一种快速检测埃博拉病毒的荧光恒温检测试剂盒的制作方法

本发明属生物技术领域，涉及一种核酸恒温扩增技术，尤其涉及一种不依赖于高能能量分子的用于检测埃博拉病毒的荧光恒温扩增技术及试剂盒。

背景技术：

埃博拉（ebolavirus）又译作伊波拉病毒，是一种能引起人类和灵长类动物产生埃博拉出血热的烈性传染病病毒，其引起的埃博拉出血热（ebhf）是当今世界上最致命的病毒性出血热，有很高的死亡率，在50%至90%之间，病毒潜伏期可达2至21天，但通常只有5天至10天。感染者症状包括恶心、呕吐、腹泻、肤色改变、全身酸痛、体内出血、体外出血、发烧等。

埃博拉病毒（ebov）属丝状病毒科，长度为970nm，呈长丝状体，单股负链rna病毒，有18959个碱基，分子量为4.17×10⁶。外有包膜，病毒颗粒直径大约80nm，大小100nm×（300～1500）nm，感染能力较强的病毒一般长（665～805）nm左右，有分支形、u形、6形或环形，分支形较常见。目前已鉴定的埃博拉病毒分为五种不同的亚型：埃博拉-扎伊尔型(ebola-zaire，ebov-z)、埃博拉-苏丹型(ebola-sudan，ebov-s)、埃博拉-本迪布焦型(ebola-bundibugyo，ebov-b)、埃博拉-莱斯顿型(ebolareston，ebov-r)和埃博拉-科特迪瓦型(ebolacoast，ebov-c)。其中扎伊尔埃博拉病毒和苏丹埃博拉病毒对人类和非人类灵长类动物的致病性和致死率很高；扎伊尔埃博拉病毒可高达90％的致死率。因此，荧光恒温检测埃博拉病毒方法的建立具有重大意义。

目前由于埃博拉治疗的特效药物以及相关的预防疫苗还没有上市。所以荧光恒温检测埃博拉具有预防和治疗的积极意义。埃博拉病毒病病人样本具有极端生物危害风险；只有在最高级别的生物防护条件下才可进行检测。常用的诊断方法有：elisa法和rt-pcr法。elisa法是一种将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术，其特异性强，因为抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间，而两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高度的特异性。但其干扰因素较多（如温度、时间），重复性不好；且容易受到自身抗体、嗜异性抗体等干扰，易出现假阳性。rt-pcr法为最经典的检测方法：是聚合酶链式反应（pcr）的一种广泛应用的变形，在rt-pcr中，一条rna链被逆转录成为互补dna，再以此为模板通过pcr进行dna扩增。但缺点在于操作时间长，所需仪器设备昂贵，需要配备专业技术人员在专业的实验室中进行检测，操作复杂，耗时长，无法做到现场即时检测，不适合临床样本的大批量处理及检测。

技术实现要素：

针对现行技术重复性差、容易出现假阳性、耗时长、操作复杂、仪器设备昂贵等问题，本发明提供了一种不依赖于atp、磷酸肌酸等高能能量分子，仅需在恒温条件下即可进行核酸的扩增的试剂盒。

本发明所采取的技术方案是：一种快速检测埃博拉病毒的荧光恒温检测试剂盒，包括rna提取液，反应液，启动液，反应酶系，埃博拉病毒的特异性引物及探针，内标18srna的特异性引物及探针，阴阳性质控品，其特征在于：所述的特异性引物及探针序列如下：

