一种含羟基修饰的N,N‑二甲氨基的阳离子聚合物及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种含羟基修饰的n,n-二甲氨基的阳离子聚合物及其制备方法和应用，属于功能性聚合物技术。

技术背景

sirna是一种能够特异性下调基因表达的短链核酸。理论上，通过合理设计，sirna可以沉默体内任何基因，人们可以利用这项生物技术从根本上解决很多困扰人类的疑难疾病，如乙肝、癌症、皮肤病等。尽管，sirna具有极其广阔的临床治疗潜力，但是sirna离临床应用还有很大一段距离。作为外源性分子，sirna在递送问题上存在很多的难以克服的障碍。首先，sirna是带有负电荷的外源性生物大分子，它很难直接被细胞摄取，而且体内给药后sirna会很快被体内的免疫系统识别并清除。因此，sirna需要借助辅助载体将其递送到特定组织的细胞中，从而实现其沉默目标基因的治疗目的。针对sirna直接给药方式的诸多不足，sirna递送载体的研究已成为热点。

阳离子聚合物是一类重要的sirna递送载体，它能和sirna在水溶液中通过静电作用相互结合形成稳定纳米粒子，同时具有制备简单、转染效率高等优点。2008年，世界上第一个基于阳离子聚合物的sirna药物(calaa-01)进入临床试验阶段。尽管，阳离子聚合物能够有效的递送sirna，但是其正电性会导致严重的毒副作用。目前，人们的普遍做法是在聚阳离子上键接peg或者采用层层包裹的方式来提高阳离子聚合物的生物相容性。但尽管如此，阳离子聚合物为载体的生物相容性仍难以满足临床应用的要求，需要开发降低阳离子聚合物毒性的有效方法。

技术实现要素：

为了有效的降低阳离子聚合物的毒性，促进临床推广应用，我们结合醇类物质在生物机体中的高相容性特点，制备出一种含羟基修饰的n,n-二甲氨基的阳离子聚合物，以期实现dna、sirna等生物分子的高效递送并有效提高阳离子聚合物的生物相容性。

本发明是通过以下技术方案加以实现的：

一种含羟基修饰的n,n-二甲氨基的阳离子聚合物，其羟基修饰的n,n-二甲氨基是n，n，n-二甲基乙基-2-羟基-丙基硫醚(以下简称hdma)，阳离子聚合物为均聚物或共聚物；所述的阳离子聚合物的相对分子质量为5000-40000。

所述的阳离子聚合物，其阳离子聚合物为均聚物，即其中键接hdma的结构单元的总质量占阳离子聚合物质量的100％。

所述的阳离子聚合物，其阳离子聚合物为共聚物，其中键接hdma的结构单元的总质量占阳离子聚合物质量的10％～90％。

所述的阳离子聚合物，其所述的共聚物，为含有疏水性结构单元的两亲性共聚物，疏水性结构单元的总质量占阳离子聚合物质量的10％～60％。

所述的阳离子聚合物，其所述的共聚物，为带有hdma的结构单元的均聚物(phdma)与非离子亲水性聚合物(b)和疏水段(r)组成的两亲性三嵌段共聚物；其中，phdma嵌段的相对分子质量为2000～10000，非离子亲水性聚合物b的相对分子质量为2000-10000，疏水段r的相对分子质量为2000～20000；phdma嵌段在三嵌段共聚物中的质量百分含量为10％～70％。

所述的阳离子聚合物，其所述的两亲性三嵌段共聚物的非离子亲水性聚合物b段选自聚乙二醇(peg)、聚羧基甜菜碱甲基丙烯酸酯或磷酸胆碱。

所述的阳离子聚合物，其所述的共聚物是peg-r-phdma型嵌段共聚物，结构式如下：

其中，phdma是聚甲基丙烯酸(n，n，n-二甲基乙基-2-羟基-丙基硫醚)酯，na是其结构单元数，是8-41的整数；n是聚乙二醇的结构单元数，是45-227的整数；疏水段r是酯类单体或烯类单体的均聚物或共聚物，酯类单体选自己内酯、已交酯、丙交酯、4-(乙二醇缩酮)-己内酯，烯类单体选自甲基丙烯酸-2-(3，5-二恶烷-4-(2，4，6-三甲氧基苯))丙酯、甲基丙烯酸(二异丙基氨基)乙酯。

