预防和/或辅助治疗肿瘤的香菇多糖粉体及其提取工艺的制作方法

本发明涉及新的香菇多糖粉体及其提取工艺。具体而言，本发明涉及一种新的具有预防和/或辅助治疗肿瘤活性的新的香菇多糖粉体及其提取工艺。

背景技术

鉴于肿瘤的高发，而预防、治疗手段有限，目前市场上迫切需要一种预防和/或辅助治疗肿瘤的制剂，例如来源于食品的制剂，以获得预防和治疗肿瘤的功效。

目前市场上缺乏预防癌症的产品。现有产品的目标多以直接杀伤肿瘤细胞为主。但是，它们在杀伤肿瘤细胞的同时，往往会杀伤免疫效应和免疫记忆细胞。也有一些产品从正向免疫效应为目标，加强效应性免疫细胞，即常说的提高免疫力。然而，现代肿瘤免疫学研究表明，机体内有正常免疫效应细胞，肿瘤细胞还是会发生免疫逃逸。究其原因，是因为有一群免疫抑制性细胞阻碍了免疫细胞细胞发挥免疫监视，而解除这群免疫抑制性细胞的负向效应，对于肿瘤预防和/或辅助治疗具有重要意义。

已经用多糖如香菇多糖来减少癌性肿瘤的大小。研究表明香菇多糖具有抗癌作用，其能够活化t细胞，自然杀伤细胞和巨噬细胞，从而增强宿主的免疫系统的免疫力。研究已经显示香菇多糖对于多种癌症具有有益的预防和/或治疗作用，包括例如肝细胞癌、乳腺癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌等等。

虽然已知香菇多糖的药用用途，提取香菇多糖存在许多困难。现有用于预防肿瘤的香菇多糖提取工艺为粗多糖，并且粗多糖中的成分未进行细分。

当前已知提取方法可以分为溶剂提取或超声与超高压提取。溶剂萃取方法通常使用热水，碱液或聚乙二醇。香菇多糖粗提物可以通过用沸水提取获得。这种方法中，鲜子实体用热水提取之后，将悬浮液过滤，并离心除去不溶物。将粗提物浓缩，随后沉淀，然后将沉淀物重新溶解在碱性溶液中，过滤，用稀酸的中和。另外，碱液提取方法也是已知的，所述方法需要使用例如氢氧化钠溶液提取新鲜或干燥香菇多糖的子实体。另外，也可以通过超声与超高压提取方法提取香菇多糖。首先将香菇粉浸泡在蒸馏水中，超声处理所述溶液，然后使用提取香菇多糖的热水或用氢氧化钠提取方法提取。然后去除水并沉淀。随后将溶液冷却并收集沉淀物。

研究表明，某些香菇多糖的细分组分具有较高的抗肿瘤活性，例如已有研究表明高分子量的组分表现出更高水平的抗肿瘤活性。已经发现超声提取技术产生的化合物表现出较低的分子量和较低的抗肿瘤活性。研究发现高压处理可导致一些大分子的解离或变性。还已经发现苛刻的提取条件如强碱、高压和超声可能导致提取香菇多糖的断裂，从而降低化合物的分子量或使之失活。

因此，本领域急需能够用于预防和/或治疗肿瘤(具有高的预防和/或治疗肿瘤活性)的产品如新型香菇多糖粉体，以及制备所述产品的提取工艺。

技术实现要素：

发明人通过研究，发现了一种新的香菇多糖粉体以及其制备方法。令人吃惊的，发明人已经发现所述香菇多糖粉体具有预防和/或治疗肿瘤的活性。发明人还发现一种新的香菇多糖粉体制备方法，通过所述方法能够获得具有预防和/或治疗肿瘤活性的香菇多糖粉体。还令人吃惊的发现，通过本发明的方法能够对香菇粗多糖的成分进行细分。本发明的方法和产品能够获得改善肿瘤微环境的单一组分，具备显著的效果。