检测扎伊尔埃博拉病毒的上游引物的序列为：ggtgagcatgccacagttag

agggagtagctt（seqidno：1）；下游引物的序列为：catagcaacggtta

caatattctataaaaggt（seqidno：2）；荧光探针序列为：fam-taac

(dspacer)gatttagagaaatacaatcttgcattta-bhq（seqidno：3）；

检测苏丹埃博拉病毒的上游引物序列为：ctctatgacaggctggcttcaactg

taatttac（seqidno：4）；下游引物的序列为：agtttactgcctctcga

atggggggtgactgaa（seqidno：5）；荧光探针序列为：fam-ctga

(dspacer)ggggtaattgcattcttgatattggct-bhq（seqidno：6）；

检测本迪布焦埃博拉病毒的上游引物的序列为：acaggcaagattccgattac

cgatatcttcaa（seqidno：7）；下游引物的序列为：ggtctggacact

gcgtgtttgaacacttgg（seqidno：8）；荧光探针序列为：fam-gaaa

(dspacer)ttgaaaccttacctagtataagtccct-bhq（seqidno：9）；

检测莱斯顿埃博拉病毒的上游引物的序列为：tttcttgatttgaacatagtca

taaggggataaat（seqidno：10）；下游引物的序列为：gatcacatttt

caatgggcgaagcattttaagca（seqidno：11）；荧光探针序列为：fa

m-tact(dspacer)tatatttctgattgtggattgacccat-bhq（seqidno：12）；

检测科特迪瓦埃博拉病毒的上游引物的序列为：aaccctttcaagtgaagagt

tgtctttcgtacc（seqidno：13）；下游引物的序列为：ggttgtgggcg

gagatgggaggagagaccgtcg（seqidno：14）；荧光探针序列为：fam

-ccag(dspacer)aacccagaaccaggtccttgacacga-bhq（seqidno：15）；

检测内标18srna的上游引物的序列为：gtctggttaattccgataacgaa

cgagactct（seqidno：16）；下游引物的序列为：gcatcacagacctg

ttattgctcaatctcgg（seqidno：17）；荧光探针序列为：vic-catg(

dspacer)taactagttacgcgacccccgagcggtc-bhq（seqidno：18）。

一种快速检测埃博拉病毒的荧光恒温检测试剂盒，其rna提取液的组分包括：

德国qiagenrna提取试剂盒(qia-14162)

