本发明涉及生物
技术领域：
，尤其涉及一种绿色木霉生产纤维素酶的方法及所产纤维素酶的应用。
背景技术：
：近年来，全球能源需求日益增加、石油煤炭的储备量日益减少、环境破坏日益严重，人类急需可再生能源，而木质纤维素来源是地球上最丰富、最低廉的可再生能源。在地球上，每年依靠光合作用产生近2000亿吨的植物生物量中植物纤维素占绝大多数，但其中89％还没有被人们开发利用，用在农肥、纺织、建筑、造纸、燃料等方面的只有一小部分，大部分没有被利用而被废弃燃烧，不仅造成资源的巨大浪费还污染了环境。目前木质纤维素的利用率极低，只有加快木质纤维素的综合开发利用，才能使世界各国的能源和环境问题在很大程度上得到缓解。由此可见，纤维素是一种很有研究价值的资源，在以后纤维素的综合开发利用是各国科学家研究的重点以及发展趋势。纤维素(cellulose)：是植物细胞壁中最重要的成分之一，由d-吡喃葡萄糖基以β-1，4糖苷键连接而成的线性高分子聚合物，其化学式可表示为cm(h2o)n。组成纤维素的葡萄糖溶解度很高，但纤维素分子性质很稳定，溶解度很小。通过对微纤丝晶体结构的研究发现：原纤维由规范而有序的结晶区和疏松、相对不规则的非定形区组成，其结晶度一般在30％-80％之间。结晶区所在的区域是纤维素β-1，4-d-葡聚糖区域；非结晶区则是木糖或甘露糖存在的区域，也就是说纤维素是一个二相体系——结晶区与非结晶区交错连接形成。结晶区具有高度的稳定性，结构非常牢固，很难与反应试剂(酸、碱或纤维素酶)接触，是木质纤维素发酵产乙醇存在的共性技术难题。为了提高纤维素更高的利用率，破坏纤维素的结晶结构是研究内容的重中之重。在一般的植物细胞壁中，纤维束是纤维素的存在形式，果胶质粘合在不同细胞的细胞壁之间，这使得细胞壁的纤维素降解难度增大。纤维素酶以不同作用主要分为三类：(1)葡聚糖内切酶(ec3.2.1.4，endo-1,4-β-d-glucanase，eg)：也称为cmcases，可以任意水解β-1，4糖苷键的连接，也可以结合于纤维素链内部的非结晶区域里。切断纤维素链可产生非还原端的小分子纤维素，但这种小分子纤维素遇到结晶区的纤维素则不起作用；(2)葡聚糖外切酶(ec3.2.1.91，exo-1,4-β-d-glucanase，cbh)：或称微晶纤维素酶或c1分子，在天然纤维素的降解过程中葡聚糖外切酶起着很重要的作用，同时它也是纤维素酶系中的重要组分，葡聚糖外切酶使得纤维素链的末端水解β-1，4糖苷键，生成纤维二糖和纤维寡糖；(3)β-葡萄糖苷酶(ec3.2.1.21，β-1,4-glucosidase，bg)：β-葡萄糖苷酶将可溶性的纤维寡糖或纤维二糖水解成葡萄糖，也称纤维二糖酶，纤维二糖对外切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶具有很高的抑制作用，而β-葡萄糖苷酶可以消除这种反馈抑制作用，提高了纤维素酶的降解效率，这点在纤维素的降解过程中有着很重要的地位。纤维素酶在蜗牛的消化道中被科学家发现以后，纤维素在微生物降解的问题上就受到世界科学家们较大的关注。美军的natick实验室随后就已经研究了有关微生物降解在军用纤维素材料方面的防护问题，在后来研究中发现纤维素除了能够被微生物降解以外，生产出来的生产原料也十分丰富经济，自然界中不断产生的固体废物问题也有望能够得到解决。在此以后，纤维素酶得到了更为广泛的关注。纤维素酶在食品加工、化工生产、医药保健、酿造行业、饲料生产、农副产品深加工、环境保护等领域有着非常广阔的应用前景和十分深厚的潜力。纤维素酶在分解纤维素时起生物催化作用，可以将纤维素分解成寡糖或单糖的蛋白质。然而，纤维素酶存在产生菌的产酶能力低，而且所产生的酶的组分不完整或不平衡等问题，纤维素酶作用的机制至今尚未被研究得完全清楚的重要原因，也是实际的应用和研究存在距离较大的最为主要的原因。在腐烂的种子、木材以及植物的残体中可以筛选出绿色木霉。绿色木霉能产生木聚糖酶、纤维素酶和几丁质酶等多种具有生物活性的酶系。