷贝数变异。具体地，所述的cnv标记位于人kcnip1基因（genbankaccessionnc_000005.9）所示序列的281784bp-283637bp区域内，根据log22^−δδct将kcnip1基因cnv区域分为三种基因型：log22^−δδct>0.5则为插入型；log22^−δδct<-0.5则为缺失型，log22^−δδct≤|±0.5|则为正常型。

本发明还提供用于检测与型糖尿病相关的cnv标记的引物对，所述引物信息如表1所示：

表1实时荧光定量pcr的引物信息

本发明所述的用于实时荧光定量pcr检测的前述与型糖尿病相关的cnv标记试剂盒包括2×sybrgreenqpcrmix和去离子水。

本发明还提供所述的kcnip1基因cnv标记在型糖尿病的早期筛查和诊断中的应用。

前述的应用是通过以下技术方案来实现：

（1）提取待测型糖尿病患者和正常人的基因组dna；

（2）以上述提取的基因组dna为模版，利用表1中的引物对进行实时荧光定量pcr检测kcnip1基因的cnv位点；

（3）以正常人为对照，根据log22^−δδct值确定型糖尿病患者的cnv基因型，如果拷贝数为插入型，则待测个体对糖尿病更易感，患病症状更严重，而缺失型个体则相反。

步骤（2）中进行实时荧光定量pcr所用的扩增体系以20μl计为：50ng/μl模板dna1μl，10pmol/l的上、下游引物各1μl，2×sybrgreenqpcrmix10μl，去离子水7μl。

步骤（2）中进行实时荧光定量所用的pcr扩增的反应程序为：预变性95℃15s；扩增反应：95℃变性10s，60℃退火30s，39个循环；绘制溶解曲线：95℃5s，-0.01℃/s，65℃1min。

所述的应用包括以下步骤：

（1）采用实时荧光定量pcr技术检测候选的kcnip1基因cnv位点在型糖尿病患者和正常人中的拷贝数变异情况，鉴定出与型糖尿病易感性相关的cnv基因型；

（2）利用spss20.0软件将拷贝数变异类型与空腹血糖、糖化血红蛋白等型糖尿病相关临床指标进行关联分析；

（3）根据拷贝数变异类型进行型糖尿病的筛查和临床诊断。

本发明的实施案例中，以人kcnip1基因chr5q35.1:170062275–170064128区域为候选位点，通过实时荧光定量pcr技术检测该位点在型糖尿病患者和正常人中的拷贝数变异情况，并分析该cnv在两个群体中的分布差异，同时将cnv不同基因型与空腹血糖、糖化血红蛋白等型糖尿病临床指标进行关联分析；如果检测kcnip1基因候选位点的拷贝数为插入型，则待测个体对糖尿病更易感，患病症状更严重，如果拷贝数为缺失型，待测个体的糖尿病症状较轻。

与现有技术相比，本发明提供的kcnip1基因拷贝数变异的检测方法操作简便、成本低廉、结果准确可靠，且不受检测dna模板量的限制，可对微量样品进行cnv检测。

kcnip1基因在调控胰岛素合成和分泌过程中发挥了至关重要的作用，将kcnip1基因的cnv位点与型糖尿病的临床指标进行关联分析表明，空腹血糖、糖化血红蛋白、胰岛素水平等受到显著影响，因此，kcnip1基因的chr5q35.1:170062275–170064128拷贝数变异位点可以作为型糖尿病早期筛查和诊断的分子标记。

附图说明

图1为本发明中采用实时荧光定量pcr检测kcnip1基因cnv在ii型糖尿病患者（t2d）和正常人（control）基因组中的分布情况。

图2为kcnip1基因拷贝数与糖尿病患者空腹血糖、糖化血红蛋白的相关性分析。

图3为kcnip1基因3种拷贝数变异型与ogtt实验中的血糖、胰岛素水平的比较分析。

具体实施方式

下面对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。若未特别指明，均按照常规的实验条件或按照制造厂商说明书建议的条件。

一种ii型糖尿病相关基因kcnip1拷贝数变异的检测方法，以糖尿病患者和正常人的血液基因组dna为模板，以引物对p1（f1、r1）和p2（f2、r2）为引物，通过实时荧光定量pcr分别扩增kcnip1基因cnv区域和内参基因rnasep，根据定量结果分析kcnip1基因cnv在糖尿病患者和正常人中的分布差异，鉴定出该位点在糖尿病患者中的易感基因型。

