本发明涉及生物医药技术领域，尤其是涉及土鳖虫多糖的提取方法。
背景技术：
土鳖虫，其入药使用历史悠久，是传统活血化瘀类动物药。土元性寒、味咸且有微毒，其味能入肝、心、脾三经、消肿止痛，主治关节炎、跌打损伤，并对癌症有一定疗效。土鳖虫在我国南方分布较广，如福建、广东等，药材主产区为河北、山东、福建、广东、广西等地。多糖是重要的信息分子，参与机体多种生命活动。大量研究证实多糖具有多种生物学功效，如抗病毒、抗肿瘤、降血糖、降血脂和免疫调节等。多糖类化合物在保健、医药、化妆品和食品添加剂等领域具有广泛的应用前景。运用现代的科学手段研究黑耳多糖的提取工艺对木耳资源的深度开发有促进作用，提高了农副产品的经济效益。
现有技术如授权公告号为cn103819575b的中国发明专利，公开了一种土鳖虫多糖的提取方法，该方法通过添加复合酶来提取土鳖虫多糖，和热水浸提相比，该法提取率高，但还是不能满足实际的需要，且所获得的多糖纯度低。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种土鳖虫多糖的提取方法，该方法克服了现有技术提取率低、纯度低的缺点。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：土鳖虫多糖的提取方法，包括脱脂，酶解，脱蛋白，醇沉干燥。方法合理，操作简单，提取率高，所获得的土鳖虫多糖活性好，降低了生产成本，为工业化应用提供了有利条件。
作为优选，脱脂过程中，采用中药粉碎机对干燥土鳖虫进行粉碎，经粉碎后过40-45目筛，放于55℃-60℃恒温箱内干燥40-50min，取2-4份土鳖虫粉末，加入15-20份石油醚，25-30℃下浸泡9-11h，过滤，将滤渣于52-58℃干燥13-16h。对土鳖虫进行脱脂处理，避免了脂质对多糖纯度的影响，提高了多糖的品质，使产品的生物活性得到了提高，增加了工艺的经济价值。
作为优选，酶解过程中，将1-3份脱脂后的土鳖虫粉末、10-15份水和3-5份活性短肽混合，加入木瓜蛋白酶，加入量为40-80iu/g，在ph为7-8，温度为45-55℃下酶解30-40min，灭酶活，过滤。蛋白酶作用的肽键范围广泛，可以有效地断裂多糖与蛋白质之间的糖肽键，促进多糖的释放，提高多糖的提取率，使土鳖虫资源得到充分的利用。
作为优选，酶解过程中所加入的活性短肽的氨基酸序列为：hshacasysccvcvncsr。所加入的活性短肽在土鳖虫细胞膜上构建了传质通道，增大了细胞膜的通透性，促进了木瓜蛋白酶与细胞内组分的接触，加快了糖肽键的断裂，提高了多糖释放的效率。
作为优选，脱蛋白过程中，将三氯甲烷和正丁醇配制成混合液，其中体积比三氯甲烷/正丁醇=3.5/1-3.7/1，取1-3份酶解过程所得的滤液，向其中加入14-18份所配置的混合液，搅拌32-40min，离心分离，取水相。酶解过程中所得的滤液含有许多游离蛋白质，使多糖的纯度降低，加入三氯甲烷和正丁醇的混合液后，蛋白质会形成沉淀从溶液中析出，提高多糖的纯度，增加了多糖的品质。
作为优选，醇沉干燥中，向脱蛋白过程所得的水相中加入22-26份86%-93%的乙醇溶液，搅拌16-26min，过滤，设置真空度为3000-5000pa，温度为62-70℃，将滤渣干燥25-36min得多糖提取物。多糖不溶于高浓度的乙醇，在加入86%-93%的乙醇溶液后，土鳖虫多糖以沉淀的形式析出，实现了产物的分离，为多糖的实际应用提供了条件。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明采用木瓜蛋白酶对经过脱脂处理的土鳖虫进行酶解，有效地断裂了多糖与蛋白质之间的糖肽键，极大地促进了多糖的释放，提高了溶液中多糖的含量，加快了多糖传质的速率，增大了多糖的提取率；三氯甲烷和正丁醇的混合液的加入，使多糖溶液中所含有的蛋白质以沉淀的形式析出，提高了多糖的纯度，方法合理，操作简单，降低了生产成本，为工业化应用提供了有利条件。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步说明：
