本发明涉及生物技术领域里穿梭质粒及其应用，尤其涉及一个基于黄单胞菌的穿梭质粒及其应用。
背景技术
黄单胞菌是一类直杆状、无芽孢、严格好气的革兰氏阴性细菌。黄单胞菌属(xanthomonas)亦称黄单胞杆菌属，大部分成员是植物病原菌，其引起的植物病害已遍布全世界，造成了严重的经济损失。其中包括十字花科植物黑腐病、水稻白叶枯病、水稻条斑病、甘蔗细条病、柑桔溃疡病、禾谷黑颖病和棉花角斑病等，病害症状多为叶斑、叶枯、黑腐、萎蔫、溃疡等。另外，黄单胞菌均能合成胞外多糖，其中野油菜黄单胞菌合成的胞外多糖品质最好，被称为黄原胶，具有特殊的理化特性，已广泛用于工业原料、添加剂和石油开采。因此，深入研究黄单胞菌的致病分子机理和胞外多糖生物合成的分子机理，可为人们发展新型的防治植物病害的药物和采取必要的措施以及改良黄原胶生产菌株提供指导。
研究黄单胞菌的致病机理，或者研究黄原胶合成机理，首先需要弄清相关基因的功能。途径之一是使目的基因在特定的条件下得到扩增和表达。然而，由于目的基因本身无法进行复制和表达，且不易进入受体细胞以及不能得到稳定维持，故必须借助于载体及其宿主细胞来实现其扩增和表达。
质粒是独立于染色体以外的能自主复制的裸露的双链环状dna分子，少数为线形和核糖核酸(rna，ribonucleicacid)，是基因克隆、表达的主要载体之一。而质粒具有宿主专一性、不亲和性、严紧型和松弛型等特点，这对人们有效利用质粒载体造成了一定程度的不便。另外，质粒稳定复制以及质粒丢失问题，也是应用质粒载体的问题之一。
在黄单胞菌中，目前常用的质粒包括plafr系列质粒、pbad系列质粒、pph1ji、pkeb31以及pufr034等。有些质粒偏大，有些是专门化的载体，不能满足黄单胞菌功能基因组学发展的需要。未来亟需具有不同拷贝数、亲和型、稳定复制以及不易丢失的穿梭质粒，用于在大肠杆菌中扩增和表达基因，并应用在黄单胞菌中进行基因功能互补等方面的研究。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种基于黄单胞菌的穿梭质粒及其应用，能够便于应用于基因的扩增及表达。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于黄单胞菌的穿梭质粒，该穿梭质粒的全碱基序列如序列表中的序列1，该穿梭质粒分别具有在黄单胞菌和大肠杆菌中的复制起始区，并具有抗性筛选标记和多克隆位点。
优选地，该穿梭质粒在黄单胞菌中的复制起始区如序列表2，该穿梭质粒在大肠杆菌中的复制起始区如序列表3。
优选地，该穿梭质粒具有的抗性筛选标记为庆大霉素抗性筛选标记，具有庆大霉素抗性筛选标记的基因如序列表6。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种如前所述的穿梭质粒的应用，包括该穿梭质粒在黄单胞菌胞外多糖相关基因功能鉴定中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于黄单胞菌的穿梭质粒的构建方法，包括：
从水稻条斑病菌gx01菌株中提取内生质粒pxocgx01；
将r6kγori/kan-2(ez-tn5)序列插入所述内生质粒pxocgx01，获得能够复制在大肠杆菌ec100dpir+中并具有卡那霉素抗性的质粒系列pxtr-pt1～pxtr-pt4；
分别将所述质粒系列pxtr-pt1～pxtr-pt4导入野油菜黄单胞菌8004菌株中，进行dna剪切、重组，并从pxtr-pt4的转化子中获得穿梭质粒中间体pxtr14k；
对所述中间体pxtr14k进行定点修饰，添加多克隆位点、切除部分冗余序列、替换抗性筛选标记，最终获得可用的具有庆大霉素抗性筛选标记的穿梭质粒pxug。