其中所述的cnv标记是指人kcnip1基因（genbank:nc_000005.9）候选区域chr5q35.1:170062275–170064128的拷贝数变异；所述的拷贝数变异位点根据log22^−δδct值可分为3种基因型：插入型（log22^−δδct>0.5）；缺失型（log22^−δδct<-0.5）；正常型（log22^−δδct≤|±0.5|）；所述的实时荧光定量pcr试剂包括2×sybrgreenqpcrmix和去离子水；所述的实时荧光定量pcr引物对p1和p2序列信息见表1：

表1实时荧光定量pcr的引物信息

本发明检测方法中kcnip1基因cnv位点作为分子标记，应用于ii型糖尿病的筛查和诊断时，具体包括以下步骤：

（1）提取ii型糖尿病患者和正常人的血液基因组dna；

（2）以上述基因组dna为模版，利用权利要求4中的引物对进行实时荧光定量pcr检测kcnip1基因cnv；

（3）根据kcnip1基因cnv的检测结果，如果拷贝数为插入型，则待测个体对糖尿病更易感，患病症状更严重，而缺失型个体则相反。

其中，所述步骤（2）中进行实时荧光定量pcr所用的扩增体系为20μl，包含50ng/μl模板dna1μl，10pmol/l的上、下游引物各1μl，2×sybrgreenqpcrmix10μl，去离子水7μl。

其中，所述步骤（2）中进行实时荧光定量pcr所用的反应程序为：预变性95℃15s；扩增反应：95℃变性10s，60℃退火30s，39个循环；绘制溶解曲线：95℃5s，-0.01℃/s，65℃1min

本发明利用实时荧光定量pcr对ii型糖尿病相关基因kcnip1的cnv进行检测时步骤如下：

1、血液样本采集

本发明具体以ii型糖尿病患者和正常个体作为检测对象，126个ii型糖尿病患者的血液样本采自武汉科技大学附属天佑医院内分泌科，100个正常人血液样本采自武汉大学校医院体检科。本实验内容是经过武汉科技大学附属天佑医院医学伦理委员会批准。

2、基因组dna的分离、提取、纯化

参考文献sambrocketal(2002)方法。

3、cnv序列及参考序列的扩增

以ncbi数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的人kcnip1基因序列（genbankaccessionnc_000005.9）为参考序列，利用primer5.0设计实时荧光定量pcr引物检测kcnip1基因拷贝数变异，扩增片段大小为101bp。内参序列为已知的不存在拷贝数变异的序列，即rnasep基因中的一段122bp的序列。引物对序列信息如表1所示。

其中，进行实时荧光定量pcr所用的扩增体系以20μl计为：50ng/μl模板dna1μl，10pmol/l的上、下游引物各1μl，2×sybrgreenqpcrmix10μl，去离子水7μl。

pcr扩增的反应程序为：预变性95℃15s；扩增反应：95℃变性10s，60℃退火30s，39个循环；绘制溶解曲线：95℃5s，-0.01℃/s，65℃1min。

4、拷贝数变异分析

每个待测样品分别用目标序列和参考序列的引物进行扩增，并且每个扩增反应做3个重复。根据2^−δδct方法进行拷贝数变异分析。其中δδct=(ct目的基因-ct内参基因)实验组-(ct目的基因-ct内参基因)对照组。实验组即为待检测有无cnv的样本，对照组即为已知无拷贝数变异的样本。2^−δδct表示的是实验组目标序列的拷贝数相对与对照组的倍数。然后将基因的拷贝丰度进行对数转化（以2为底2^−δδct的对数）使之符合正态分布，进行方差齐性检验后，统计检验各组间的差异。

当cnv位点为正常型时，根据log22^−δδct计算出归一化值接近0，即log22^−δδct≤|±0.5|；当cnv为缺失型时，log22^−δδct计算出归一化值log22^−δδct<-0.5；当cnv为插入型时，log22^−δδct计算出归一化值log22^−δδct>0.5。

kcnip1基因拷贝数在ii型糖尿病患者（t2d，n=126）和正常个体（control，n=100）中的分布情况如图1所示，该cnv在两个群体中分布呈极显著差异（p<0.01），拷贝数插入型在ii型糖尿病患者中属于优势基因型，而拷贝数正常型在正常人中属于优势基因型。

5、kcnip1基因cnv位点与ii型糖尿病临床指标的关联分析

（1）kcnip1基因不同拷贝数与空腹血糖、糖化血红蛋白相关性分析

首先，确定ii型糖尿病患者的kcnip1基因cnv位点的拷贝数目，将拷贝数的变化与对应的空腹血糖、糖化血红蛋白水平进行皮尔逊相关性分析，结果如图2所示，kcnip1基因的拷贝数与空腹血糖、糖化血红蛋白水平均呈正相关（p<0.05），拷贝数越大，其临床症状越明显。