本发明的含羟基修饰的n,n-二甲氨基的阳离子聚合物的制备方法，以烯类聚合物为疏水段：将单羟基peg溶解于二氯甲烷，加入小分子链转移剂s-1-十二烷基-s′-(α，α″-二甲基-α″-乙酸)三硫代碳酸酯(ctam)，随后加入二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶，室温条件下反应后浓缩，在冰乙醚中沉淀，抽滤，真空干燥，得到大分子引发剂peg-ctam；在反应器中加入大分子引发剂，用二甲基亚砜溶解后，加入疏水性的烯类单体，30-80℃下反应24小时后，加入甲基丙烯酸缩水甘油醚，30-80℃下反应24小时，浓缩，在冰乙醚中沉淀，抽滤，真空干燥，得到含环氧乙烷侧基的嵌段共聚物；将所得共聚物溶于四氢呋喃中，加入n,n-二甲氨基乙硫醇，室温反应过夜；浓缩，在冰乙醚中沉淀，抽滤，真空干燥，得到以烯类聚合物为疏水段的三嵌段共聚物。

本发明的含羟基修饰的n,n-二甲氨基的阳离子聚合物的制备方法，其特征是可降解聚酯为疏水段：将单羟基peg加入反应器中，然后在反应器中加入酯类单体，加入催化剂辛酸亚锡，100-130℃下反应过夜，将产物用二氯甲烷溶解，在冰乙醚中沉淀，抽滤，真空干燥得到peg-r聚合物；将peg-r溶解于二氯甲烷，加入小分子链转移剂ctam，随后加入二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶，室温条件下反应过夜，浓缩，在冰乙醚中沉淀，抽滤，真空干燥，得到大分子引发剂peg-r-ctam；将peg-r-ctam和甲基丙烯酸缩水甘油醚加入反应器中，然后加入dmso，30℃下反应24小时后浓缩，在冰乙醚中沉淀，抽滤，真空干燥，得到含环氧乙烷侧基的嵌段共聚物；将所得嵌段共聚物溶于四氢呋喃中，加入n,n-二甲氨基乙硫醇，室温反应过夜后浓缩，在冰乙醚中沉淀，抽滤，真空干燥，得到以可降解聚酯为疏水段的三嵌段共聚物。

本发明的含羟基修饰的n,n-二甲氨基的阳离子聚合物应用于负载dna、sirna或多肽、蛋白类生物药物，用于药物递送。

具体详细说明如下：

一种含羟基修饰的n,n-二甲氨基的阳离子聚合物，所述的羟基修饰的n,n-二甲氨基是n，n，n-二甲基乙基-2-羟基-丙基硫醚(本发明中缩写为hdma)，所述的阳离子聚合物可以是均聚物或共聚物，其中键接hdma的结构单元的总质量占阳离子聚合物质量的10％～100％，所述的阳离子聚合物的相对分子量为5000-40000。

hdma的结构如式1所示：

式1中x为键接hdma与大分子主链的基团，可以是酯基、醚键、酰胺等基团，优选酯基。

hdma可以通过n,n-二甲氨基乙硫醇与环氧基团间的开环加成反应而形成。

hdma侧基作为一种阳离子结构单元，可以通过静电吸附负载dna、sirna、多肽及蛋白等负电性的物质，起到吸附负载或分离的作用。其特征还在于羟基的存在，会降低阳离子的毒性。

所述的阳离子聚合物，特征是一种由键接hdma的结构单元组成的均聚物，即键接hdma的结构单元的总质量占阳离子聚合物质量的100％。

所述的阳离子聚合物，特征是一种共聚物，是键接hdma的结构单元与其它结构单元形成的共聚物，可以是无规共聚物、嵌段共聚物、接枝共聚物、星形共聚物等；其中键接hdma的结构单元的总质量占阳离子聚合物质量的10％～90％，