一种快速检测埃博拉病毒的荧光恒温检测试剂盒，其反应液的组分包括：

tris-缓冲液35~65mm

kcl45~75mm

(nh4)2so45~25mm

tritonx-1000.06%~0.8%

dtt8~18mm

peg3%~6%

bsa0.06~0.8mg/ml

优选的，tris-缓冲液可选自tris-h2so4、tris-乙酸、tris-hcl中的任意一种或多种，tris-缓冲液的ph为7.0～9.0。

一种快速检测埃博拉病毒的荧光恒温检测试剂盒，其启动液的组分包括：

mg²⁺5mm~20mm

优选的，mg²⁺来自于硫酸镁、乙酸镁、氯化镁中的任意一种或多种。

一种快速检测埃博拉病毒的荧光恒温检测试剂盒，其反应酶系的组分包括：

dntps150~350um

聚合酶bsu50~200ng/ul

单链结合蛋白200~400ng/ul

重组酶（e.colirect）300~500ng/ul

逆转录酶0.2~1u/ul

聚合酶、单链结合蛋白、重组酶和逆转录酶的用量可以根据需要调整其添加量，或通过预实验确定其用量。

优选的，一种快速检测埃博拉病毒的荧光恒温检测试剂盒，其反应液的具体组分如下：

tris-hcl（ph=8.2）50mm

kcl60mm

(nh4)2so410mm

tritonx-1000.1%

dtt10mm

peg5%

bsa0.1mg/ml

优选的，一种快速检测埃博拉病毒的荧光恒温检测试剂盒，其启动液的具体组分如下：

氯化镁15mm

优选的，一种快速检测埃博拉病毒的荧光恒温检测试剂盒，其反应酶系的具体组分如下：

dntps200um

聚合酶bsu100ng/ul

单链结合蛋白262ng/ul

重组酶（e.colirect）360ng/ul

逆转录酶0.5u/ul

一种快速检测埃博拉病毒的荧光恒温检测试剂盒，所采用的特异性引物及探针序列如下：

检测扎伊尔埃博拉病毒的上游引物的序列为：ggtgagcatgccacagttag

agggagtagctt（seqidno：1）；下游引物的序列为：catagcaacggtta

caatattctataaaaggt（seqidno：2）；荧光探针序列为：fam-taac

(dspacer)gatttagagaaatacaatcttgcattta-bhq（seqidno：3）；

检测苏丹埃博拉病毒的上游引物序列为：ctctatgacaggctggcttcaactg

taatttac（seqidno：4）；下游引物的序列为：agtttactgcctctcga

atggggggtgactgaa（seqidno：5）；荧光探针序列为：fam-ctga

(dspacer)ggggtaattgcattcttgatattggct-bhq（seqidno：6）；

检测本迪布焦埃博拉病毒的上游引物的序列为：acaggcaagattccgattac

cgatatcttcaa（seqidno：7）；下游引物的序列为：ggtctggacact

gcgtgtttgaacacttgg（seqidno：8）；荧光探针序列为：fam-gaaa

(dspacer)ttgaaaccttacctagtataagtccct-bhq（seqidno：9）；

检测莱斯顿埃博拉病毒的上游引物的序列为：tttcttgatttgaacatagtca

taaggggataaat（seqidno：10）；下游引物的序列为：gatcacatttt

caatgggcgaagcattttaagca（seqidno：11）；荧光探针序列为：fa

m-tact(dspacer)tatatttctgattgtggattgacccat-bhq（seqidno：12）；

检测科特迪瓦埃博拉病毒的上游引物的序列为：aaccctttcaagtgaagagt

tgtctttcgtacc（seqidno：13）；下游引物的序列为：ggttgtgggcg

gagatgggaggagagaccgtcg（seqidno：14）；荧光探针序列为：fam

-ccag(dspacer)aacccagaaccaggtccttgacacga-bhq（seqidno：15）；

检测内标18srna的上游引物的序列为：gtctggttaattccgataacgaa

cgagactct（seqidno：16）；下游引物的序列为：gcatcacagacctg

ttattgctcaatctcgg（seqidno：17）；荧光探针序列为：vic-catg(

dspacer)taactagttacgcgacccccgagcggtc-bhq（seqidno：18）。

一种快速检测埃博拉病毒的荧光恒温检测试剂盒，其阴阳性质控品组分如下：

品名成分

阳性质控品含有内标片段、五种不同型别的埃博拉病毒的假病毒溶液

阴性质控品depc水。

优选的，一种快速检测埃博拉病毒的荧光恒温检测试剂盒，其rna提取液的组分包括：德国qiagenrna提取试剂盒(qia-14162)。

优选的，一种快速检测埃博拉病毒的荧光恒温检测试剂盒，其埃博拉病毒探针连接的荧光基团不同于内标18srna探针连接的荧光基团。

优选的，一种快速检测埃博拉病毒的荧光恒温检测试剂盒所采用的重组酶选自e.colirect蛋白；λ噬菌体β蛋白；啤酒酵母sepι/stpβ；啤酒酵母dpa蛋白；啤酒酵母stpα蛋白；粟酒裂殖酵母p140/exoǁ蛋白以及rrpι、hpp-ι、v-sep、icp8蛋白。

优选的，一种快速检测埃博拉病毒的荧光恒温检测试剂盒所采用的重组酶为不依赖于能量分子的重组酶。

优选的，恒温扩增的温度为35～42℃。优选扩增温度为37℃。

本发明的有益效果：

①本发明采取的扩增方式是恒温扩增方式，相对于传统的检测方法具有快速、高效、特异等优点。

②本发明的恒温扩增体系，不依赖于atp、磷酸肌酸等高能能量分子，相对现有的恒温扩增体系，其组成更为简单，成本更为低廉，使用更为方便。

③本发明的恒温扩增体系可以对埃博拉病毒核酸序列实现扩增，扩增速度快且稳定，可以在30min以内完成扩增反应，扩增的灵敏度和准确度高，不易出现错配，扩增效果好。

④本发明的恒温扩增体系使用荧光实时定量技术，应用范围更广，适用于市面上大多数荧光定量扩增仪（如abi7500、abi7300、lc480）。

⑤本发明将荧光恒温扩增技术应用到埃博拉病毒的检测上，同时检测五种不同型别的埃博拉病毒，缩短了反应时间，降低了体系对反应条件的要求，大大地提高了检测的效率，也不需要人为主观判读结果，同时检测结果不受混合感染的干扰，因此能更准确的提示混合感染的类型，非常有利于临床的快速诊断和对症治疗。

附图说明

图1为实施例1的荧光结果图；

图2为实施例2的荧光结果图；

图3为实施例3的荧光结果图；

图4为实施例4的荧光结果图。

具体实施方式

一种快速检测埃博拉病毒的荧光恒温检测试剂盒，采用了一种不依赖于高能能量分子的恒温扩增技术。试剂盒成分包括rna提取液，反应液，启动液，反应酶系，埃博拉病毒特异性引物及探针内标18srna的特异性引物及探针，各成分的具体组分如下：

一种快速检测埃博拉病毒的荧光恒温检测试剂盒rna提取液的具体组分如下：

德国qiagenrna提取试剂盒(qia-14162)

