快速检测百合灰霉病致病病原菌灰葡萄孢的方法与流程

本发明涉及病原真菌鉴定技术领域，涉及一种用于快速检测百合灰霉病致病病原菌灰葡萄孢的特异性扩增引物对。

背景技术：

百合是百合科(liliaceae)百合属(liliumspp.)多年生草本球根植物。百合是较易感病的植株，其中百合灰霉病是危害百合较为严重的病害之一，严重危害百合的生长及品质，对叶片及花蕾危害最为严重，随着带菌种球栽植面积的逐渐扩大和常年连作的种植方式，病害发生程度日趋严重，危害范围逐渐扩大，成为严重危害百合生产中的重要病害之一(朱丽梅等，2009；2012)。

灰霉菌是引起百合灰霉病的病原菌，灰葡萄孢(botrytiscinerea)是主要的病原菌之一，叶缘干枯型发主要致病菌为灰葡萄孢，分离率为93.7％。灰霉菌主要危害的是百合叶片，由叶片或叶缘开始逐渐向整个叶片发病，在叶片上形成圆形或者椭圆形病斑，病斑呈褐色，最后使叶片畸形枯死，甚至整个叶片干枯、坏死。潮湿环境时，病斑有灰色霉层，后有黑色菌核生成。茎部染病时出现黄褐色或者红褐色条形病斑，茎基部缢缩、倒折，形成“一边倒”弯曲势，叶片沿茎基部逐渐向上枯萎脱落，鳞茎染病可引起整个植株腐烂(徐琼等，2006)。

真菌鉴定主要有传统真菌形态学鉴定和分子生物学鉴定。传统的真菌形态学鉴定周期长，过程复杂，而且专业性强，操作人员主观意识较强。分子生物学鉴定主要采用真菌rdna-its序列设计的通用引物，its1(5’-tccgtaggtgaacctgcgg-3’)、its4(5’-tcctccgcttattgatatgc-3’)、its5(5’-ggaagtaaaagtcgtaacaagg-3’)进行扩增(whiteetal.，1990；陈凤毛，2007)，由于可扩增出大多数担子菌和子囊菌，特异性不强，因此还需要进一步测序进行比对，鉴定周期长，测序费用昂贵，给病菌鉴定带来一些困难，因此存在缺陷，需要提高改进。

本专利提供了快速扩增百合灰霉病病原菌灰葡萄孢的特异性扩增引物对，可一次扩增反应快速准确检测出百合灰葡萄孢致病菌，缩短鉴定周期，降低检测费用。

主要参考文献：

1)朱丽梅，侯建文，罗凤霞，蒋倩倩.百合灰霉病的诊断及其病原物的分离纯化[j].金陵科技学院学报，2009，25(3)：59-63.

2)朱丽梅，罗凤霞，李明凤，殷英.底特律等8个百合品种对百合灰霉病的抗病性鉴定[j].江苏农业科学，2012，40(5)：81-83.

3)徐琼，徐秉良，王芳.观赏百合叶枯病症状类型与病原菌鉴定[j].植物保护，2006，32(5)：61-64.

4)whitetj，brunst，lees.analysisofphylogeneticrelationshipsbyamplificationanddirectsequencingofribosomalrnagenes[c].pcrprotocoisagudietomethosandapplications，newyork：academic，1990，15-22.

5)陈凤毛.真菌its区序列结构及其应用[j].林业科技开发，2007，(2).