所述的共聚物，特征是含有疏水性结构单元的两亲性共聚物，疏水性结构单元的总质量占阳离子聚合物质量的10％～60％。

所述的共聚物进一步优选两亲性三嵌段共聚物，是带有hdma侧基的阳离子聚合物(phdma)与非离子亲水性聚合物(b)和疏水段(r)组成的两亲性三嵌段共聚物；其中，phdma嵌段的相对分子量为2000-10000，嵌段b的相对分子量为2000-10000，疏水段r的相对分子量为2000-20000；phdma嵌段在三嵌段共聚物中的质量百分含量为10％-70％。

上述的非离子亲水性聚合物(b)选自聚乙二醇(peg)、聚羧基甜菜碱甲基丙烯酸酯、磷酸胆碱。

所述的两亲性三嵌段共聚物，进一步优选peg-r-phdma型嵌段共聚物。具体地，peg-r-phdma可以是式2所示的结构，其中，phdma是聚甲基丙烯酸(n，n，n-二甲基乙基-2-羟基-丙基硫醚)酯。

式2中n是聚乙二醇的结构单元数，是45-227的整数；na是聚甲基丙烯酸(n，n，n-二甲基乙基-2-羟基-丙基硫醚)酯的结构单元数，是8-41的整数。

上述共聚物中的疏水段r，选择可降解聚酯类疏水性聚合物或烯类单体的聚合物；优选己内酯(cl)、已交酯(ga)丙交酯(la)、4-(乙二醇缩酮)-己内酯(bmcl)、甲基丙烯酸-2-(3，5-二恶烷-4-(2，4，6-三甲氧基苯))丙酯(ttma)、甲基丙烯酸(二异丙基氨基)乙酯(dpa)的均聚物或共聚物。

所述的peg-r-phdma型嵌段共聚物，疏水段r优选ttma的均聚物(pttma)，分子量为2000-10000。

以烯类聚合物为疏水段的三嵌段共聚物的制备方法是：将聚乙二醇溶解于二氯甲烷，加入小分子链转移剂s-1-十二烷基-s′-(α，α″-二甲基-α″-乙酸)三硫代碳酸酯(ctam)，随后加入二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶，室温条件下反应后浓缩，在冰乙醚中沉淀，抽滤，真空干燥，得到大分子引发剂peg-ctam；在反应器中加入大分子引发剂，用二甲基亚砜溶解后，加入疏水性的烯类单体，如ttma或dpa，30-80℃下反应24小时后，加入甲基丙烯酸缩水甘油醚，30-80℃下反应24小时，浓缩，在冰乙醚中沉淀，抽滤，真空干燥，得到含环氧乙烷侧基的嵌段共聚物；将所得共聚物溶于四氢呋喃中，加入n,n-二甲氨基乙硫醇，室温反应过夜。浓缩，在冰乙醚中沉淀，抽滤，真空干燥，得到以烯类聚合物为疏水段的三嵌段共聚物。

以可降解聚酯为疏水段的三嵌段共聚物的制备方法是：将peg加入反应器中，然后在反应器中加入酯类单体，如cl或la，加入辛酸亚锡，100-130℃下反应过夜，将产物用二氯甲烷溶解，在冰乙醚中沉淀，抽滤，真空干燥得到peg-r聚合物；将peg-r溶解于二氯甲烷，加入小分子链转移剂ctam，随后加入二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶，室温条件下反应过夜，浓缩，在冰乙醚中沉淀，抽滤，真空干燥，得到大分子引发剂peg-r-ctam；将peg-r-ctam和甲基丙烯酸缩水甘油醚加入反应器中，然后加入dmso，30℃下反应24小时后浓缩，在冰乙醚中沉淀，抽滤，真空干燥，得到含环氧乙烷侧基的嵌段共聚物；将所得嵌段共聚物溶于四氢呋喃中，加入n,n-二甲氨基乙硫醇，室温反应过夜后浓缩，在冰乙醚中沉淀，抽滤，真空干燥，得到以可降解聚酯为疏水段的三嵌段共聚物。