（2）kcnip1基因cnv位点与血糖、胰岛素水平的关联分析

临床数据：ogtt实验中血糖和胰岛素水平。

关联分析模型：先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，应用spss20.0软件分析各基因型间的生产性状效应。在对基因型效应进行分析时采用了固定模型：

yij=μ+cnvi+eij，

其中：yij为性状观察值，μ为总体均值，cnvi为第i个拷贝数变异类型的固定效应，eij为随机误差。各组数据间的差异性采用lsd多重比较进行检验，试验结果以mean±se形式表示。

ogtt实验的关联分析结果表明（见图3），kcnip1基因cnv位点可显著影响60-min、120-min和180-min的血糖和胰岛素水平，其中，拷贝数插入型（copynumbergain）的血糖水平显著高于缺失型（copynumberloss），相反地，拷贝数缺失型（copynumberloss）的胰岛素水平显著高于插入型（copynumbergain）。由此可见，kcnip1基因该cnv位点不同基因型与ii型糖尿病的临床指标显著相关。

6、上述cnv标记在ii型糖尿病临床筛查和诊断中的应用

鉴定的kcnip1基因chr5q35.1:170062275–170064128位点的拷贝数变异可作为重要的分子遗传标记，其中，拷贝数插入型为疾病易感基因型，可作为型糖尿病早期筛查和诊断的重要指征。

核苷酸序列表

<110>武汉科技大学

<120>一种ii型糖尿病相关基因kcnip1拷贝数变异的检测方法与应用

<160>3

<210>1

<211>1854

<212>dna

<213>人(human)

<220>

<400>1

ctgcctgcctcggcctcccaaagtgttgagattacaggagtgagccatcacgcccggccaagaagaccttttaaagtagatgttctaagagtctctttcagttctgaatctctttgttatcttacatgttaccccctcagagatgccttccctcactcccctgtccaaggtagctctccacccaagtcagcagtcatcacagaaccatcacaacctgaagccctgtgcatgttgctgtttatttcctgtttacatcacaacctgaagccctgtgcatgtagctgtatactaaccctagagttagtatagcttagttaaactttcatttattgctaaaggtttatcactgctgtctctatcagcctccctgcactgtaagggacaagggggcaggtccagtttctgtcttgtttcaggttttgtctccagccaagataagtatctttgcaaggctctgtttttattctgaaaggaaattaggagctattggagggtatggagtggaaggggacagtcttctgccttggatgtataaaagggatgctgggccacgctgatgggctagaccatggcaggcagagaaaacaggcaggaggccaggcaggggctgccagtgcccagacacaggccgggaggtgcaggtggcagtggcaggcagtggccaggccctgggtatattttgaaggtcaagccaacaggacttgccagtgggctgggtatgggcatgagacaggcaagttctcccagatgtgactccgatgtgacattttggagactccctcaacacccacctggggaagacagaccagttgggaggaaatatctggagtctcattttattaattctgagagtttgttgtattagacagtgaagcggaaatgtcaggaagtcagctggaaataggagtctggagttggggggaaagcctagccagagacaggaattgtggcgtcattggcgtagagacagcgtttaaagctgtgacgctagatgggttcaccaggggaatgagagtcgaaagagaagagcagagcagagctgagccctgaggggggcagaaaggcacacagggacagtggaggcaggaggcagaaggcagagggtggcgggccaacagctctgaaggtcagtgctctatcacaggggggtggccgaggaggggcccgaggctggaaccaggaggcactatcccaggcctgccttctcatgccagcagcagtgatctatcctcaaggagaatattgattgagcacctactgcatgcagagacctcatcaatggctcaatcaatatgacacggccacgcttcctgatccgagccctctgagcaggtattttccatcctggacttatccctgtttctcaggagagggatggacccaagagacaaatagttcccccaagatcgcacagcaagccagtgtaaaacaagcatagaaaccagcttttagggggctcaaggtgggggtcagaaaatgaggtgagagcaagcatttactgagcacctcctgtaaatatctcctacatacgaagtgctctacccacattactgaccacccaataaaggcaggtcctgtaattcccaatttgcagatggataagcagaggcttaggggtgtgaaacaacctcctcaaggtcatggcttctaagtggtggagccaggcctgcaaaccaggctgtctgaatccaaaatccacctccaagtccacagtgggttggccccacccccaacccatccccatcaccaacaggacggtggtcagagtccactgaatgaaagcatgcgtgcattcaaaatagacagccaatcagcagccttccatcagaaatgtcatctttatgacaacagcat1854

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>上游引物f1

<400>2

aatatgacacggccacgctt20

<210>3

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>下游引物r1

<400>3

tgtctcttgggtccatccct20

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>上游引物f2

<400>4

tctctcgtgtaccctcccag20

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>下游引物r2

　<400>5

ttgccagtgctgatgtctca20