在自然界中，它通常能产生很高的纤维素酶活性，该纤维素酶有着显著的降解作用，绿色木霉属于拮抗微生物，可有效防治土传性病害。绿色木霉具有菌体生长较快，分泌的纤维素酶稳定性较好、周期短的优点，同时所产的纤维素酶是胞外酶，易于分离纯化，而且该酶及其代谢产物安全稳定不会对人和环境造成影响。这些优点使得绿色木霉成为发酵产纤维素酶常用的菌种之一。然而现有技术中，绿色木霉产纤维素酶还存在工艺步骤繁琐、产量较低、成本较高等缺点，制约了绿色木霉在生产纤维素酶上的发展与利用。技术实现要素：针对以上不足，本发明的目的是提供一种高效的绿色木霉生产纤维素酶的方法。为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：一种绿色木霉生产纤维素酶的方法，包括以下步骤：a)将绿色木霉菌种接到pda培养基中，在28-35℃的恒温条件下培养3-4d；b)将浓度为0.2-1％的tween-80添加入所述pda培养基中，所述tween-80与所述绿色木霉菌种的体积比为0.3-2；c)制备固体发酵培养基，将甘蔗渣粉末、麸皮和盐液混合置于121℃环境下灭菌20min，所述甘蔗渣粉末的质量份为4-6份，所述麸皮的质量份为4-6份，所述盐液为质量浓度为0.04％的(nh4)2so4、3％的kh2po4、0.5％的mgso4·7h2o、0.05％的cacl2的混合溶液，所述盐液的质量份为30-40份；d)将生理盐水倒入活化的绿色木霉中，得到孢子液；将所述孢子液移入所述固体发酵培养基中，再将装有所述孢子液的所述固体发酵培养基放到摇床条件下培养；e)上述步骤完成后，向所述固体发酵培养基中加入蒸馏水，进行摇床处理，再经过纱布过滤后取溶液进行离心处理，所得上清液即为纤维素酶液。优选的是，步骤d)中，生理盐水摇床培养条件为培养温度为28-35℃、转速为160-200r/min、培养时间为3-4d。优选的是，步骤e)中，所述蒸馏水按v/m为15:1-22:1的比例添加；摇床温度为28-35℃，处理时间为45-65min；过滤纱布为6-10层；离心转速为4000-7000r/min，离心时间为8-15min。进一步地，所述甘蔗渣粉末经过酸处理或碱处理或先酸处理再碱处理或先碱处理再酸处理。优选的是，所述甘蔗渣粉末的酸处理的处理步骤为：取过80目筛的甘蔗渣粉末于容器中，加入2％浓度的h2so4，所述稀h2so4与所述甘蔗渣粉末的比例v/m为8：1-10：1，室温下静置处理2-3h，抽滤进行固液分离，蒸馏水洗涤残渣至中性后烘干。优选的是，所述甘蔗渣粉末的碱处理的处理步骤为：取过80目筛的甘蔗渣粉末于容器中，加入10％浓度的氨水，所述氨水与所述甘蔗渣粉末的比例v/m为8：1-10：1，室温下静置处理20-26h，抽滤进行固液分离，蒸馏水洗去残留在滤渣中的氨后烘干。优选的是，所述甘蔗渣粉末的先酸处理再碱处理的处理步骤为：取过80目筛的甘蔗渣粉末于容器中，加入2％浓度的h2so4，所述稀h2so4与所述甘蔗渣粉末的比例v/m为8：1-10：1，室温下静置处理2-3h，抽滤进行固液分离，然后再加入10％浓度的氨水，所述氨水与所述甘蔗渣粉末的比例v/m为8：1-10：1，室温下静置处理20-26h，抽滤进行固液分离，蒸馏水洗去残留在滤渣中的氨后烘干。优选的是，所述甘蔗渣粉末的先碱处理再酸处理的处理步骤为：取过80目筛的甘蔗渣粉末于容器中，加入10％浓度的氨水，所述氨水与所述甘蔗渣粉末的比例v/m为8：1-10：1，室温下静置处理20-26h，抽滤进行固液分离，蒸馏水洗去残留在滤渣中的氨，然后再加入2％的稀h2so4，所述稀h2so4与所述甘蔗渣粉末的比例v/m为8：1-10：1，搅拌均匀，于室温下静置处理2-3h，抽滤进行固液分离，蒸馏水洗涤残渣至中性后烘干。优选的是，所述pda培养基的的制备方法为：取马铃薯200g，去皮、切块，加水1000ml，煮沸半小时后经4层纱布过滤；取100ml滤液加入1.5g琼脂和2g葡萄糖，置于沸水浴中使所述琼脂和葡萄糖充分溶解，然后取5ml溶液倒入试管中，最后将试管置于121℃灭菌锅中灭菌20min。