本发明中所述的共聚物带有较强的正电荷，可用于负载dna、sirna或多肽、蛋白类生物药物，用于药物递送。其中所述的两亲性共聚物，其在水溶液中自组装形成平均粒径小于200nm的聚阳离子纳米粒，表面羟基的存在可以明显提高该聚阳离子的生物相容性，细胞相容性较好且没有溶血现象。所形成的纳米粒负载dna、sirna或多肽、蛋白类生物药物，内核可以负载疏水性的化学药物，用于药物递送。

研究表明，所形成的两亲性共聚物纳米粒，负载sirna，在细胞水平和小鼠皮下注射都能够产生较高的基因沉默效率，作为sirna载体，具有较好的应用前景。

附图说明

图1实施例1所制备的含环氧乙烷侧基的嵌段共聚物的核磁共振氢谱图，证明所合成的含环氧侧基的前体聚合物结构与所设计的相符。

图2实施例1所制备的羟基修饰的阳离子两亲性嵌段共聚物eta-1的核磁共振氢谱图，证明其嵌段结构中各嵌段基团和分子量，与设计结构相符，具体数据见表1。

图3eta-1纳米粒sirna负载凝胶电泳图，证明纳米粒能够较好的负载sirna。

图4eta-1纳米粒电镜照片。证明eta-1在水中能够自组装形成100nm一下的纳米粒。

图5负载sirna的eta-1纳米粒电镜照片。负载sirna后的eta-1纳米粒仍呈球形，粒径略有下降。

图6负载sirna的eta-1纳米粒的细胞毒性，可见，细胞活性都在80％以上，具有很好的生物相容性。

图7eta-1溶血实验结果。结果说明该共聚物溶血量与pbs缓冲液相近，基本不产生溶血。

图8负载sirna的eta-1纳米粒的转染效率图，在氮磷比15以上时，基因沉默效果均高于市售转染试剂lipo2000，具有很好的sirna递送功能。

图9负载sirna的eta-1纳米粒在体内肝脏的基因沉默效果图。结果证明在2mg/kg剂量下，该载体能够明显沉默肝脏细胞内的靶基因，呈现出较好的体内基因递送功效。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。需要指出的是，对领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思前提下还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。下面仅以三嵌段共聚物的制备为例。

实施例1：两亲性三嵌段阳离子共聚物eta-1的合成

将2g分子量2000的聚乙二醇单甲醚(mpeg2k)溶解于二氯甲烷，加入0.5g小分子链转移剂ctam(macromolecules2006,39,1724-1730)，随后加入二环己基碳二亚胺(dcc)和4-二甲氨基吡啶(dmap)，室温条件下反应后浓缩，在冰乙醚中沉淀，抽滤，真空干燥，得到大分子raft试剂peg2k-ctam；在反应器中加入1g大分子引发剂，用二甲基亚砜(dmso)溶解后，加入3.85gttma，30-80℃下反应24小时后，加入2g的甲基丙烯酸缩水甘油醚，30-80℃下反应24小时，浓缩，在冰乙醚中沉淀，抽滤，真空干燥，得到含环氧乙烷侧基的嵌段共聚物，其核磁谱图如图1。取3g所得聚合物溶于四氢呋喃中，加入0.8gn,n-二甲氨基乙硫醇，室温反应过夜。浓缩，在冰乙醚中沉淀，抽滤，真空干燥，得到peg-r-phdma型嵌段共聚物eta-1，其核磁谱图如图2。

实施例2-6

实施例2-6的合成方法与实施例1装置及反应条件相同，在此基础上只改变单体种类、投料量以及投料比，即三嵌段阳离子共聚物三段的分子量。所得聚合物具体分子量信息如表1.