依照本发明的方法构建获得的穿梭质粒pxug、pxuk具有拷贝数清楚、亲和性好、稳定复制且不易丢失的特点，为黄单胞菌穿梭质粒的制备及应用提供了新的途径，也为黄单胞菌基因功能的研究提供了有力的载体工具。
附图说明
图1为水稻条斑病菌gx01菌株内生质粒pxocgx01的酶切验证电泳图；
图2为本发明提取的pxtr-pt1～pxtr-pt4系列质粒的bamhi酶切电泳图；
图3为本发明将pxtr-pt1～pxtr-pt4系列质粒进行dna重组获取的穿梭质粒中间体pxtr14k的图谱；
图4为本发明将穿梭质粒中间体pxtr14k与质粒puc19-2连接得到重组质粒pguc2的图谱；
图5为本发明最终获取的具有庆大霉素抗性筛选标记的穿梭质粒pxug的图谱；
图6为本发明最终获取的具有卡那霉素抗性筛选标记的穿梭质粒pxuk的图谱；
图7为本发明获取的穿梭质粒pxug表达胞外多糖相关基因功能互补结果图；
图8为本发明获取的穿梭质粒pxuk表达胞外蛋白酶相关基因功能互补结果图。
具体实施方式
以下结合附图和优选实施例对本发明的技术方案进行详细地阐述。应该理解，以下列举的实施例仅用于说明和解释本发明，而不构成对本发明技术方案的限制。
本发明提供的穿梭质粒的碱基序列如序列表中的序列1，该穿梭质粒具有分别在黄单胞菌和大肠杆菌中复制的复制起始区，并具有抗性筛选标记和多克隆位点。
该穿梭质粒在黄单胞菌中的复制起始区如序列表2，该穿梭质粒在大肠杆菌中的复制起始区如序列表3。
穿梭质粒具有庆大霉素抗性筛选标记的基因如序列表6，穿梭质粒具有卡那霉素抗性筛选标记的基因如序列表7。
本发明提供的穿梭质粒获取的方法如下：
1)从水稻条斑病菌gx01菌株中提取内生质粒pxocgx01；
2)将r6kγori/kan-2(ez-tn5)序列插入pxocgx01，获得能够复制在大肠杆菌ec100dpir+中并具有卡那霉素抗性的质粒系列pxtr-pt1～pt4；
3)分别将质粒系列pxtr-pt1～pt4导入野油菜黄单胞菌8004菌株中，进行dna剪切、重组，从pxtr-pt4的转化子中获得穿梭质粒中间体pxtr14k；
4)对中间体pxtr14k进行定点修饰，添加多克隆位点、切除部分冗余序列、替换抗性筛选标记，最终获得可用的穿梭质粒pxug、pxuk。
本发明获取的穿梭质粒载体pxug、pxuk在黄单胞菌基因功能鉴定中的应用。
在本发明如下的实施例中所用到的材料包括：
原始质粒pxocgx01序列公布在美国国立生物技术信息中心genbank数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)，序列号为：kr071788.1。
大肠杆菌(escherichiacoli)株系ec100dpir+和ez-tn5tm＜r6kγori/kan-2＞试剂盒，购自epicentrebiotechnologies；
水稻条斑病菌gx01菌株和野油菜黄单胞菌8004菌株，为广西大学生命科学与技术学院植物病原细菌功能基因组学实验室保存；
限制性内切酶、修饰酶等试剂，购自promega、takara、qiagen公司；
抗生素利福平、卡那霉素和培养基原料：蛋白胨、酵母提取粉及甘油，购于上海生物工程公司。
常规实验方法参见分子克隆实验指南(第三版，j.萨姆布鲁克等著)。
实施例1从水稻条斑病菌gx01菌株中提取内生质粒pxocgx01
采用常规的质粒提取法从水稻条斑病菌gx01菌株中提取内生质粒pxocgx01，该质粒已经完成全质粒测序(发表论文作参考)，酶切验证电泳图见图1，与电子酶切吻合，确认该质粒是提取的内生质粒pxocgx01。
在图1中：
a为直接从xocgx01中提取的染色体外dna酶切后电泳图，即泳道1；