本发明的另一个目的是提供绿色木霉生产的纤维素酶在降解纤维物质方面的应用。本发明公开的绿色木霉生产纤维素酶的方法所生产的纤维素酶可以有效应用于降解纤维物质，提高纤维物质的降解效率。本发明中，比例v/m指体积与质量比。本发明中，tween-80为失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚，化学式为c24h44o6。tween-80为一种表面活性剂，tween-80的添加对纤维素的水解有许多促进作用，如降低酶负荷，提高水解率等。酸处理甘蔗渣粉末能够裂解木质素的结构，降解部分半纤维素，破坏纤维素的晶体结构。碱处理甘蔗渣粉末能够利用oh-减弱半纤维素和纤维素之间氢键的连接、皂化半纤维素和木质素分子之间的酯键。随着醚键的减少，纤维素膨胀、其结晶指数下降、半纤维素溶解、部分木质素溶解在反应液中、内表面积增加，导致木质纤维素原料更容易酶解。先酸处理再碱处理以及先碱处理再酸处理是将酸处理与碱处理结合，只是酸处理和碱处理的处理顺序不一样，但依然具有酸处理和碱处理的效果。酶液的提取步骤能够便于酶液的提取，方便酶活的测试等。与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供的绿色木霉生产纤维素酶的方法，通过添加tween-80、对甘蔗渣粉末进行预处理等方法步骤来提高产酶能力与效率，从而获得一种高效的绿色木霉发酵生产纤维素酶的方法。本发明还提供绿色木霉发酵生产的纤维素酶在降解纤维物质的应用，为降解纤维物质提供了一种新的方式。具体实施方式下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1本实施例提供一种绿色木霉生产纤维素酶的方法，包括以下步骤：a)将1ml绿色木霉as3.5455菌种接到预先制备好的pda培养基中，在30℃的恒温条件下培养3d。pda培养基的制备方法为：取马铃薯200g，去皮、切块，加水1000ml，煮沸半小时后经4层纱布过滤；取100ml滤液加入1.5g琼脂和2g葡萄糖，置于沸水浴中使所述琼脂和葡萄糖充分溶解，然后取5ml溶液倒入试管中，最后将试管置于121℃灭菌锅中灭菌20min。b)将2ml浓度为0.2％的tween-80添加入pda培养基中；c)制备固体发酵培养基，将甘蔗渣粉末、麸皮和盐液混合置于121℃环境下灭菌20min，甘蔗渣粉末的质量为6g，麸皮的质量为4g，盐液为质量浓度为0.04％的(nh4)2so4、3％的kh2po4、0.5％的mgso4·7h2o、0.05％的cacl2的混合溶液，盐液的的量为30ml。d)将10ml生理盐水倒入活化的绿色木霉中，用接种环涮洗，得到孢子液；用移液枪取1ml孢子液移入固体发酵培养基中，再将装有孢子液的固体发酵培养基放到30℃、180r/min的摇床条件下培养3天。e)将固体发酵培养基从恒温培养箱中取出，取出后，按20:1(v/m)的比例向固体发酵培养基中加入蒸馏水，在30℃摇床条件下处理1h，经过8层纱布过滤后，溶液在6000r/min条件下离心10min，所得上清液即为纤维素酶液。实施例2本实施例提供一种绿色木霉生产纤维素酶的方法，包括以下步骤：a)将1ml绿色木霉as3.5455菌种接到预先制备好的pda培养基中，在30℃的恒温条件下培养3d。pda培养基的制备方法为：取马铃薯200g，去皮、切块，加水1000ml，煮沸半小时后经4层纱布过滤；取100ml滤液加入1.5g琼脂和2g葡萄糖，置于沸水浴中使所述琼脂和葡萄糖充分溶解，然后取5ml溶液倒入试管中，最后将试管置于121℃灭菌锅中灭菌20min。b)将1ml浓度为0.5％的tween-80添加入pda培养基中。