多肽及含有多肽的培养基的制作方法

本发明涉及干细胞分泌因子领域，特别涉及多肽及含有多肽的培养基。

背景技术：

脂肪干细胞(adipose-derivedmesenchymalstemcells，adscs)是来源于脂肪组织的干细胞，与其它成体干细胞一样具有自我更新和多向分化的能力，在适宜诱导条件下可以分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞等。由于脂肪干细胞具有促进伤口愈合、损伤组织细胞再生和减少疤痕及抗衰老能力，且来源丰富，取材方便，不受伦理学的限制，现在已广泛地应用于组织再生工程和美容医学领域。

脂肪干细胞之所以在美容医学领域如此受关注，与其所能分泌的富含优质的人源性胶原蛋白、生物活性多肽、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子等100多种细胞因子、营养物质密不可分，也正是因为脂肪干细胞能够分泌这些因子，才使脂肪干细胞具有抗皱、美白、补水等美容功效。

皮肤抗皱的研究一直是整形修复领域的研究重点。皱纹的形成主要是皮肤中胶原的合成和降解代谢之间的平衡被打破，导致胶原合成的速度小于降解的速度，使皮肤胶原流失，最终导致皱纹的形成。主要合成和分泌胶原纤维的是成纤维细胞，现有的研究表明，脂肪干细胞分泌的α成纤维细胞生长因子(αfgf)可以激活皮肤的成纤维细胞，具有促进成纤维细胞分泌胶原的能力。此外，脂肪干细胞的美容作用还在于脂肪干细胞能够分泌转化生长因子β1(tgf-β1)，tgf-β1在皮肤美白的过程中起了关键的作用。当然，还有其它因子如表皮生长因子(egf)、角质细胞生长因子(kgf)等。

目前，脂肪干细胞分泌因子的获得均是从培养过脂肪干细胞的培养液中浓缩获得。但脂肪干细胞在正常培养状态下所分泌的细胞因子极其有限，产量极低，大大地限制了脂肪干细胞分泌因子的应用。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供一种多肽及含有多肽的培养基，用于有效刺激脂肪干细胞并增加其分泌细胞因子，以解决脂肪干细胞分泌细胞因子极其有限的技术问题。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供的一种多肽，所述多肽的氨基酸序列为：

(i)seqidno.1所示；或

(ii)与(i)所述序列至少有90％同源性的序列。

作为优选，所述的多肽，具有与(i)或(ii)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸序列获得的氨基酸序列，且与(i)或(ii)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列。

作为优选，所述多个为2个。

本发明还提供了所述多肽在制备促进细胞akt通路的磷酸化的产品中的应用。

本发明还提供了一种含有多肽的细胞培养基，含有上述技术方案所述的多肽。

作为优选，所述的含有多肽的细胞培养基中的多肽浓度为5-50ng/ml。

作为优选，所述的含有多肽的细胞培养基还包括血小板裂解物、bfgf和l-谷氨酰胺。

作为优选，所述的含有多肽的细胞培养基包括：

bfgf50ng/ml；

l-谷氨酰胺4mm/ml。

其中，所述50ng/ml和4mm/ml为所述bfgf和l-谷氨酰胺在含有多肽的细胞培养基中的浓度。

作为优选，所述血小板裂解物在所述的含有多肽的细胞培养基的体积百分比为5％。

本发明还提供含有多肽的细胞培养基在促进脂肪干细胞分泌细胞因子中的应用。

本发明开发出了多肽及含有多肽的培养基，多肽通过促进脂肪干细胞的akt蛋白的丝氨酸473(ser473)的磷酸化，从而活化脂肪干细胞pi3k/akt通路，增加脂肪干细胞分泌细胞因子的能力，大大促进脂肪干细胞分泌αfgf和tgf-β1等细胞因子的能力，且本发明公开的多肽不会影响脂肪干细胞表型状态，因此，本发明提供的多肽及含有多肽的培养基具有以下优势：采用合成的多肽与血小板裂解物、bfgf和l-谷氨酰胺配合刺激脂肪干细胞，增加其分泌细胞因子的能力；且含有多肽的培养基对脂肪干细胞的生长无不良影响。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示培养基1与培养基2培养的脂肪干细胞形态；