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种快速检测百合灰霉病致病病原菌灰葡萄孢的特异性引物对，快速鉴定的分子方法。

本方案发明技术方案如下：

1、ctab法提取真菌dna

2、用于检测百合灰霉病病原菌的特异性引物对的pcr扩增

根据特异性序列设计灰葡萄孢的特异性引物对b.cinf/b.cinr，进行pcr扩增，快速扩增出灰葡萄孢的特异性目的条带。

附图说明

图1是利用通用引物对its1、its4对多种真菌进行pcr扩增的检测结果图。图1中m泳道为markeri，片段大小为600bp、500bp、400bp，1泳道为通用引物对灰葡萄孢病原菌扩增的pcr产物，2泳道为通用引物对牡丹葡萄孢病原菌扩增的pcr产物，3泳道为通用引物对尖孢镰刀菌扩增的pcr产物，4泳道为通用引物对普通青霉菌扩增的pcr产物，5泳道为通用引物对恶疫霉扩增的pcr产物，6泳道为通用引物对水扩增的pcr产物，作为阴性对照(negativecontrol)。

图2是利用特异性引物对b.cinf/b.cinr对多种真菌进行pcr扩增的检测结果图。图2中m泳道为markeri，片段大小为600bp、500bp、400bp，1泳道为引物对b.cinf/b.cinr对灰葡萄孢病原菌的pcr扩增产物，片段长度为742bp，2泳道为引物对b.cinf/b.cinr对牡丹葡萄孢病原菌的pcr扩增产物，3泳道为引物对b.cinf/b.cinr对尖孢镰刀菌的pcr扩增产物，4泳道为引物对b.cinf/b.cinr对普通青霉菌的pcr扩增产物，5泳道为引物对b.cinf/b.cinr对恶疫霉的pcr扩增产物，6泳道为引物对b.cinf/b.cinr对水扩增的pcr产物，作为阴性对照。

图3是引物对b.cinf/b.cinr对灰葡萄孢pcr扩增的目的序列，长度为742bp。

具体实施方式

1、利用ctab法提取真菌dna

(1)病原菌的分离、纯化、液体培养

采用感病叶片，75％酒精浸泡震荡15s，升汞处理12min，用无菌水冲洗3次，每次一分钟，常规组织分离法，取叶片病健交界处组织进行分离，置于pda培养基中央，25℃，黑暗培养。5天后，用接种环将真菌菌落边缘菌丝挑取pda培养基，25℃，黑暗培养。重复上一步骤，直至pda培养基上生长出单一种形态菌落。在超净工作上，挑取培养3-4天的菌落边缘菌丝放入马铃薯葡萄糖液体培养基中。将液体培养基放入摇床中培养，温度25℃，转速180r/min，震荡培养3-4d。用无菌纱布过滤菌液，再用无菌水冲洗留在纱布上的菌丝，以洗去菌丝上的培养基，收集菌丝。用无菌纱布吸干菌丝上的水分，液氮研磨成粉，备用。

(2)ctab提取dna

①取0.2g液氮研磨好的菌丝粉，加入650μl的2％ctab提取缓冲液(20mmol/ledta，1.4mol/lnaci，100mmol/ltris-hcl)转入1.5ml离心管中，迅速混匀后65℃，水浴1h(期间每隔15min上下颠倒震荡一次)。

②水浴结束后取出冷却至室温，12000rpm，离心10min。

③离心后取上清于另一离心管中，加入等体积氯仿-异戊醇(24∶1)，混匀后12000rpm，离心10min。

④重复上一步。

⑤吸取上清，加入等体积无水乙醇(-20℃预冷)，混匀后-20℃静置，沉淀30-60min。

⑥12000rpm，离心10min，弃上清，离心出的沉淀加入75％乙醇1ml洗涤，6000rpm，离心5min，重复2次。

⑦室温或超净工作台中放置15-30min，使dna干燥，加入40-80μl的ddh2o溶解dna，于-20℃保存备用。

2、利用通用引物对its1/its4对不同属的真菌进行pcr扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳检测，如图1所示，从检查结果中能够看到不同属真菌均扩增出条带。

3、本实施方式用于快速检测灰葡萄孢的种特异性引物对命名为b.cinf/b.cinr，利用引物对b.cinf/b.cinr对不同属的真菌进行pcr扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2所示，从检测结果中能够清楚的看到扩增出一条约为742bp的明显特异性条带，该特异性目的条带序列如图3所示。