右旋糖苷在环介导等温扩增中的应用及其试剂盒和检测方法与流程

本发明属于生物技术领域，涉及右旋糖苷在环介导等温扩增中的应用，还涉及含有右旋糖苷的试剂盒和检测方法。

背景技术：

目前，原微生物的检测方法主要有分离培养鉴定法、聚合酶链式反应(pcr)法和荧光定量pcr(fq-pcr)法，但分离培养鉴定法操作繁琐、费时，pcr法和fq-pcr法需要昂贵的仪器和试剂，检测成本高，不适合中小型单位和现场检测应用。

环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification,lamp)技术与其它核酸扩增技术相比，可以在等温条件下快速、高效、特异地扩增靶序列，且操作简便，不需要昂贵的仪器和试剂，成本低，已在病原微生物检测领域显示出广阔的发展前景。但扩增过程中仍需要价格较高的dna聚合酶，如果能减少dna聚合酶的使用量将对进一步降低病原微生物检测成本具有重要意义。

克雷伯氏菌属(klebsiella)为革兰氏阴性杆菌。主要有肺炎克雷伯氏菌(k.peneumoniae)、臭鼻克雷伯氏菌(k.ozaenae)和鼻硬结克雷伯氏菌(k.rhinoscleromatis)。其中臭鼻克雷伯氏菌对家禽致病性较强，是重要的条件致病菌和医源性感染菌之一。由其引起的鸡鼻炎型克雷伯氏菌病是危害鸡、火鸡和山鸡等家禽和野禽的一种接触性传染病。该病发病率和死亡率通常在10～30％，但有的鸡场感染鸡鼻炎型克雷伯氏菌的病鸡死亡率高达75％。一旦某地区的鸡群发生鸡鼻炎型克雷伯氏菌感染，该病就会成为地方性疾病，很难彻底根除，并且经常反复爆发，带来巨大的经济损失。鸡鼻炎型克雷伯氏菌感染以引起慢性萎缩性鼻炎，有恶臭，以及败血症、泌尿系感染等为主要病理特征，在病理学上很难与副鸡嗜血杆菌性鼻炎感染进行区别。因此有必要建立一种低成本的检测鸡鼻炎型克雷伯氏菌病的方法。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供右旋糖苷在环介导等温扩增中提高酶稳定性同时缩短反应时间中的应用；本发明的目的之二在于提供含有右旋糖苷的环介导等温扩增的检测试剂盒，灵敏度高，特异性好，操作简便快速，结果准确可靠，检测成本低，适合中小型单位和现场检测应用；本发明的目的之三在于提供所述的试剂盒在病原微生物基于环介导等温扩增检测中的应用；本发明的目的之四在于提供基于环介导等温扩增检测鸡鼻炎型克雷伯氏菌的方法。

为实现上述发明目的，本发明提供如下检测方案：

1、右旋糖苷在环介导等温扩增中提高酶稳定性或/和缩短反应时间中的应用。

2、含有右旋糖苷的环介导等温扩增的检测试剂盒，包括如下组分：环介导等温扩增内引物和外引物，嗜热乳酸枯草芽孢杆菌dna聚合酶、10×热聚合反应缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸混合物、硫酸镁、甜菜碱、右旋糖苷和荧光染料赛博绿ⅰ；所述10×热聚合反应缓冲液由浓度为150-250mmol/l、ph为8.5-8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、浓度为50-100mmol/l的氯化钾、浓度为50-100mmol/l的硫酸铵、浓度为15-20mmol/l的硫酸镁和质量分数为0.5-1％的曲拉通x-100组成；所述三磷酸碱基脱氧核苷酸混合物由三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸和三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸组成。

上述试剂均为除内引物和外引物需要按照要求合成外，其余均常规试剂，可直接从商业渠道购得，通常在相关实验室中为常备试剂，故本发明试剂盒中可以不放入上述试剂，或仅放入上述试剂中的一种或几种，当然也可全部放入，提供多种选择以方便使用者购买。

优选的，所述环介导等温扩增内引物序列如seqidno.1和seqidno.2所示；所述外引物序列如seqidno.3和seqidno.4所示。

优选的，所述环介导等温扩增内引物浓度分别为5μmol/l；所述外引物浓度分别为20μmol/l。

优选的，所述嗜热乳酸枯草芽孢杆菌dna聚合酶浓度为8u/μl、所述三磷酸碱基脱氧核苷酸混合物中各组分浓度为10mmol/l、硫酸镁浓度为100mmol/l、甜菜碱浓度为2mol/l和荧光染料赛博绿ⅰ质量分数为10％，右旋糖苷浓度为4mol/l。

优选的，所述10×热聚合反应缓冲液由浓度为250mmol/l、ph为8.8的tris–hcl、浓度为100mmol/l的氯化钾、浓度为100mmol/l的硫酸铵、浓度为20mmol/l的硫酸镁和质量分数为1％的tritonx-100组成。