图2示培养基1与培养基2培养的脂肪干细胞akt磷酸化的表达水平图；

图3示培养基1与培养基2培养脂肪干细胞后脂肪干细胞分泌的细胞因子浓度图；

图4示培养基1培养脂肪干细胞后浓缩前与浓缩后脂肪干细胞分泌的细胞因子浓度。

其中，图2中akt为细胞akt蛋白表达水平，p-akt为细胞akt磷酸化蛋白表达水平。

具体实施方式

本发明公开了多肽及含有多肽的培养基，本发明提供多肽及含有多肽的培养基能有效解决脂肪干细胞分泌细胞因子极其有限的技术问题。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的多肽及含有多肽的培养基，其中所用原料及试剂均可由市场购得。

实施例1

多肽制剂的制备，制备方法如下：

人工合成多肽，其氨基酸序列如seqidno：1所示。用无菌d-pbs溶解后，0.1μm滤膜过滤，-80℃保存备用。

实施例2

脂肪干细胞培养基的配置，制备方法如下：

培养基1(含有多肽的细胞培养基)：以dmem/f12为基础培养基，加入血小板裂解物、bfgf、l-谷氨酰胺和多肽，使血小板裂解物的体积百分比为5％，使bfgf、l-谷氨酰胺和多肽的终浓度分别为50ng/ml、4mm/ml和10ng/ml，培养基1置于4℃避光保存备用。

培养基2(不含有多肽的细胞培养基)：以dmem/f12为基础培养基，加入血小板裂解物、bfgf、l-谷氨酰胺，使血小板裂解物的体积百分比为5％，使bfgf和l-谷氨酰胺的终浓度分别为50ng/ml和4mm/ml，培养基2置于4度避光保存备用。

实施例3

脂肪干细胞的培养，方法如下：

取正常培养基培养脂肪干细胞至p6代的脂肪干细胞，按1×10⁶个细胞/瓶铺板至t75培养瓶中，培养瓶中的培养基体积为10ml，12h后将10ml培养基全量换液为实施例2中的培养基1(含有多肽的细胞培养基)和培养基2(不含有多肽的细胞培养基)，2天后收集细胞培养液和细胞。

如图1所示，脂肪干细胞贴壁且成成纤维状，两种培养基所培养的脂肪干细胞在形态上没有差异，说明血小板裂解物、bfgf、l-谷氨酰胺和多肽对脂肪干细胞的培养无生长影响。

实施例4

脂肪干细胞流式表型检测，制备方法如下：

取p3代脂肪干细胞，将细胞转入流式管中，600g离心3min，弃上清，加入1ml的pbs冲洗2遍。200μl的pbs重悬细胞后，分别加入cd34、cd45、cd29、cd90、cd105和hla-dr抗体。室温孵育30min后，pbs洗涤3次，弃上清后pbs重悬细胞，流式检测细胞表型。

结果如表1所示，两种培养基对脂肪干细胞的表面标志没有显著影响，说明培养基1和培养基2对脂肪干细胞的性质无影响。

表1脂肪干细胞流式表型

实施例5

收集实施例3中培养基1和培养基2所培养的脂肪干细胞各2×10⁶，用4℃预冷的pbs充分洗涤3次后，加入4℃的ripa裂解缓冲液200μl重悬细胞，冰上裂解20min。离心收集上清蛋白液，并取150μl蛋白液加入5×蛋白buffer37.5μl，100℃煮沸5min，4℃保存备用。