表1实施例1-11所制备的共聚物的结构信息

实施例7-8

按实施例1方法，所不同的是不用ttma单体，用peg2k-ctam直接引发甲基丙烯酸缩水甘油醚聚合，得到peg与聚甲基丙烯酸缩水甘油醚的嵌段共聚物，然后与-二甲氨基乙硫醇反应，侧基键接上hdma。通过改变mpeg分子量和甲基丙烯酸缩水甘油醚单体用量，得到不同嵌段比和不同分子量的peg-phdma嵌段共聚物，ea-1和ea-2，见表1。

实施例9

按实施例1方法，用相同摩尔数的甲醇取代mpeg，制备raft试剂ch3-ctam，用ch3-ctam引发ttma聚合、再引发甲基丙烯酸缩水甘油醚聚合，得到二嵌段共聚物，再用n,n-二甲氨基乙硫醇与所得无规共聚物上的环氧基开环加成反应，即可得到ttma与甲基丙烯酸(n，n，n-二甲基乙基-2-羟基-丙基硫醚)酯两亲性嵌段共聚物pt-pa。

实施例10

按实施例9方法，用ch3-ctam同时引发ttma和甲基丙烯酸缩水甘油醚聚合，得到无规共聚物，再用n,n-二甲氨基乙硫醇与所得无规共聚物上的环氧基开环加成反应，即可得到ttma与甲基丙烯酸(n，n，n-二甲基乙基-2-羟基-丙基硫醚)酯两亲性无规共聚物p(t/a)-1，其中ttma结构单元的含量为10％，p(t/a)-1的相对分子质量为35000。

调整甲基丙烯酸缩水甘油醚单体的用量，或采用不同的共聚单体，即可得到不同组分的两亲性无规共聚物。

实施例11

按实施例10方法，不加入其它单体，用ch3-ctam直接引发甲基丙烯酸缩水甘油醚聚合，得到甲基丙烯酸(n，n，n-二甲基乙基-2-羟基-丙基硫醚)酯的均聚物pmhdma-25，分子量25000；调控单体与引发剂的比例，可得到不同分子量pmhdma。

实施例12含多羟基修饰的聚阳离子的两亲性三嵌段共聚物eca-1的合成

将1gmpeg2k加入反应器中，然后在反应器中加入2gcl单体，最后加入两滴辛酸亚锡，100-130℃下反应过夜，将产物用二氯甲烷溶解，在冰乙醚中沉淀，抽滤，真空干燥得到peg-pcl聚合物。将2gpeg2k-pcl溶解于二氯甲烷，加入0.5g小分子链转移剂ctam，随后加入二环己基碳二亚胺(dcc)和4-二甲氨基吡啶(dmap)，室温条件下反应过夜，浓缩，在冰乙醚中沉淀，抽滤，真空干燥，得到大分子raft试剂peg2k-pcl-ctam。取1gpeg2k-pcl-ctam和2g的甲基丙烯酸缩水甘油醚加入反应器中，然后加入10mldmso，30℃下反应一段时间后浓缩，在冰乙醚中沉淀，抽滤，真空干燥，得到含环氧乙烷侧基的嵌段共聚物。取3g所得聚合物溶于四氢呋喃中，加入0.8gn,n-二甲氨基乙硫醇，室温反应过夜后浓缩，在冰乙醚中沉淀，抽滤，真空干燥，得到羟基修饰的三嵌段阳离子共聚物eca-1。

实施例13-18

合成方法与实施例7装置及反应条件相同，在此基础上只改变单体种类、投料量以及投料比，即三嵌段阳离子共聚物三段的分子量。所得聚合物具体结果信息如表2。

表2实施例12-18所制备的共聚物的结构信息

实施例19：空白纳米粒的制备

准确称取10mg的嵌段共聚物eta-1，溶于1ml的四氢呋喃，把嵌段共聚物溶液缓慢滴加到8ml搅拌的纯净水(也可以是pbs或生理盐水)中，室温搅拌3h后，离心分离，清液为自组装纳米粒分散液，采用dls测试不同时间点纳米粒溶液的粒径和分布。以纳米粒分散液中的含氮量为单位，将纳米粒分散液稀释得到1mm氮浓度的纳米粒分散液，备用。

