表达PEDV的S+N双基因的真核表达载体的制作方法

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种表达pedv的s+n双基因的真核表达载体。

背景技术：

猪流行性腹泻(porcineepidemicdiarrheaped)是由猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus，pedv)引起的以腹泻、呕吐、脱水和对哺乳仔猪高致死率为主要特征的一种高度接触性肠道传染病，是导致世界各养猪国家仔猪早期死亡的重要疫病之一。该病自1971年英国首次报道，随后世界各国均有发生，我国于1980年首次报道该病以来，全国各地陆续有ped发生的报道。随着pedv灭活疫苗、弱毒疫苗和单基因核酸疫苗的陆续问世和应用，ped在一定程度上得到控制，但还是仍有发生。随着10多年的光阴流逝，近年来，由于pedv的基因变异，导致再次爆发席卷全球，于2007年开始首先在泰国、韩国和越南等国家流行，随后于蔓延至中国、日本和美国等养猪国家。由于该病来势凶猛，且临床症状比以往更为严重，发病率高达100％，死亡率在80％以上，尤其是对7日龄以内的哺乳仔猪，死亡率高达100％，危害极大。pedv含有4个结构蛋白，分别为s、m、n及e蛋白。有关研究表明，变异pedv的s基因与attenuateddr13弱毒株和cv777标准株的同源性分别为93.7％～94.1％和93.8％～94.1％，同cv777标准株比较，存在64个氨基酸突变，其中有3个氨基酸较以往国内外流行毒株不一样，为新变异新氨基酸，5氨基酸的插入和2个氨基酸缺失；虽然n基因比较保守，但也存在氨基酸变异。基于目前变异pedv为新的流行毒株，因此建立相应的诊断技术及研制新型基因工程疫苗意义重大。目前，已见通过pedv的单个基因如n、s及m基因段片，通过原核表达方法表达出单基因蛋白，但未见通过pedv的s和n基因片段，利用blunt-m2哺乳动物真核表达载体，通过无缝克隆技术，构建出pedv的s+blunt-m2+n的融合双基因真核表达载体。因此，一种构建pedv的s+n融合双基因表达载体方法的建立，对今后开展该病的诊断技术及基因工程疫苗研究，具有重要意义和应用前景。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种表达pedv的s+n双基因的真核表达载体及其制备方法。

本发明是这样实现的：

本发明首先提供了一种表达pedv的s+n双基因的真核表达载体，其包含如seq.id.no：1所示的核苷酸序列。

所述真核表达载体的制备方法，包括如下步骤：

(1)分析pedv的s基因序列并截取具有中和抗原表位的基因片段，根据截取的pedv的s基因序列，结合n基因及peasy-blunt-m2载体基因的序列，设计与合成特异性引物；

(2)以pedv的cdna为模板，通过pcr技术分别出扩增s与n基因片段，并进行回收纯化；

(3)将纯化的s基因片段连接到blunt-m2载体上，构建出s+blunt-m2质粒；

(4)以s+blunt-m2质粒为模板，扩增质粒的基因片段，回收纯化s+blunt-m2基因片段，采用peasy-uniseamlesscloningandassemblykit，通过无缝克隆技术将s+blunt-m2基因与n基因片段进行重组连接，将连接产物再转化至trans1-t1感受态细胞中，涂布于氨苄青霉素抗性的lb培养基进行培养后，提取s+blunt-m2+n质粒进行测序鉴定，构建出表达pedv的s+n双基因的真核表达载体。

所述pedv指的是变异猪流行性腹泻病毒。

其中步骤(1)所述特异性引物序列如下：

a、s

s-f:atggttactttgccatcattcaa

s-r:agaaacgtccgtgacacctt

b、s+m2

m2-f:aagggcgatccggaacaaaaa

m2-r:agaaacgtccgtgacacctt

c、n

n-f:aaggtgtcacggacgtttctgcttctgtcagctttcagga

n-r:tttttgttccggatcgcccttatttcctgtatcgaagatct。

本发明还提供了构建的真核表达载体在制备pedv疫苗中的应用。

本发明具有如下优点：本发明是直接将纯化pedv的s基因片段连接到blunt-m2哺乳动物真核表达载体中，不需要连接至单克隆载体pmd19-t中，然后s+blunt-m2质粒通过无缝克隆技术，拼接n基因片段，从而获得s+n双基因融合表达载体。因此，该真核表达载体的制备比较其他真核表达技术，具有操作步骤简单、反应时间短等特点，适合双基因融合蛋白表达。

附图说明

下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。

图1是s基因片段扩增结果。

图2是s+m2阳性克隆鉴定结果。

图3是s+m2和n片段分别pcr扩增结果。

图4是s+m2和s+n片段无缝拼接的菌落pcr鉴定结果。

图5是大量表达m2-s+nwb结果图；图中标号：1空载质粒(m2)，2构建质粒(s+m2+n)，3未转染的细胞后，m蛋白marker。

具体实施方式

实施例1

实施本发明的技术前需要克服以下技术难题：引物设计，分析pedv的s基因序列并截取具有较多中和抗原表位的基因片段，根据截取pedv的s基因序列，结合n基因及blunt-m2载体基因的序列，设计与合成特异性引物。