c)制备固体发酵培养基，将甘蔗渣粉末、麸皮和盐液混合置于121℃环境下灭菌20min，甘蔗渣粉末的质量为6g，麸皮的质量为4g，盐液为质量浓度为0.04％的(nh4)2so4、3％的kh2po4、0.5％的mgso4·7h2o、0.05％的cacl2的混合溶液，盐液的的量为30ml。甘蔗渣粉末在用于制备固体发酵培养基前经过酸处理，甘蔗渣粉末的酸处理的处理步骤为：称取6g过80目筛的甘蔗渣粉末于三角瓶中，加入50ml2％浓度的h2so4，室温下静置处理3h，抽滤进行固液分离，蒸馏水洗涤残渣至中性后烘干。将10ml生理盐水倒入活化的绿色木霉中，用接种环涮洗，得到孢子液；用移液枪取1ml孢子液移入固体发酵培养基中，再将装有孢子液的固体发酵培养基放到28℃、200r/min的摇床条件下培养4天。将固体发酵培养基从恒温培养箱中取出，取出后，按20:1(v/m)的比例向固体发酵培养基中加入蒸馏水，在28℃摇床条件下处理45min，经过6层纱布过滤后，溶液在7000r/min条件下离心8min，所得上清液即为纤维素酶液。实施例3本实施例提供一种绿色木霉生产纤维素酶的方法，包括以下步骤：a)将1ml绿色木霉as3.5455菌种接到预先制备好的pda培养基中，在30℃的恒温条件下培养3d。pda培养基的制备方法为：取马铃薯200g，去皮、切块，加水1000ml，煮沸半小时后经4层纱布过滤；取100ml滤液加入1.5g琼脂和2g葡萄糖，置于沸水浴中使所述琼脂和葡萄糖充分溶解，然后取5ml溶液倒入试管中，最后将试管置于121℃灭菌锅中灭菌20min。b)将0.3ml浓度为1％的tween-80添加入pda培养基中。c)制备固体发酵培养基，将甘蔗渣粉末、麸皮和盐液混合置于121℃环境下灭菌20min，甘蔗渣粉末的质量为4g，麸皮的质量为6g，盐液为质量浓度为0.04％的(nh4)2so4、3％的kh2po4、0.5％的mgso4·7h2o、0.05％的cacl2的混合溶液，盐液的的量为40ml。甘蔗渣粉末在用于制备固体发酵培养基前经过碱处理，甘蔗渣粉末的碱处理的处理步骤为：称取4g过80目筛的甘蔗渣粉末于三角瓶中，加入40ml10％浓度的氨水，室温下静置处理24h，抽滤进行固液分离，蒸馏水洗去残留在滤渣中的氨后烘干。d)将10ml生理盐水倒入活化的绿色木霉中，用接种环涮洗，得到孢子液；用移液枪取1ml孢子液移入固体发酵培养基中，再将装有孢子液的固体发酵培养基放到35℃、160r/min的摇床条件下培养3天。e)将固体发酵培养基从恒温培养箱中取出，取出后，按20:1(v/m)的比例向固体发酵培养基中加入蒸馏水，在35℃摇床条件下处理65min，经过10层纱布过滤后，溶液在4000r/min条件下离心15min，所得上清液即为纤维素酶液。实施例4本实施例提供一种绿色木霉生产纤维素酶的方法，包括以下步骤：a)将1ml绿色木霉as3.5455菌种接到预先制备好的pda培养基中，在30℃的恒温条件下培养3d。pda培养基的制备方法为：取马铃薯200g，去皮、切块，加水1000ml，煮沸半小时后经4层纱布过滤；取100ml滤液加入1.5g琼脂和2g葡萄糖，置于沸水浴中使所述琼脂和葡萄糖充分溶解，然后取5ml溶液倒入试管中，最后将试管置于121℃灭菌锅中灭菌20min。b)将1ml浓度为0.2％的tween-80添加入pda培养基中。c)制备固体发酵培养基，将甘蔗渣粉末、麸皮和盐液混合置于121℃环境下灭菌20min，甘蔗渣粉末的质量为6g，麸皮的质量为4g，盐液为质量浓度为0.04％的(nh4)2so4、3％的kh2po4、0.5％的mgso4·7h2o、0.05％的cacl2的混合溶液，盐液的的量为30ml。甘蔗渣粉末在用于制备固体发酵培养基前经过先碱处理再酸处理，甘蔗渣粉末的先碱处理再酸处理的处理步骤为：称取6g过80目筛的甘蔗渣粉末于三角瓶中，加入50ml10％浓度的氨水，室温下静置处理24h，抽滤进行固液分离，蒸馏水洗去残留在滤渣中的氨，然后再加入50ml2％的稀h2so4，室温下静置处理3h，抽滤进行固液分离，蒸馏水洗涤残渣至中性后烘干。