本发明提供一种用于预防和/或治疗肿瘤的香菇多糖粉体提取工艺。本发明的工艺对现有技术中粗多糖中的成分进行细分，筛选出具有改善肿瘤微环境的组分，恢复机体抗肿瘤免疫力，预防肿瘤发生免疫逃逸。

在一些实施方案中，本发明提供一种香菇多糖的提取方法，所述方法包括使含有香菇多糖的溶液或粗提香菇多糖粉与不同浓度的醇溶液接触而沉淀香菇多糖的步骤。

作为起始组分，本发明中可以采用本领域香菇多糖的粗提溶液或粗提香菇多糖沉淀物进行，所述粗提溶液或粗提香菇多糖沉淀物或粗提粉末可以为通过本领域任意已知的方法获得的粗提物。

在一些实施方案中，用于沉淀香菇多糖的醇溶液可以包括多个浓度，例如包括2-20个浓度，例如2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20个不同浓度。在本文中，除非另有明确说明，提及醇浓度是指体积比浓度。在一些实施方案中，所述不同浓度之间的差别可以是例如5％，10％，15％，20％，25％，30％，40％，50％，或更高。在一些实施方案中，所述浓度差异可以是不同的，例如第一个浓度和第二个浓度之间的差异为10％，第二个浓度和第三个浓度之间的差异为5％等等。

在一些实施方案中，本发明的方法中使用的不同浓度的醇溶液包括至少3个不同浓度，例如至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20个不同浓度。在一些实施方案中，优选通过浓度先从高到低，再从低到高的顺序与含有香菇多糖的溶液接触，以沉淀香菇多糖。

在一些实施方案中，本发明的方法中所述醇溶液在混合溶液中的终浓度(v/v)可以选自90％-10％，例如90％，80％，70％，60％，50％，40％，30％，20％，10％，15％，25％，35％，45％，55％，65％，75％，85％，以及它们任意之间的浓度范围。在一些实施方案中，根据需要，还可以选择比上述浓度范围更高或更低的浓度。例如，本发明的采用三个浓度的实施方案中，与香菇多糖的粗提取液第一个终浓度可以是65-80％，第二个浓度可以是30-50％，第三个浓度可以是75-85％。在一些实施方案中，本发明的方法可以采用四个不同醇浓度进行，例如与香菇多糖的粗提取液第一个终浓度可以是65-80％，第二个浓度可以是45-55％，第三个浓度可以是25-55％，第四个浓度可以是75-85％。在一些实施方案中，本发明的方法可以采用五个不同醇浓度进行，例如与香菇多糖的粗提取液第一个终浓度可以是65-90％，第二个浓度可以是45-55％，第三个浓度可以是25-45％，第四个浓度可以是45-55％，第五个浓度可以是75-90％。在一些实施方案中，本发明的方法可以采用六个不同醇浓度进行，例如与香菇多糖的粗提取液第一个终浓度可以是65-75％，第二个浓度可以是45-55％，第三个浓度可以是25-35％，第四个浓度可以是35-45％，第五个浓度可以是45-55％，第六个浓度可以是75％-85％。在一些实施方案中，本发明的方法可以采用七个不同醇浓度进行，例如与香菇多糖的粗提取液第一个终浓度可以是70-90％，第二个浓度可以是50-60％，第三个浓度可以是20-40％，第四个浓度可以是40-50％，第五个浓度可以是50-60％，第六个浓度可以是60％-70％，第七个浓度可以是70％-90％，等等。在一些实施方案中，如果已经获得香菇多糖的粗提沉淀物，可以从上述浓度范围的第二个浓度开始，即将所述香菇多糖的粗提沉淀物分别按顺序与第二、三、四个或更多浓度的醇溶液接触。

在一些实施方案中，用于沉淀香菇多糖的醇不受特别限制。在一些实施方案中，优选的醇包括甲醇，乙醇，异丙醇或它们的组合。在一些实施方案中，可以使用包含添加剂的醇溶液，例如含有添加剂的乙醇溶液，其中所述添加剂可以选自甲醇，异丙醇，甲基乙基酮，甲基异丁基酮。在一些实施方案中，优选所述醇溶液为乙醇溶液。