b为通过vectornti软件模拟的测序拼接序列的电子酶切图，即泳道2；
m是指dnamarker(tiangen，1kbdnaladder)。
pxocgx01质粒全长53,206bp，通过比较高通量测序的覆盖深度结果表明，pxocgx01质粒在xocgx01菌株细胞中的正常拷贝数是4个。实验证明，pxocgx01质粒不能在大肠杆菌中复制。
实施例2在大肠杆菌中插入pxocgx01质粒，提取pxtr系列质粒
为了构建穿梭质粒，本发明使用ez-tn5tm＜r6kγori/kan-2＞insertionkit体外tn5随机插入的方法，将r6kγori/kan-2片段插入pxocgx01质粒，并导入大肠杆菌ec100dpir+复制起始位点中，利用插入片段上特有的复制起点实现pxocgx01质粒在大肠杆菌中复制。
本发明共获得了4个不同插入位点的质粒，用bamhi酶切并进行电泳检测，结果显示，这4个质粒酶切带谱大致一致，但有个别条带不同，应该是tn5插入位置不同所致。采用“克隆拯救”的方式进行插入位点的定位，测序结果显示，pxocgx01：：tn5-1，tn5-2，tn5-3，tn5-4号克隆，插入在质粒的不同位置。这些质粒均具有了分别在大肠杆菌和黄单胞菌中复制的能力，被命名为pxtr系列质粒。如图2所示，p指从gx01菌株中直接提取的内生质粒pxocgx01；pt1～pt4指从大肠杆菌中提取的插入了tn5的4个质粒，即pxtr-pt1～pxtr-pt4系列质粒。本步骤质粒用bamhi酶切，0.8％琼脂糖凝胶，90v电压，电泳2h。
实施例3将pxtr-pt1～pxtr-pt4系列质粒进行dna重组，获取穿梭质粒中间体pxtr14k
通过电穿孔转化的方式将pxtr-pt1～pxtr-pt4系列质粒导入到不含任何质粒的野油菜黄单胞菌8004菌株中，获得了1个克隆子，是pxocgx01：：tn5-4质粒导入后所得的克隆子。酶切条带比较分析时发现，产生的新质粒明显变小了。经过测序分析发现剩下的部分总长14,016bp，其中ez-tn5tm转座子的序列有2,001bp。剩余的质粒片段包括一段pxocgx01质粒特异的序列，编码特定的假定蛋白和保守假定蛋白。以及一段包含预测的oriv等与复制有关的区段，这个克隆命名为xcc8004/pxoc：：tn14k，从pxtr-pt4的转化子中获得的穿梭质粒中间体命名为pxtr14k；将其在大肠杆菌和黄单胞菌中进行复制。如图3所示为重组获取的穿梭质粒中间体pxtr14k的质粒图谱。
实施例4在穿梭质粒中间体pxtr14k上添加多克隆位点和其它修饰，获取重组质粒pguc2
首先通过smai酶切去除pxtr14k中4938～10529之间的片段(5,592bp，smai酶切位点4,937、8,531、10,529)，酶切后胶回收所需大小的片段pxtr14k-smai(8,424bp)，pxtr14k质粒上的酶切位点分布如图3所示。如图4所示，从质粒puc19上利用pcr方法扩增除567～853之外的区域，543～867是puc19质粒上各开放阅读框(orf，openreadframe)之间间隔区域最长的部分，记为puc19-2(2401bp)。利用t4连接酶将pxtr14k-smai与puc19-2连接，得到重组质粒pguc2(10,825bp)。实验验证，pguc2带有氨苄青霉素抗性筛选标记、来源于puc19的多克隆位点(mcs，multiplecloningsite)。
扩增puc19上所需序列的引物为：
fp1：5-gcgttgctggcgtttttccataggctc
rp1：5-gctcactcattaggcaccccaggcttt
实施例5在重组梭质粒pguc2上替换抗性筛选标记，得到最终穿梭质粒pxuk、pxug