将制备好的蛋白液加入凝胶中电泳，先用电压60v电泳5min，再用80v电压电泳60min。电泳结束后进行转膜，100v，2h。结束后将膜从电转槽中取出，tbst稍加漂洗，浸没于封闭液(含5％bsa的牛奶)中缓慢摇荡1h。将含有目的蛋白的膜分别转入装有4ml一抗(rabbitphospho-akt1(ser473)antibody)的自封袋中，水平摇床上50rpm1h，转到4℃过夜。第二天将膜取出，用tbst漂洗四次。将转有目的蛋白的膜和内参蛋白的膜分别放在2号自封袋中，加入稀释(1∶5000)对应一抗的二抗(goatanti-rabbitigg(h+l)secondaryantibody)，室温轻摇一小时，一抗和二抗均购自ebioscience。二抗孵育结束后，用pbst漂洗膜四次。避光加入显色剂显色拍照。

结果如图2所示，培养基1所培养的脂肪干细胞p-akt的表达水平明显升高。

实施例6

浓缩前细胞因子浓度测定，制备方法如下：

对实施例3所收集的换液2天后的培养基1和培养基2用elisa试剂盒检测细胞因子的浓度，操作步骤如下：

取酶标板室温平衡30min，取500μl采用1/50-1/400的稀释度将培养液样本加入酶标孔，每孔20μl，做3个复孔。置于37℃放置60min后，用洗涤液满孔洗涤3遍。每孔50μl/孔加入酶标抗体，37℃避光孵育60min。洗涤3次后，加入底物100μl/孔，37℃避光放置3-5min，加入50μl/孔终止液终止反应，并在20min内用酶标仪检测实验结果。

结果如图3所示，含多肽的细胞培养基1培养的脂肪干细胞所分泌的αfgf、tgf-β1、egf和kgf浓度比不含多肽的培养基(即培养基2)分泌的细胞因子提高了2-3倍，含多肽的细胞培养基1培养的脂肪干细胞所分泌的αfgf、tgf-β1、egf和kgf的浓度均与培养基2培养的脂肪干细胞分泌的αfgf、tgf-β1、egf和kgf的浓度之间存在显著性差异，p＜0.05。

实施例7

对实施例3收集的细胞培养基1(即培养基1培养脂肪干细胞后的培养基)的细胞因子进行浓缩，制备方法如下：

采用超速过滤离心法对培养基1进行浓缩。将培养液转入50ml3000kda的无菌超速离心管，4℃的3000rpm/min离心30min，收集浓缩液，每50ml培养基1获得1ml浓缩液，浓缩倍数达到50倍。将浓缩液置于-80℃保存备用

实施例8

对实施例7获得的细胞培养基1的浓缩液进行细胞因子的浓度测定，制备方法如下：

对所收集的细胞培养基1浓缩液用elisa试剂盒检测细胞因子的浓度，操作步骤如下：

取酶标板室温平衡30min，取浓缩液10μl，pbs稀释50倍，再采用1/50-1/400的稀释度将培养液样本加入酶标孔，每孔20μl，做3个复孔。置于37℃放置60min后，用洗涤液满孔洗涤3遍。每孔50μl/孔加入酶标抗体，37℃避光孵育60min。洗涤3次后，加入底物100μl/孔，37℃避光放置3-5min，加入50μl/孔终止液终止反应，并在20min内用酶标仪检测实验结果。

结果如图4所示，培养基1培养的脂肪干细胞所分泌的αfgf、tgf-β1、egf和kgf浓度比实施例6的细胞培养基1即浓缩前的细胞培养基1培养的脂肪干细胞分泌的αfgf、tgf-β1、egf和kgf浓度提高了40-50倍，其中，浓缩前的细胞培养基1培养的脂肪干细胞分泌的αfgf、tgf-β1、egf和kgf的浓度均与浓缩后的细胞培养基1培养的脂肪干细胞分泌的αfgf、tgf-β1、egf和kgf的浓度之间存在极显著性差异，p＜0.01。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

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<110>深圳市泰华细胞工程有限公司

<120>多肽及含有多肽的培养基

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