实施例20：sirna的负载

取一个1.5mlep管，向管中加入6ul的269ng/ul的sirna水溶液，取38.4ul的1mm氮浓度的eta-1纳米粒分散液，然后加入355.60μl含dmem的水溶液，混合后静置20ml获得负载sirna的纳米粒分散液。

实施例21：转染实验

在24孔板中接种hepg-2细胞，细胞密度为1×10⁴细胞/孔，细胞为稳定表达荧光素酶蛋白(luciferase)的hepg-2细胞，培养基体积为0.5ml。培养18h后，细胞融合率达到50％。转染前，将培养基换成dmem培养基。将100μl实施例14制备的含1.0μgsirna的eta-1纳米粒溶液加入至24孔板中，每个样品设置3个平行孔。37℃及5％co2的条件下，将细胞培养4h，然后取出孔中液体，换为含2％fbs的dmem低糖培养基，0.5ml/孔。培养48h后，弃去孔中的液体，用pbs清洗2次，然后向每孔加入200μl基因裂解缓冲液，冻融1次，使细胞裂解完全。吹打完全后，吸出细胞裂解液至新的ep管，离心(12000rpm，30s)，将上清液吸出。向10μl上清液中加入50μl底物后，采用荧光计(synergyht,biotek,usa)测定相对发光单位。用bca(pierce,usa)试剂盒测定总蛋白的浓度。将未加入任何试剂的细胞所表达的荧光素酶蛋白作为基准，载体组表达的荧光素酶蛋白量除以未加入任何试剂的细胞表达的荧光素酶蛋白量即可得到蛋白表达的相对抑制效率。

实施例22-实施例33

选择不同的共聚物，按照实施例19方法制备纳米粒，按照实施例20方法负载sirna，再按实施例21的操作方法在不同的细胞系上进行转染，结果如表3：

表3所制备的阳离子聚合物的基因负载、细胞相容性和基因沉默效率

表中的基因沉默效率实验中，sirna剂量为50nm。

实施例30：毒性实验

在96孔板中接种1×10⁴个hepg-2细胞/孔，每孔培养基体积为100μl，5％co2，37℃条件下培养24h。加入50μl含0.2μgsirna的负载纳米粒溶液，同时设置调零孔，孔中分别加入dmem培养基，mtt以及二甲基亚砜，对照孔中分别加入相同体积的复合物溶液，dmem培养基、mtt、以及二甲基亚砜，5％co2，37℃条件下培养48h。每孔加入20μlmtt溶液(5mg/ml)，继续5％co2，37℃培养4h。弃去样品孔内上清液，向每孔中加入150μldmso，置于低速震荡仪上振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔吸光值。计算各个样品孔细胞相对活力，所得细胞活力均在80％以上。示例列于如表3。

实施例35：溶血实验

准备2％红细胞，自兔子心脏抽取血液5ml，加入0.2ml抗凝剂edta，用pbs洗涤、离心，除去表面的白细胞，至上清液不显红色，弃上清液后取1ml再加入50ml的pbs即得。将材料用pbs溶液调整浓度为50，30，20，15，10和5。每次使用红细胞前，用pbs洗，直至上清液中无明显红色(略黄)，吸取底物200μl，稀释至10ml使用。将0.5ml的材料与0.5ml的2％的红细胞溶液混合，室温条件下静止3h，之后用10050r/min离心3min。取出100μl于96孔板上，用570nm的波长检测。分别以水和pbs作为阳性对照和阴性对照。每个样品2个平行。

溶血率(％)＝(样品吸收-阴性对照吸收)/(阳性对照吸收-阴性对照吸收)×100％。溶血率超过5％视为溶血。

实施例36：体内实验

取雄性c57bl/6鼠(18-20g)，将制备好的含anti-apobsirna的eta-1纳米粒分散液通过静脉注射的方式注入到小鼠体内。给药剂量为1mg/kg。48h以后处死小鼠，取出肝脏，通过rt-pcr检测小鼠的apob的含量。结果见附图9。