一种快速检测埃博拉病毒的荧光恒温检测试剂盒反应液的具体组分如下：

tris-hcl（ph=8.2）50mm

kcl60mm

(nh4)2so410mm

tritonx-1000.1%

dtt10mm

peg5%

bsa0.1mg/ml

一种快速检测埃博拉病毒的荧光恒温检测试剂盒启动液的具体组分如下：

氯化镁15mm

一种快速检测埃博拉病毒的荧光恒温检测试剂盒反应酶系的具体组分如下：

dntps200um

聚合酶bsu100ng/ul

单链结合蛋白262ng/ul

重组酶（e.colirect）360ng/ul

逆转录酶0.5u/ul

作为上述反应试剂的进一步改进，所使用的tris-hcl的ph为8.2。

聚合酶为恒温扩增反应中常用的聚合酶，优选为bsu或klenow。重组酶选自e.colirect蛋白；λ噬菌体β蛋白；啤酒酵母sepι/stpβ；啤酒酵母dpa蛋白；啤酒酵母stpα蛋白；粟酒裂殖酵母p¹⁴⁰/exoǁ蛋白以及rrpι、hpp-ι、v-sep、icp8蛋白。

作为上述方法的进一步改进，恒温扩增的温度为37℃。

一种快速检测埃博拉病毒的荧光恒温检测试剂盒，所采用的特异性引物及探针序列如下：

检测扎伊尔埃博拉病毒的上游引物的序列为：ggtgagcatgccacagttag

agggagtagctt（seqidno：1）；下游引物的序列为：catagcaacggtta

caatattctataaaaggt（seqidno：2）；荧光探针序列为：fam-taac

(dspacer)gatttagagaaatacaatcttgcattta-bhq（seqidno：3）；

检测苏丹埃博拉病毒的上游引物序列为：ctctatgacaggctggcttcaactg

taatttac（seqidno：4）；下游引物的序列为：agtttactgcctctcga

atggggggtgactgaa（seqidno：5）；荧光探针序列为：fam-ctga

(dspacer)ggggtaattgcattcttgatattggct-bhq（seqidno：6）；

检测本迪布焦埃博拉病毒的上游引物的序列为：acaggcaagattccgattac

cgatatcttcaa（seqidno：7）；下游引物的序列为：ggtctggacact

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检测莱斯顿埃博拉病毒的上游引物的序列为：tttcttgatttgaacatagtca

taaggggataaat（seqidno：10）；下游引物的序列为：gatcacatttt

caatgggcgaagcattttaagca（seqidno：11）；荧光探针序列为：fa

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检测科特迪瓦埃博拉病毒的上游引物的序列为：aaccctttcaagtgaagagt

tgtctttcgtacc（seqidno：13）；下游引物的序列为：ggttgtgggcg

gagatgggaggagagaccgtcg（seqidno：14）；荧光探针序列为：fam

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检测内标18srna的上游引物的序列为：gtctggttaattccgataacgaa

cgagactct（seqidno：16）；下游引物的序列为：gcatcacagacctg

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一种快速检测埃博拉病毒的荧光恒温检测试剂盒，其阴阳性质控品的组分如下：

品名成分

阳性质控品含有内标片段、五种不同型别的埃博拉病毒的假病毒溶液

阴性质控品depc水。

下面结合具体的实验，进一步说明一种快速检测埃博拉病毒的荧光恒温检测试剂盒的优势，但并非限制本发明。

实验样本来源：

以感染埃博拉病毒患者的血浆经提取得到的核酸溶液作为样本；

以埃博拉-扎伊尔型(ebola-zaire，ebov-z)、埃博拉-苏丹型(ebola-sudan，ebov-s)、埃博拉-本迪布焦型(ebola-bundibugyo，ebov-b)、埃博拉-莱斯顿型(ebolareston，ebov-r)和埃博拉-科特迪瓦型(ebolacoast，ebov-c)作为特异性实验的样本；

