一株脱氮副球菌及用于高氨氮废水处理产单细胞蛋白的方法与流程

本发明属于生物与环保技术领域，具体涉及一株新筛选的脱氮副球菌，以及该菌利用高氨氮废水生产单细胞蛋白，也涉及废水除臭的方法。

背景技术：

化肥、焦化、石化、制药、食品、垃圾填埋场等行业会产生大量高氨氮废水，大量氨氮废水排入水体不仅引起水体富营养化、造成水体黑臭，给水处理的难度和成本加大，甚至对人群及生物产生毒害作用，目前氨氮废水的处理工艺主要有有生物法、物化法等各种处理工艺，然而这些工艺均是将氨氮转移出水体到大气中或转化为氮气排放到大气中，没有很好的实现资源化利用。

另外近年来，我国畜禽养殖量不断扩大，由于养殖规模大且分散养殖户多，每年产生的畜禽粪污数量惊人。沼气工程作为集约化畜禽养殖粪便资源化利用，减轻环境污染，发展生态养殖业的重要途径，近几年来发展迅速。然而，伴随沼气工程大规模发展的是沼液沼渣等的大幅增多，沼渣因其固态状，制成有机肥，运输相对方便。但沼液不仅达标排放难度大，处理成本高，而且易造成环境二次污染。同时，co2不仅会在厌氧消化过程中大量产生，而且在甲烷燃烧利用后也会生成等量的co2，加剧了全球变暖。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有高氨氮废水处理技术存在的资源浪费、二次污染等问题，提供一株能去除高氨氮废水中cod和氨氮、并固定co2产单细胞蛋白(scp)、同时去除废水恶臭的氢氧化细菌。

为实现上述目的，本发明首先提供了一株氢氧化细菌—脱氮副球菌(paracoccusdenitrificans)y5，于2017年05月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101),保藏编号为：cgmccno.14118。

本发明提供的脱氮副球菌(paracoccusdenitrificans)y5cgmccno.14118从成都市龙泉驿某鱼塘水中筛选得到。其生理特征为：细胞为短杆状、长0.5～1.1μm、革兰氏阴性、无鞭毛；菌落呈圆形，表面凸起，边缘光滑整齐，颜色为不透明的乳白色；生长ph为6.0～9.0；生长温度为25～35℃；该菌为兼性营养型，异养时分别以高氨氮废水中的有机碳和氨氮为碳源、氮源进行生长，自养时分别以二氧化碳和高氨氮废水中的氨氮为碳源、氮源进行生长，该菌在异养、自养条件下均能利用废水中的氨氮生产单细胞蛋白。

本发明提供了上述菌株的16srrna鉴定结果。经过blast比对，菌株y5与脱氮副球菌(paracoccusdenitrificans)的同源性为99％，因此鉴定该菌株为脱氮副球菌。本发明提供的脱氮副球菌(paracoccusdenitrificans)y5的16srrna基因序列如seqidno.1所示。

本发明的另一目的是提供脱氮副球菌y5cgmccno.14118利用高氨氮废水中cod和氨氮、并固定co2产单细胞蛋白(scp)、同时去除废水恶臭的方法，具体方法包括以下步骤：

(1)种子液制备，将菌株接种于种子培养基，30℃条件下培养15h。

(2)高氨氮废水预处理，高氨氮废水经过滤去除大颗粒杂质，将ph值调至6～8。

(3)接种，种子液的接种量为高氨氮废水体积的8％。

(4)脱氮副球菌y5异养生长产scp，在好氧条件下，本发明菌株脱氮副球菌y5cgmccno.14118利用高氨氮废水中的有机质及氨氮产scp，控制培养温度为30℃、搅拌速度为200r/min以上、培养时间为3～8天。

(5)脱氮副球菌y5自养生长，当高氨氮废水中的可溶性有机质浓度下降至1000mg/l(以可溶性化学需氧量scod计)时，通h2、o2和co2的混合气(气体比例为7:2:1)，保持培养温度与搅拌速度分别为30℃和200r/min以上，培养时间为3～5天。