实施例1：
土鳖虫多糖的提取方法，包括以下步骤：首先是脱脂：采用中药粉碎机对干燥土鳖虫进行粉碎，经粉碎后过40目筛，放于55℃恒温箱内干燥40min，取2份土鳖虫粉末，加入15份石油醚，25℃下浸泡9h，过滤，将滤渣于52℃干燥13h。对土鳖虫进行脱脂处理，避免了脂质对多糖纯度的影响，提高了多糖的品质，增加了工艺的经济价值；接着是酶解：将1份脱脂后的土鳖虫粉末、10份水和3份活性短肽混合，加入木瓜蛋白酶，加入量为40iu/g，在ph为7，温度为45℃下酶解30min，酶解结束后在温度为95℃下持续15min灭酶活，以孔径为70nm的陶瓷膜过滤，取滤液。蛋白酶作用的肽键范围广泛，可以有效地断裂多糖与蛋白质之间的糖肽键，促进多糖的释放，提高多糖的提取率；接着是脱蛋白：将三氯甲烷和正丁醇配制成混合液，其中体积比三氯甲烷/正丁醇=3.5/1，取1份酶解过程所得的滤液，向其中加入14份所配置的混合液，搅拌32min，在4200r/min下离心分离10min，取水相。酶解过程中所得的滤液含有许多游离蛋白质，使多糖的纯度降低，加入三氯甲烷和正丁醇的混合液后，蛋白质会形成沉淀从溶液中析出，提高多糖的纯度；最后是醇沉干燥：向脱蛋白过程所得的水相中加入22份86%的乙醇溶液，搅拌16min，过滤，设置真空度为3000pa，温度为62℃，将滤渣干燥25min得多糖提取物。多糖不溶于高浓度的乙醇，在加入86%的乙醇溶液后，土鳖虫多糖形成沉淀，实现了产物的分离。
实施例2：
土鳖虫多糖的提取方法，包括以下步骤：
1)脱脂：对干燥土鳖虫进行粉碎，过45目筛，置于60℃下干燥50min，取4份土鳖虫粉末，加入20份石油醚，30℃下浸泡11h，过滤，将滤渣于58℃干燥16h。对土鳖虫进行脱脂处理，避免了脂质对多糖纯度的影响，提高了多糖的品质，使产品的生物活性得到了提高，增加了工艺的经济价值；
2)酶解：将3份脱脂后的土鳖虫粉末、15份水和5份活性短肽混合，加入木瓜蛋白酶，加入量为80iu/g，在ph为8，温度为55℃下酶解40min，灭酶活，过滤。蛋白酶作用的肽键范围广泛，可以有效地断裂多糖与蛋白质之间的糖肽键，促进多糖的释放，提高多糖的提取率，使土鳖虫资源得到充分的利用；
3)脱蛋白：将三氯甲烷和正丁醇配制成混合液，其中体积比三氯甲烷/正丁醇=3.7/1，取3份酶解过程所得的滤液，向其中加入18份所配置的混合液，搅拌40min，离心分离，取水相。酶解过程中所得的滤液含有许多游离蛋白质，使多糖的纯度降低，加入三氯甲烷和正丁醇的混合液后，蛋白质会形成沉淀从溶液中析出，提高多糖的纯度，增加了多糖的品质；
4)醇沉干燥：向脱蛋白过程所得的水相中加入26份93%的乙醇溶液，搅拌26min，过滤，设置真空度为5000pa，温度为70℃，将滤渣干燥36min得多糖提取物。多糖不溶于高浓度的乙醇，在加入93%的乙醇溶液后，土鳖虫多糖以沉淀的形式析出，实现了产物的分离，为多糖的实际应用提供了条件。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
sequencelisting
<110>浦江县泰如食品科技有限公司
<120>土鳖虫多糖的提取方法
<130>1
<160>1
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>18
<212>prt
<213>人工合成
<400>1
hisserhisalacysalasertyrsercyscysvalcysvalasncys
151015
serarg