考虑到黄单胞菌自身含有blai基因，可能表达氨苄青霉素抗性，故将穿梭质粒的筛选抗性由氨苄青霉素抗性改为卡那霉素抗性或庆大霉素抗性。具体操作为：在pguc2的多克隆位点以外选择一个单酶切位点scai(6,264处)，用相应限制性内切酶切开后形成具有平末端开口的线性片段。再以质粒pbbr为模板扩增庆大霉素抗性片段，并将具有该抗性片段与已成为线性片段的pguc2连接，得到具有庆大霉素抗性筛选标记(gmr)的穿梭质粒pxug，其图谱如图5所示；或者以质粒pk18mob为模板扩增卡那霉素抗性片段，并将具有该抗性片段与已成为线性片段的pguc2连接，得到具有卡那霉素抗性筛选标记(kanr)的穿梭质粒pxuk，其图谱如图6所示。
本发明提供的穿梭质粒的全碱基序列如序列表中序列1，其特定的假定蛋白(推测的蛋白)的基因如序列表中序列4，其特定的保守假定蛋白(也是一类推测的蛋白)的基因如序列表中序列5。这说明，本发明的穿梭质粒的基因序列非常新，目前还没有发现同源蛋白。穿梭质粒具有庆大霉素抗性筛选标记的基因如序列表中序列6，穿梭质粒具有卡那霉素抗性筛选标记的基因如序列表中序列7。
扩增庆大霉素抗性片段所用引物为：
fp2：5-cgaattgacataagcctgttcgg
rp2：5-cggcgttgtgacaatttaccga
扩增卡那霉素抗性片段所用引物为：
fp3：5-ttcgcatgattgaacaagatggattgc
rp3：5-cccgctcagaagaactcg
实施例6穿梭质粒载体pxug在黄单胞菌胞外多糖相关基因功能鉴定中的应用
将vemr(2367)基因(连同启动子)连入本发明构建成的穿梭质粒载体pxug中构成重组质粒pxug-2367，再导入该基因的缺失突变体dm2367，如图7所示，通过pcr法可扩增出目的条带，表明重组质粒pxug-2367成功导入，获得互补菌株dm2367/pxug-2367。同时将空载质粒pxug导入dm2367中作为空白对照dm2367/pxug。将野生型xocgx01、缺失突变体dm2367、互补菌株dm2367/pxug-2367、空白对照dm2367/pxug同时点板，可观察到空白对照与缺失突变体几乎不分泌胞外多糖，菌落大小基本一致，而互补菌株与野生型均可分泌大量胞外多糖且分泌量基本一致。图6中正面、背面表示分别从平板的正反面观察菌落大小，比较胞外多糖的量。
可以认为，本发明构建的穿梭质粒载体pxug可携带外源基因在大肠杆菌中扩增导进入黄单胞菌后能正常表达，且该质粒载体pxug本身对黄单胞菌的胞外多糖生物合成无影响。
实施例7穿梭质粒载体pxuk实现胞外蛋白酶相关基因功能互补的应用
将clp(4202)基因(连同启动子)连入本发明构建的质粒载体pxuk中构成重组质粒pxuk-4202再导入该基因的缺失突变体dm4202。如图7所示，通过pcr法可扩增出目的条带，表明重组质粒pxuk-4202成功导入，获得互补菌株dm4202/pxuk-4202。同时将空载质粒pxuk导入dm4202中作为空白对照dm4202/pxuk。将野生型xocgx01、缺失突变体dm4202、互补菌株dm4202/pxuk-4202、空白对照dm4202/pxuk同时点板，以菌落周围的透明圈大小为依据判断胞外蛋白酶的分泌。结果发现，空白对照与缺失突变体只分泌极少量胞外蛋白酶，菌落周围透明圈较小且大小基本一致，而互补菌株与野生型均可分泌较多胞外蛋白酶，菌落周围降解圈较大且大小基本一致。图8中背面、正面表示分别从平板的正反面观察菌落大小，比较胞外酶多少。
可以认为，构建完成的穿梭质粒载体可携带外源基因在大肠杆菌中扩增导进入黄单胞菌后能正常表达，且质粒载体本身对黄单胞菌的胞外蛋白酶分泌无影响。