在一些实施方案中，作为初始组分的香菇多糖可以是粗提香菇多糖溶液或粗提香菇多糖沉淀物或粗提香菇多糖粉末。在一些实施方案中，用于获得所述粗提香菇多糖的方法没有特别限制，例如可以通过沸水浸提，碱液提取，聚乙二醇提取，超声，超高压提取或它们的组合方法获得。在一些实施方案中，可以通过沸水提取获得所述香菇多糖粗提物。在一些实施方案中，可以通过多次沸水提取获得所述香菇多糖粗提物。在一些实施方案中，在沸水提取后可以加入酸或碱，例如可以加入三氯乙酸溶液反应，和/或加入碱溶液。在一些实施方案中，获得的香菇多糖粗提溶液可以进行过滤和/或透析。在一些实施方案中，获得的香菇多糖粗提溶液可以加入醇例如乙醇(例如终浓度为65-90％的乙醇)进行沉淀，任选的包括干燥步骤，获得香菇多糖粗提物。在一些实施方案中，上述加入醇例如乙醇(例如终浓度为65-90％的乙醇)进行沉淀的步骤作为本发明方法的第一个乙醇浓度。

在一些实施方案中，本发明的方法中可以根据需要进行洗涤，纯化，和/或干燥步骤，包括例如层析方法进行纯化的步骤，和/或例如冷冻干燥或喷雾干燥步骤。

在一些实施方案中，本文还提供通过本发明的方法获得的香菇多糖，如le58。在一些实施方案中，已经证明通过本发明的方法获得的香菇多糖具有更高的肿瘤防治活性。在一些实施方案中，本文还提供通过本发明的方法获得的香菇多糖用于预防和/或治疗肿瘤的用途，包括用于制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的用途。香菇多糖用于预防和/或治疗肿瘤的活性是本领域已知的，例如其可以用于预防和/或治疗肝细胞癌、乳腺癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌等等。

在一些实施方案中，本文还提供包含本发明的方法获得的香菇多糖的组合物。在一些实施方案中，所述组合物可以是药物或食品组合物，例如保健品和功能饮料等。

在一些实施方案中，本文提供一种试剂盒，其可以包括例如不同浓度的如上文描述的醇溶液，用于方便的提取香菇多糖。在一些实施方案中，所述试剂盒包括使用本发明的方法的说明书。

在一些实施方案中，本文提供不同浓度的如上文描述的醇溶液用于提取香菇多糖的用途。

在一些实施方案中，本发明与现有技术获得的香菇多糖相比具有下列优点和效果：

本发明用于预防肿瘤和辅助治疗肿瘤的香菇多糖粉体提取工艺，对粗多糖中的成分进行细分，采用多步提取步骤，获得目标组分，该组分以解除免疫负调控细胞对免疫效应细胞的抑制，恢复免疫监视的单一组分为目标，使获得的产品在改善肿瘤微环境方面更显著。

附图说明

图1：香菇多糖le58恢复了cd4+t细胞的增殖。

图2：香菇多糖le58对肺癌的体内抑制效应。

图3：本发明的方法获得的香菇多糖的脾细胞增殖效应显著大于普通方法获得的香菇多糖的刺激效应。

图4：本发明的方法获得的香菇多糖的抗肿瘤效应显著大于普通方法获得的香菇多糖。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述。

实施例1：

本发明的用于预防肿瘤的香菇多糖粉体提取工艺，包括：

一、取1kg香菇(lentinusedodes(berk.)sing.)，加入水10l，沸水提取，时间3小时，共计提取2次。每次的提取液经过滤后合并，加热浓缩至小体积，对流动水透析48小时，透析内液浓缩后离心，1∶1(v/v)加入30％的三氯乙酸溶液，在4℃条件下反应4小时，加10％naoh溶液中和至ph7左右，扎袋对流动水透析48小时，透析内液浓缩后离心，上清液加入3倍体积的95％乙醇，静置过夜。离心收集沉淀，于40℃干燥，得粗多糖。