3、所述的试剂盒在病原微生物基于环介导等温扩增检测中的应用。

优选的，所述病原微生物为鸡鼻炎型克雷伯氏菌。

4、基于环介导等温扩增检测鸡鼻炎型克雷伯氏菌的方法，包括以下步骤：

a、提取待检样品的细菌dna作为模板dna，控制模板dna水溶液的od260/od280值为1.6～2.0，浓度为10～100ng/μl；

b、鸡鼻炎型克雷伯氏菌的环介导等温扩增：在反应管中配制环介导等温扩增反应体系，各组分终浓度如下：浓度各为0.1-0.2μmol/l的内引物，浓度各为0.5-0.8μmol/l的外引物，5-8u嗜热乳酸枯草芽孢杆菌dna聚合酶，1×热聚合反应缓冲液，浓度各为0.5-1mmol/l的三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸和三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸，浓度为2-3mmol/l的硫酸镁，浓度为0.25-0.5mol/l的甜菜碱，浓度为0.1～0.5mol/l的右旋糖苷，待检模板dna水溶液0.5-1μl，余量为水；将反应管于60～65℃水浴中保温反应20～30分钟，再于80～95℃水浴中保温3～5分钟终止反应；所述内引物序列如seqidno.1和seqidno.2所示；所述外引物序列如seqidno.3和seqidno.4所示；

c、显色检测：在反应管中加入质量分数为10％的荧光染料赛博绿ⅰ水溶液0.5-1μl，用肉眼观察颜色变化，如果颜色为黄色，说明待检样品中不含有鸡鼻炎型克雷伯氏菌；如果颜色变为绿色，说明待检样品中含有鸡鼻炎型克雷伯氏菌。

本发明的有益效果在于：本发明首次将右旋糖苷用于环介导等温扩增，能够显著提高酶的热稳定性的，使用浓度不大于0.5m时(以葡萄糖计)，可部分替代普通lamp试剂盒中(一半左右)价格昂贵的“聚合酶”和“甜菜碱”，可很好的促进高含量gc片段的扩增，可以将检测反应时间减少到20-30分钟，不仅节约成本，还缩短检测周期，对环介导等温扩增具有重要意义。本发明还公开含有右旋糖苷的试剂盒，该试剂盒鸡鼻炎型克雷伯氏菌16srrna(genbankaccessionno.eu376364)保守区的六个特异区域设计了两条特异性内引物和两条特异性外引物，从而保证了检测结果的可靠性；本发明基于环介导等温扩增技术检测鸡鼻炎型克雷伯氏菌，由四条引物对靶序列的六个特异区域进行识别，特异性强；在等温条件下扩增，不会因温度改变而造成时间损失，耗时短，在1小时内即可将靶序列扩增至10⁹倍，而且受非靶序列的影响小，与pcr法相比灵敏度更高，检测限仅为几个拷贝；此外，该技术不需要特殊、昂贵的仪器和试剂，扩增产物不需要进行凝胶电泳，直接用荧光染料显色即可凭肉眼判断结果，操作简便快速，检测成本低。本发明的试剂盒及方法特别适合中小型单位和现场检测应用。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为环介导等温扩增技术检测鸡鼻炎型克雷伯氏菌结果(1：空白对照；2：对比检测1；3：实验组；4：对比检测2)。

图2为特异性实验结果(1：绿脓杆菌；2：金黄色葡萄球菌；3：沙门氏菌；4：鸡鼻炎型克雷伯氏菌)。

图3为敏感性实验结果(p：阴性对照；1：10^-1；2：10^-2；3：10^-3；4：10^-4；5：10^-5；6：10^-6；7：10^-7；8：10^-8；9：10^-9；10：10^-10)。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、基于环介导等温扩增技术检测病原微生物的方法

基于环介导等温扩增技术检测病原微生物的方法，本实施例以鸡鼻炎型克雷伯氏菌为例，其使用试剂如下：

a、浓度各为5μmol/l的上游内引物fip水溶液和下游内引物bip水溶液，浓度各为20μmol/l的上游外引物f3水溶液和下游外引物b3水溶液：引物序列如下：

上游内引物fip：5’-ggctggtcatcctctcagacca-agtaggtggggtaatggctc-3’(seqidno.1)；

下游内引物bip：5’-ggcagcagtggggaatattgca-ggccttcttcatacacgcg-3’(seqidno.2)；

上游外引物f3：5’-tgcccagatgggattagct-3’(seqidno.3)；

下游外引物b3：5’-ccttcctcctcgctgaaag-3’(seqidno.4)；

b、浓度为8u/μl的bstdna聚合酶水溶液；

c、10×热聚合反应缓冲液：由浓度为250mmol/l、ph为8.8的tris–hcl、浓度为100mmol/l的氯化钾、浓度为100mmol/l的硫酸铵、浓度为20mmol/l的硫酸镁和质量分数为1％的tritonx-100组成；

d、浓度为10mmol/l的dntps水溶液：由浓度各为10mmol/l的datp、dgtp、dctp和dttp组成；

e、浓度为100mmol/l的硫酸镁水溶液；

f、浓度为2mol/l的甜菜碱水溶液；

g、浓度为4mol/l的右旋糖苷；

h、质量分数为10％的荧光染料sybrgreeni水溶液。

使用上述试剂利用环介导等温扩增技术检测鸡鼻炎型克雷伯氏菌，包括如下步骤：

(1)提取待检样品的细菌dna作为模板dna：本实施例同时设置实验组和空白对照组，其中实验组为鸡鼻炎型克雷伯氏菌，来源于重庆市畜牧科学院兽医研究所；采用dna提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取各组细菌dna，按照试剂盒说明书操作，实验组所得细菌dna水溶液的od260/od280值为1.8，浓度为20ng/μl。