(6)单细胞蛋白的回收，将脱氮副球菌y5异养和自养生长后的菌液固液分离、菌体烘干处理即得到产物单细胞蛋白(scp)。

所述的高氨氮废水包括但不局限于养殖废水、沼液、制药废水、食品加工废水等。

所述的co2来源包括但不局限于工业废气、沼气等。

本发明的优点在于：

(1)本发明涉及的脱氮副球菌具有独特的代谢功能，其化能异养时可利用高氨氮废水中的有机碳、氨氮等元素进行生长，从而实现高氨氮废水cod和氨氮的削减；化能自养时可利用二氧化碳为碳源进行生长，实现co2的固定和利用。

(2)本发明利用co2为碳源，同时消耗畜禽粪污沼液中的有机质、大量氨氮以及微量元素，则缓解了“温室效应”，并且为沼液提供了一种开拓创新的、有价值的处理方式。

(3)本发明涉及的脱氮副球菌对高氨氮废水有一定的处理效果，接种培养后cod去除率为64％以上，氨氮去除率为70％以上。

(4)本发明涉及的脱氮副球菌对高氨氮废水具有除臭作用，而该菌对氨的利用可以去除废水的臭味。由于高氨氮废水通常具有刺激性臭味；通过脱氮副球菌(paracoccusdenitrificans)y5的异养和自养生长产单细胞蛋白过程对氨氮的利用，降低废水中氨氮浓度，减少氨的挥发，从而有效去除废水的恶臭。

(5)本发明涉及的脱氮副球菌可利用高氨氮废水生产具有经济价值的单细胞蛋白，其蛋白含量占菌体干重的72％～78％。

附图说明

图1为本发明脱氮副球菌y5在扫描电子显微镜下的细胞形态；

图2为本发明脱氮副球菌y5的96孔板显色结果；

图3为本发明脱氮副球菌y5在自养条件下的生长曲线；

图4为本发明脱氮副球菌y5自养时生长条件优化柱形图，包括不同初始ph优化柱形图(a)，不同温度优化柱形图(b)，不同接种量优化柱形图(c)；

图5为本发明方法流程图；

图6为本发明产品单细胞蛋白。

具体实施方式

以下结合实施例详细说明本发明。实施方案方便于更好的理解本发明，但并非对本发明的限制。由于实验科学本身的实践特性和实验时间、精力、成本所限，不可能全部验证和体现可替换的技术细节。但本领域技术人员都可以在理解本发明的基础上进行进一步筛选和等同替换获得改变的技术，其都构成对本发明技术的侵犯。

实施例中涉及到的培养基配方为：

(1)种子培养基，，用于异养培养，配方为：蛋白胨10g，牛肉膏5g，nacl5g，加蒸馏水至1000ml，(固体培养基添加琼脂20g)。

(2)无机盐培养基，用于自养培养，配方为：nh4hco33g，kh2po41g，k2hpo42g,nacl2g，cacl20.01g，mgso4·7h2o0.2g，feso4·7h2o0.01g，微量元素2ml，加蒸馏水至1000ml，(固体培养基添加琼脂20g)，其中微量元素组分(mg/l)：znso4·7h2o1.0，moo31.0，mnso4·5h2o1.0，h3bo30.4，cuso4·5h2o7.0，cocl2·6h2o1.0,niso4·7h2o1.0。

实施例1：氢氧化菌的筛选

取成都市龙泉驿某鱼塘水10ml到装有150ml无机盐培养基的厌氧瓶中，充h2、o2和co2的混合气(摩尔比例为7:2:1，全文均为摩尔比)，在ph为7，30℃条件下150r/min摇床培养。每隔24h重新充气、48h更换培养基，待气体利用趋于稳定后以2％的接种量转接。如此反复转接40天，待气体利用稳定后取菌液梯度稀释(10^-2-10^-7)接种于滚管无机盐培养基中，充气后30℃摇床培养48h。用弯头毛细管挑取菌落于液体无机培养基培养，再用平板划线法分离单个菌落三次以上，直至菌落形态一致，最后镜检得纯化菌种。