d)将10ml生理盐水倒入活化的绿色木霉中，用接种环涮洗，得到孢子液；用移液枪取1ml孢子液移入固体发酵培养基中，再将装有孢子液的固体发酵培养基放到30℃、180r/min的摇床条件下培养3天。e)将固体发酵培养基从恒温培养箱中取出，取出后，按20:1(v/m)的比例向固体发酵培养基中加入蒸馏水，在30℃摇床条件下处理1h，经过8层纱布过滤后，溶液在6000r/min条件下离心10min，所得上清液即为纤维素酶液。实施例5本实施例提供一种绿色木霉生产纤维素酶的方法，包括以下步骤：a)将1ml绿色木霉as3.5455菌种接到预先制备好的pda培养基中，在30℃的恒温条件下培养3d。pda培养基的制备方法为：取马铃薯200g，去皮、切块，加水1000ml，煮沸半小时后经4层纱布过滤；取100ml滤液加入1.5g琼脂和2g葡萄糖，置于沸水浴中使所述琼脂和葡萄糖充分溶解，然后取5ml溶液倒入试管中，最后将试管置于121℃灭菌锅中灭菌20min。b)将1ml浓度为0.2％的tween-80添加入固体发酵培养基中。c)制备固体发酵培养基，将甘蔗渣粉末、麸皮和盐液混合置于121℃环境下灭菌20min，甘蔗渣粉末的质量为6g，麸皮的质量为4g，盐液为质量浓度为0.04％的(nh4)2so4、3％的kh2po4、0.5％的mgso4·7h2o、0.05％的cacl2的混合溶液，盐液的的量为30ml。甘蔗渣粉末在用于制备固体发酵培养基前经过先酸处理再碱处理，甘蔗渣粉末的先酸处理再碱处理的处理步骤为：称取6g过80目筛的甘蔗渣粉末于三角瓶中，加入50ml2％浓度的h2so4，室温下静置处理3h，抽滤进行固液分离，然后加入50ml10％浓度的氨水，室温下静置处理24h，抽滤进行固液分离，蒸馏水洗去残留在滤渣中的氨后烘干。d)将10ml生理盐水倒入活化的绿色木霉中，用接种环涮洗，得到孢子液；用移液枪取1ml孢子液移入固体发酵培养基中，再将装有孢子液的固体发酵培养基放到30℃、180r/min的摇床条件下培养3天。e)将固体发酵培养基从恒温培养箱中取出，取出后，按20:1(v/m)的比例向固体发酵培养基中加入蒸馏水，在30℃摇床条件下处理1h，经过8层纱布过滤后，溶液在6000r/min条件下离心10min，所得上清液即为纤维素酶液。对本发明实施例1-5所提供的技术方案的产酶能力进行实验论证。论证方法为酶活力的测定，具体为：取0.5ml纤维素酶液和1.5ml0.05mol/lph4.8的柠檬酸缓冲液放于洗干净后经烘箱烘干的具塞刻度试管中，试管放在50℃的水浴锅中预热5-10min后，在试管中加入滤纸条50mg(新华定量滤纸，约1cm×6cm)，并在水浴锅中保温1h后取出，立即向试管中加入3，5-二硝基水杨酸溶液3ml以钝化酶活性，从而终止酶反应，充分摇匀后沸水浴5min，取出冷却后加入蒸馏水定容至20ml，充分混匀。在540nm波长下测定试管液的吸光度值，在葡萄糖标准曲线上查出对应的葡萄糖含量，计算出滤纸酶活力。本发明中酶活力计算公式：其中，本发明中酶活力单位定义为：每h催化水解底物生成1mol葡萄糖所需的酶量为一个酶活单位u。对实施例1-5的酶活力进行测定，测定结果如表1所示。其中，表1中包含了一个对照组，对照组为采用传统方法进行绿色木霉产纤维素酶，即不包含添加tween-80的步骤，也不包含对固体发酵培养基进行酸处理或碱处理或先酸处理再碱处理或先碱处理再酸处理的步骤。表1各技术方案所获纤维素酶的酶活力的对应表方案酶活力u/ml实施例12.8实施例23.2实施例33.6实施例44.5实施例56.4对照组2.1从表1中可以看出，本发明提供的方法能够获得良好的酶活力，本发明提供的方法能够提高产酶能力与效率。高的酶活力的获得，证明本发明提供的绿色木霉发酵生产的纤维素酶能够很好地应用于降解纤维物质领域。以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。当前第1页12