生物材料来源：peasy-bluntm2表达载体、peasy-uniseamlesscloningandassemblykit均购自北京全式金生物技术有限公司。

一、根据pedv的s和n基因及blunt-m2+m质粒序列，设计合成相关扩增引物，序列如下表1。

表1引物序列

二、rt反应：以pedv(该病毒株来源于2013年福建某规模猪场发生pedv的哺乳小猪的小肠，将小肠用pbs液研磨，吸取上清，采用商品化试剂盒提取rna)的rna为模板，进行反转录，合成cdna,其体系如下表2。

表2反转录体系

反应条件：25℃10min；50℃30min；85℃5s。

三、s片段的pcr扩增：以cdna为模板，进行pcr扩增，扩增体系如下表3。

表3m片段的pcr扩增体系

反应条件如下：

通过1.5％琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物，获得目的片段423bp，如图1所示。

四、s基因片段连接至m2载体

1、连接体系如下：2.0μls片段，1.0μlblunt-m2载体，使用ddh2o补齐体积至5.0μl,25℃连接10min；

2、连接产物转化至trans1-t1感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30min；

3、42℃热激30s，立即置于冰上2min；

4、加入平衡至室温的lb培养基，250rpm，37℃培养1h；

5、4000rpm离心1min，弃掉部分上清，保留100μl，轻弹重悬后涂于amp+抗性平板上，37℃培养过夜；

6、分别挑单克隆菌株至10μl无菌水中，涡旋混匀后进行pcr鉴定，反应体系如下表4。

表4pcr反应体系

反应条件如下：

7、使用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳检测，发现目的片段579bp，如图2所示。取阳性菌落送测序公司测序，之后进行序列比对，取比对目的质粒作为模板进行pcr扩增，获得线性载体。

五、s+m2片段的pcr扩增

以s+m2质粒为模板，进行扩增，扩增体系如下表5。

表5扩增体系

反应体系如下，使用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物，获得目的条带，如图3所示。

六、n片段的pcr扩增

以pedv的cdna为模板，进行扩增，扩增体系如下表6。

表6扩增体系

反应体系如下,使用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物,获得目的片段，如图3所示。

七、纯化片段

分别胶回收纯化pcr扩增的n片段和pcr扩增的s+m2片段，采用纯化试剂盒进行纯化。

八、无缝拼接

1.以peasy-uniseamlesscloningandassemblykit推荐体系进行重组反应，连接体系如下：2×assemblymix5μl；纯化回收n片段2μl；纯化回收s+m2片段3μl；于pcr仪中50℃连接15min；

2.连接产物全部转化trans1-t1感受态细胞中；

3.42℃热激30s，冰上静置2min，加入400μllb培养基中，37℃200rpm摇菌1h；

4.取摇好的菌液4000rpm离心1min后弃部分上清，取菌株吹悬后涂于含amp+抗性的lb平板上，在37℃培养箱里培养过夜；

5.18h后从培养箱中取出平板，随机挑取转化后生长的感受态，菌落pcr鉴定阳性单克隆，获得目的片段如图4所示；

6.阳性克隆摇菌后测序，核苷酸序列如seq.id.no：1所示。

同源性在98.0％，说明拼接重组准确,获得pedv的s+blunt-m2+n融合双基因真核表达载体。

九、大提质粒

取测序正确s+m2+n的活菌经过活化后转接入lb氨苄抗性培养基，放入摇床37℃、200rpm培养16h后，收集菌液提取质粒。

十、转染

(1)细胞接种

将293t细胞接种至细胞培养平皿中，培养12-24h，使转染时细胞密度达到70％汇合度；

(2)质粒和转染试剂的稀释

经去内毒素s+m2+n质粒和m2空载质粒，质粒稀释于50μlopti-mem培养基中，transinel转染试剂加入量为16μl，将转染试剂加入上述含有稀释质粒的opti-mem培养基中，轻柔混匀室温静置20min；

(3)转染

分别将加培养基、含空载质粒-transinel转染试剂混合物和含s+m2+n质粒-transinel转染试剂混合物加入细胞，于37℃co2培养箱培养，4h后更换培养基，培养至48h后，细胞没有出现萎缩脱落，说明细胞生长状态良好，不会影响蛋白的表达，然后提取细胞总蛋白。

十一、wb验证目的蛋白的表达情况

细胞总蛋白提取

收集构建质粒(s+m2+n)和空载质粒(m2)转染细胞及未转染的细胞后，分别提取细胞总蛋白，测定蛋白浓度为4.35mg/ml。

使用分离胶浓度为10％的胶进行sds-page电泳，上样品为20ug,200v恒压电泳45min。

转膜：使用pvdf膜进行转膜，100v恒压转膜1h。

封闭：使用5％的脱脂牛奶(0.5％tbst稀释)，37℃封闭2h。

一抗孵育：使用0.5％tbst稀释一抗(pedv兔抗高免血清)，稀释比例为1:4000，4℃过夜孵育。

洗涤：使用tbst洗涤4次，每次10min。

二抗孵育：使用0.5％tbst稀释二抗(pedv抗兔hrp酶)，稀释比例1:4000，室温晃动孵育2h。

显色：使用tbst洗4次，每次10min，采用化学发光成像仪进行检测，成功获得表达蛋白目的片段65kd左右，如图5所示。表达蛋白对pedv兔抗高免血清具有反应，说明表达蛋白具有免疫原性。

虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。

sequencelisting

<110>福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<120>表达pedv的s+n双基因的真核表达载体

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<170>patentinversion3.3

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<212>dna

<213>人工序列

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ggttatgtgtctaattcacaggatagtaattgccctttcaccttgcaatctgttaatgat240

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