以含有内标片段五种不同型别的埃博拉病毒的假病毒溶液作为阳性质控品；

以depc水作为阴性质控品。

实施例1（埃博拉病毒的检测）：

取15个200ul反应管，分别标记为反应管1~15。在反应管1~15中分别加入20ul反应液、5ul反应酶系；在反应管1~3中加入上游引物1（200nm）、下游引物1（200nm）、荧光探针1（150nm）、上游引物6（200nm）、下游引物6（200nm）、荧光探针6（150nm）；在反应管4~6中加入上游引物2（200nm）、下游引物2（200nm）、荧光探针2（150nm）、上游引物6（200nm）、下游引物6（200nm）、荧光探针6（150nm）；在反应管7~9中加入上游引物3（200nm）、下游引物3（200nm）、荧光探针3（150nm）、上游引物6（200nm）、下游引物6（200nm）、荧光探针6（150nm）；在反应管10~12中加入上游引物4（200nm）、下游引物4（200nm）、荧光探针4（150nm）、上游引物6（200nm）、下游引物6（200nm）、荧光探针6（150nm）；在反应管13~15中加入上游引物5（200nm）、下游引物5（200nm）、荧光探针5（150nm）、上游引物6（200nm）、下游引物6（200nm）、荧光探针6（150nm）。在反应管1、4、7、10、13中加入埃博拉病毒核酸2ul；在反应管2、5、8、11、14都分别加入阴性质控品2ul；在反应管3、6、9、12、15都分别加入阴性质控品2ul。各反应管均用灭菌水补足体系到45ul，振荡混匀后各管再分别加入5ul启动液（各管的终体积为50ul）。

选择荧光定量pcr仪进行扩增及收集荧光，具体上机条件为：37℃，30s，30个循环，每个循环都搜集荧光。结果如图1。

实施例2（非最优扩增温度条件的检测）：

同实施例1，不同处在于上机条件改为：35℃，30s，30个循环，每个循环都收集荧光。结果如图2。

实施例3（非最优扩增温度条件的检测）：

同实施例1，不同处在于上机条件改为：42℃，30s，30个循环，每个循环都收集荧光。结果如图3。

实施例4（特异性实验）：

取15个200ul反应管，分别标记为反应管1~15。在反应管1~15中分别加入20ul反应液、5ul反应酶系；在反应管1~3中加入上游引物1（200nm）、下游引物1（200nm）、荧光探针1（150nm）、上游引物6（200nm）、下游引物6（200nm）、荧光探针6（150nm）；在反应管4~6中加入上游引物2（200nm）、下游引物2（200nm）、荧光探针2（150nm）、上游引物6（200nm）、下游引物6（200nm）、荧光探针6（150nm）；在反应管7~9中加入上游引物3（200nm）、下游引物3（200nm）、荧光探针3（150nm）、上游引物6（200nm）、下游引物6（200nm）、荧光探针6（150nm）；在反应管10~12中加入上游引物4（200nm）、下游引物4（200nm）、荧光探针4（150nm）、上游引物6（200nm）、下游引物6（200nm）、荧光探针6（150nm）；在反应管13~15中加入上游引物5（200nm）、下游引物5（200nm）、荧光探针5（150nm）、上游引物6（200nm）、下游引物6（200nm）、荧光探针6（150nm）。在反应管1中加入埃博拉-扎伊尔型核酸2ul；在反应管4中加入埃博拉-苏丹型核酸2ul；在反应管7中加入埃博拉-本迪布焦型核酸2ul；在反应管10中加入埃博拉-莱斯顿型核酸2ul；在反应管13中加入埃博拉-科特迪瓦型核酸2ul；在反应管2、5、8、11、14都分别加入阴性质控品2ul；在反应管3、6、9、12、15都分别加入阴性质控品2ul。各反应管均用灭菌水补足体系到45ul，振荡混匀后各管再分别加入5ul启动液（各管的终体积为50ul）。

选择荧光定量pcr仪进行扩增及收集荧光，具体上机条件为：37℃，30s，30个循环，每个循环都搜集荧光。结果如图4。

结论：

1.从图1的结果可以看出，对应的病原体样本扩增结果都有“s”型扩增曲线，说明本发明试剂盒的恒温扩增效果好。

2.从图2、3的结果可以看出，即使不是在最适温度下进行扩增反应，仍然得到稳定的阳性结果，说明本发明试剂盒的容错率高、稳定性强。

3.从图4的结果可以看出，用本发明试剂盒检测埃博拉病毒核酸特异性好，具有很强的专一性，检测结果无误，说明本试剂盒的特异性好、稳定性强。

综上，本发明试剂盒的扩增效果好，特异性强，容错率高，稳定性强，灵敏度高。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效试剂变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

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<110>广州和实生物技术有限公司

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