实施例2：氢氧化菌的鉴定

将分离纯化的菌株在扫描电子显微镜(sem)下观察，结果如图1所示：该菌为短杆状、长0.5～1.1μm，无鞭毛；革兰氏染色鉴定该菌为阴性。

采用细菌全基因组快速抽提试剂盒，提取纯菌株的全基因组，通过选用细菌16srrna通用引物27f和1492r进行pcr扩增，然后测序分析。测序结果经ncbi数据库中的blast比对，鉴定该菌株为脱氮副球菌(paracoccusdenitrificans)，命名为脱氮副球菌y5，即为本发明的保藏菌株脱氮副球菌y5cgmccno.14118。

对脱氮副球菌y5进行生理生化鉴定，采用biologgenⅲmicroplate对菌株进行94种生化实验测试，通过软件读取genⅲ微孔板上所表现出来的表型图谱来对细菌进行鉴定，如图2为本发明的脱氮副球菌y5cgmccno.14118的96孔板显色结果。结果表明该菌株为脱氮副球菌(paracoccusdenitrificans)。

对脱氮副球菌y5进行生长曲线研究，选用无机盐培养基，并充h2、o2和co2的混合气(比例为7:2:1)进行自养培养，结果如附图3所示：脱氮副球菌y5能够在无机盐培养基中利用co2生长，培养5d后，菌液od值达到2.483。

实施例3：脱氮副球菌y5自养生长条件优化试验

方法步骤：首先配制无机盐培养基分装于250ml厌氧瓶中，丁基胶塞密封，在121℃灭菌20min，采用置换排气法配气：用乳胶管连接h2气瓶，并在乳胶管的另一头接上针头，将此针头通过胶塞插入厌氧瓶中，再将另一针头通过胶塞插入厌氧瓶，以便排气，再按混合气比例(h2：o2：co2＝7：2：1)用针筒打入相应量的o2和co2。然后将本发明菌株的种子接种液接种于已充好气的厌氧瓶中，利用气压表监测气体利用情况，间歇式补充气体。采用单因素试验考察不同ph、不同温度和不同接种量对菌体生长及产scp的影响。摇瓶初始发酵条件为：2％接种量，ph7，30℃，200r/min摇床培养6d。

(a)不同初始ph的优化：配置初始ph分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的无机盐培养基，其他条件为初始发酵条件，摇床培养6d后测定其菌体干重(dcw)及scp占干重含量。结果如图4(a)所示，初始ph为7时，dcw与scp含量最高，分别为3.8g/l和73.2％，故本发明菌株最佳生长初始ph为7。

(b)不同温度的优化：其他条件为初始发酵条件，分别置于温度为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃摇床振荡培养培养，6d后测定其菌体干重(cdw)及scp占干重含量。测定结果如图4(b)所示，当温度为30℃时，dcw与scp含量最高，分别为3.1g/l和77.5％，故本发明菌株最佳生长温度为30℃。

(c)不同接种量的优化：其他条件为初始发酵条件，调整接种量分别为2％、4％、6％、8％、10％，摇床培养6d后测定其菌体干重(cdw)及scp占干重含量。测定结果如图4(c)所示，接种量为8％时，dcw与scp含量最高，分别为3.5g/l和76％，故选择接种量为8％为最佳条件。

实施例4：脱氮副球菌y5利用肉制品加工废水产scp同时去除臭味的效果试验

以肉制品加工废水为原料，用纱滤去除废水中的大颗粒杂质，将废水ph值调至6并分装于500ml厌氧瓶中(装液量为150ml)，于121℃高压灭菌20min。在无菌条件下将接种菌液以12ml的量加入到厌氧瓶中，置摇床振荡培养(30℃，200r/min)。