二、将步骤一提取的粗多糖10g融于1l水中，加入1l乙醇(50％醇沉)，4℃静置过夜；

三、将步骤二中溶液分装至50ml的离心管中，在10000rpm离心速率下处理5分钟；

四、收集经步骤三中的沉淀，分装于10管50ml离心管中，分别加入11ml水，充分溶解，10000rpm离心速率下处理5分钟；得上清，分装于50ml离心管中(共5管)，分别加入无水乙醇(30％醇沉)，充分振荡，10000rpm离心5分钟；

五、将步骤四的上清分装于50ml离心管(共5管)，分别加入乙醇(40％醇沉)，4℃静置过夜；

六、收集步骤五的醇沉上清于50ml离心管(5管)，分别加入乙醇(50％醇沉)，10000rpm离心5分钟；

七、收集步骤六的醇沉上清约200ml于1000ml烧杯中，加入无水乙醇(终浓度80％)醇沉，收集沉淀于50ml离心管，真空低温冷冻干燥获得所述香菇多糖粉体。将其命名为le58。

实施例2：本发明提取的香菇多糖le58对免疫抑制性细胞的逆转效应

如附图1所示，均为流式细胞检测图，图1中(a)为正常脾细胞；图1中(b)为脾细胞中的cd4+t细胞在刀豆蛋白(cona)刺激下产生增殖峰；图1中(c)为免疫抑制细胞(髓源抑制性细胞)抑制了cd4+t细胞的增殖；图1中(d)为香菇多糖le58恢复了cd4+t细胞的增殖。

将balb/c小鼠脾细胞制备成单细胞悬液，接种于细胞培养96孔板中(u型底)，细胞接种密度为3×105/孔，同时依次分别加入cona、髓源抑制性细胞msc2、香菇多糖le58，cona浓度为1.5μg/孔，msc2细胞数为9×103/孔，多糖le58浓度为0.2mg/ml。培养3天后，流式细胞学检测cd4+t细胞增殖情况，结果显示，脾细胞+cona+msc2组中，cd4+t细胞增殖受到抑制，在该体系中加入香菇多糖le58，cd4+t细胞恢复增殖。经两者比较说明，本发明对免疫抑制性细胞(msc2)具有解除其免疫抑制的效应。

实施例3：本发明提取的香菇多糖le58对肺癌的体内抑制效应

如附图2所示，菱形图标对应的线为对照组肺癌荷瘤小鼠生存曲线；矩形图标对应的线为香菇多糖le58组肺癌荷瘤小鼠生存曲线。将llc路易斯肺癌细胞接种于c57小鼠腹部皮下，接种细胞数为1×106/只，构建肺癌皮下移植瘤模型，10天后，肿瘤形成，采用香菇多糖le58进行腹腔注射，剂量为25mg/kg体重。经两者比较说明，本发明对肺癌的生长具有一定抑制效应。

实施例4：

对比试验1

非本专利工艺提取多糖：取1kg香菇(lentinusedodes(berk.)sing.)，加入水10l，沸水提取，时间3小时，共计提取2次。每次的提取液经过滤后合并，加热浓缩至小体积，对流动水透析48小时，透析内液浓缩后离心，1∶1(v/v)加入30％的三氯乙酸溶液，在4℃条件下反应4小时，加10％naoh溶液中和至ph7左右，扎袋对流动水透析48小时，透析内液浓缩后离心，上清液加入3倍体积的95％乙醇，静置过夜。离心收集沉淀，于40℃干燥，得到用作对照的普通多糖。实验结果显示对照多糖对脾细胞的刺激增殖作用不如本专利工艺提取的香菇多糖。

实验方法为mtt，测定细胞增殖，纵坐标od450值越高，代表细胞活性及细胞数越多，而本专利提取香菇多糖在100μg/ml时，作用24小时后，脾细胞增殖效应明显大于普通香菇多糖的刺激效应。

对比实验2：

调节性t细胞(tregs)抑制效应t细胞对肿瘤的杀伤，而本专利提取香菇多糖可以下调荷瘤小鼠脾脏中tregs的比例，提示具有辅助抗肿瘤效应，而普通香菇多糖未见该效应(参见图4)。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。