(2)鸡鼻炎型克雷伯氏菌的环介导等温扩增：在反应管中配制总体积为25μl的环介导等温扩增反应体系：加入浓度均为5μmol/l的上游内引物fip水溶液和下游内引物bip水溶液各1μl，浓度均为20μmol/l的上游外引物f3水溶液和下游外引物b3水溶液各1μl，浓度为8u/μl的bstdna聚合酶水溶液1μl，10×热聚合反应缓冲液2.5μl，浓度为10mmol/l的dntps水溶液2.5μl，浓度为100mmol/l的硫酸镁水溶液0.75μl，浓度为2mol/l的甜菜碱水溶液6.5μl，浓度为4mol/l的右旋糖苷2.5μl，用无dna酶的水稀释至24μl，再加入模板dna水溶液1μl，混合均匀，即得；将反应管于60～65℃水浴中保温反应30分钟，再于80℃水浴中保温5分钟终止反应；

(3)显色检测：在反应管中加入质量分数为10％的荧光染料赛博绿ⅰ水溶液1μl，振摇均匀，用肉眼观察颜色变化。

结果如图1所示，结果显示，空白对照组的颜色为黄色，说明不含有鸡鼻炎型克雷伯氏菌；实验组的颜色变为绿色，说明含有鸡鼻炎型克雷伯氏菌，与预期结果一致。

对比检测1：按照与上述相同的方法，区别在于反应中不添加右旋糖苷，结果如图1所示。结果显示，在不添加右旋糖苷的条件下颜色为黄色，不能检测出含有鸡鼻炎型克雷伯氏菌。

对比检测2：按照与上述相同的方法，区别在于反应中不添加右旋糖苷，然后增加甜菜碱水溶液添加量至12.5μl，保温反应时间延长至60min，结果如图1所示。结果显示，在不添加右旋糖苷的条件下，增加甜菜碱的使用量和延长保温反应时间能够检测出鸡鼻炎型克雷伯氏菌。

为了证明上述检测试剂及方法对鸡鼻炎型克雷伯氏菌检测的准确性，进行特异性实验和灵敏度实验，具体如下：

a、lamp的特异性实验

将肺炎克雷伯氏菌与实验鼠常发的非肺炎克雷伯氏菌(绿脓杆菌，金黄色葡萄球菌，沙门氏菌)的基因组dna以及大小鼠基因组dna按照上述反应体系和条件建立lamp检测方法，进行特异性试验。设置肺炎克雷伯氏菌基因组dna为阳性对照，超纯水为阴性对照，结果如图2所示。结果表明，只有肺炎克雷伯氏菌基因组出现阳性反应，其余均呈阴性反应。

b、lamp敏感性试验

将肺炎克雷伯氏菌基因组dna进行10倍梯度稀释，分别为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9和10^-10(2拷贝)，同时设置阴性对照(超纯水)，按照上述反应体系和条件建立lamp检测方法，以确定检测方法的敏感性，结果如图3所示。结果表明：建立的鼠肺炎克雷伯氏菌lamp检测方法可检侧样品中5.6拷贝数/反应的肺炎克雷伯氏dna。

从上述结果可以看出，lamp扩增方法较常规pcr和荧光pcr方法具有：

特异性强：仅通过是否扩增即可判定目的基因的存在与否，从而完成细苗和病毒的定性检测。

灵敏度高：常规pcr检测方法灵敏度为100pg/反应(l00拷贝数/反应)数量级，采用本发明检测方法，检测下限为13.5fg/反应(5.6拷贝数/反应)。

操作和鉴定简便快捷：常规pcr整个过程在2-4个小时才能出结果，荧光定量pcr也需要1-1.5个小时，本发明提供的检测方法在20～30分钟即可出现阳性结果，并且操作简便，对仪器要求低，仅需要普通水浴锅，并可以通过染料直接观测结果，省去了电泳的步骤，在基层检测鸡鼻炎型克雷伯氏菌的实践中有广泛的应用前景。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>重庆市畜牧科学院

<120>右旋糖苷在环介导等温扩增中的应用及其试剂盒和检测方法

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>42

<212>dna

<213>人工序列(artificial)

<400>1

ggctggtcatcctctcagaccaagtaggtggggtaatggctc42

<210>2

<211>41

<212>dna

<213>人工序列(artificial)

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ggcagcagtggggaatattgcaggccttcttcatacacgcg41

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<212>dna

<213>人工序列(artificial)

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tgcccagatgggattagct19

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<212>dna

<213>人工序列(artificial)

<400>4

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