以接种本实验室筛选得到的其他脱氮副球菌d1为对照组，接种量为8％，置摇床振荡培养(30℃，200r/min)3天。

以不接菌的相应废水为空白照，实验设置三个平行。异养培养3d后测定菌液scod、离心上清液的氨氮浓度、dcw及scp含量，取其平均值。测定结果如下表1所示，接种本发明脱氮副球菌y5的废水在3d后cod的去除率为64.5％，氨氮去除率为72％，并产生的菌体干重为3.9g/l，其中scp含量为72％。

该菌在除臭方面也有显著作用，肉制品加工废水的臭气强度和氨气浓度均有明显的下降。

表1y5利用肉制品加工废水产scp情况

实施例5：脱氮副球菌y5利用猪场废水产scp同时去除臭味的效果试验

以猪场废水为原料，用纱布过滤去除废水中的大颗粒杂质，将废水ph值调至7并分装于500ml厌氧瓶中(装液量为150ml)，于121℃高压灭菌20min。在无菌条件下将接种菌液以12ml的量加入到厌氧瓶中，置摇床振荡培养(30℃，200r/min)。每隔两天测定菌液scod，当发酵至5天时，废水中的scod下降至1000mg/l以下时，通h2、o2和co2的混合气(气体比例为7:2:1)，利用气压表监测气体利用情况，间歇式补充混合气体。

以接种本实验室筛选得到的其他脱氮副球菌d1为对照组，同上相同培养8天。

以不接菌的相应废水为空白对照，实验设置三个平行。培养8d后测定菌液scod、离心上清液的氨氮浓度、dcw及scp含量，取其平均值。测定结果如下表2所示，接种本发明脱氮副球菌y5的猪场废水在8d后cod的去除率为70.2％，氨氮去除率为70％，产生的菌体干重为4.9g/l，其中scp含量为74％，并且co2的固定效率为605mg/(l·day)。

该菌在除臭方面也有显著作用，猪场废水的臭气强度和氨气浓度均有明显的下降。

表2y5利用猪场废水产scp情况

实施例6：脱氮副球菌y5利用鸡粪沼液产scp同时去除臭味的效果试验

以鸡粪沼液为原料，用纱滤去除沼液中的大颗粒杂质，再将ph值调至8并分装于500ml厌氧瓶中(装液量为150ml)，于121℃高压灭菌20min。在无菌条件下将接种菌液以12ml的量加入到厌氧瓶中，置摇床振荡培养(30℃，200r/min)。每隔两天测定菌液scod，当发酵至8天时，沼液中的scod下降至1000mg/l以下时，通h2、o2和co2的混合气(气体比例为7:2:1)，利用气压表监测气体利用情况，间歇式补充混合气体。

以接种本实验室筛选得到的其他脱氮副球菌d1为对照组，同上相同培养13天。

以不接菌的相应沼液为空白对照，实验设置三个平行。培养13d后测定菌液scod、离心上清液的氨氮浓度、dcw及scp含量，取其平均值。测定结果如下表3所示，接种本发明脱氮副球菌y5的鸡粪沼液在13d后cod的去除率为90％，氨氮去除率为95％，产生的菌体干重为10.9g/l，其中scp含量为78％，并且co2的固定效率为854.5mg/(l·day)。

该菌在除臭方面也有显著作用，鸡粪沼液的臭气强度和氨气浓度均有明显的下降。

表3y5利用鸡粪沼液产scp情况

实施例7：分离提取scp

在实施例6的基础上，将菌液离心(5000r/min，30min)、烘干处理(60℃，20h)即得到产物scp1.28g，产品具有明显的饲料香味。产品如附图6。

序列表

<110>深圳克格瑞环保生物科技有限公司

<120>一株脱氮副球菌及用于高氨氮废水处理产单细胞蛋白的方法

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1368

<212>dna

<213>脱氮副球菌(paracoccusdenitrificans)

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