一种季也蒙毕赤酵母及其应用的制作方法

本发明涉及植物病害生物防治技术领域，特别涉及一种季也蒙毕赤酵母y-1及其在防治葡萄真菌病害中的应用。

背景技术：

葡萄是一种色艳味美且营养丰富的水果，是人们重要的营养来源和物质基础。我国葡萄栽培面积和产量均位居世界前列，其中山东葡萄产量约占全国总产量的16％。我国葡萄生产以鲜食品种和酿酒品种为主，产量占世界葡萄总量的35％，世界排名第二。然而，葡萄病害严重制约着葡萄产业的健康可持续发展，葡萄生产及采后各环节因真菌感染而造成的病害给葡萄产业带来了巨大的经济损伤。有效防治葡萄病害，对提高葡萄品种、产量一级稳定葡萄酿酒工业具有重要意义。

危害严重的葡萄病害主要包括葡萄白腐病(conielladiplodiella)、灰霉病(botrytiscinerea)、青霉病(penicilliumsp.)、褐腐病(moniliniasp.)和炭疽病(colletotrichumgloeosporioides)等。生产上防治上述病害多采用套袋保护、避雨栽培、化学药剂防治等措施，但是套袋保护和避雨栽培措施不仅增加了生产成本，而且改变了微生态环境，加重了灰霉病、黑点病和白粉病等病害的发生，也增加了很多害虫的防治难度。目前，葡萄病害的防控措施主要还是依靠喷洒化学药剂，但是化学杀菌剂的药剂残留、病原菌易对其产生抗性和环境污染严重等问题已日趋严重。因此，寻求可替代化学杀菌剂的安全有效防治措施已成为葡萄病害和采后贮藏病害防治中亟待解决的问题。

大量研究表明，生物防治因其高效和无污染的特点，是解决农业可持续发展的有效途径，有的生防制剂已在生产中得到应用。酵母因其具有生长繁殖能力强、遗传稳定、广谱抗菌、与化学杀菌剂兼容，且不产生有毒物质，对人体没有危害，对生长环境要求不苟刻等优点，而成为生防微生物中最最受关注的生防菌。以有效生防微生物取代化学杀菌剂，用于葡萄病害的防治已显示出巨大的应用前景。

技术实现要素：

本发明针对目前农业生产中葡萄生产和储藏期主要真菌病害防治难度大，成本高，化学农药抗性日益突出，农药残留高等问题，筛选出一株高效生防菌株并制备生防制剂，对葡萄真菌病害进行有效防治。以此减少化学药剂的使用次数和使用量，消弱其对环境的破坏以及对人类身体健康的影响，并可延迟葡萄病害病原菌抗、耐药菌株的出现，以实现葡萄产业向着安全、高效、可持续的方向发展。

为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明从葡萄果实表面分离、筛选获得一株用于葡萄真菌病害生物防治的酵母菌株y-1，经形态学观察、生理生化特性及its序列分析鉴定为季也蒙毕赤酵母(meyerozymaguilliermondii)，该菌株已于2015年12月31日保藏于：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏号：cctccno:m2015814，经检验存活。

利用上述季也蒙毕赤酵母(meyerozymaguilliermondii)y-1制备用于防治葡萄真菌病害的生防制剂。

在上述方案的基础上，所述季也蒙毕赤酵母(meyerozymaguilliermondii)y-1用于增强植物体内防御酶的活性，所述的防御酶为cat、ppo、sod和pod。

在上述方案的基础上，使用时将季也蒙毕赤酵母(meyerozymaguilliermondii)y-1制备成菌悬液。

在上述方案的基础上，所述季也蒙毕赤酵母(meyerozymaguilliermondii)y-1菌悬液通过喷施或浸润的方式施用于葡萄。

在上述方案的基础上，所述季也蒙毕赤酵母(meyerozymaguilliermondii)y-1菌悬液浓度为10³～10⁸cfu·ml^-1，最优浓度为10⁷cfu·ml^-1。

在上述方案的基础上，所述葡萄病害为由病原真菌引起的葡萄白腐病、灰霉病、青霉病、褐腐病和炭疽病。

在上述方案的基础上，所述葡萄白腐病病原菌白腐垫壳孢(conielladiplodiella)、灰霉病病原菌灰葡萄孢菌(botrytiscinerea)、青霉病病原菌青霉菌(penicilliumspp.)、褐腐病病原菌链核盘菌(moniliniaspp)和炭疽病病原菌为胶孢炭疽菌(colletotrichumgloeosporioides)。

本发明有益效果：

与现有技术相比，本发明的优点是：1)所述季也蒙毕赤酵母(meyerozymaguilliermondii)y-1从葡萄果实表面分离获得，对真菌引起的葡萄病害如葡萄白腐病、灰霉病、青霉病、褐腐病和炭疽病等均具有显著的防治效果；2)所述季也蒙毕赤酵母(meyerozymaguilliermondii)y-1具有持效期长和广谱特性，菌株y-1菌体除对上述葡萄病害病原菌有抑制作用外，还对苹果轮纹病菌(botryosphaeriadothidea)、苹果树腐烂病菌(valsamali)、苹果果实斑点病病原菌菌核生枝顶孢菌(acremoniumsclerotigenum)、霉心病病原菌粉红单端孢菌(trichotheciumroseum)、链格孢菌(alternariaalternate)和镰刀菌(fusariumspp.)等具有显著拮抗作用；经菌株y-1菌悬液处理过的葡萄果实，贮藏30d后，防腐效果仍在80％以上；3)季也蒙毕赤酵母(meyerozymaguilliermondii)y-1本身不产生有毒物质，环保安全，不宜使病原菌产生抗药性；4)酵母菌株y-1繁殖速度快，发酵条件简便，使用方法简单，成本低；5)防治上述葡萄果实病害效果显著，最高防治效果可达87％，6)使用季也蒙毕赤酵母(meyerozymaguilliermondii)y-1还能提高葡萄果实内防御酶cat、ppo、sod和pod的活性，使果实抗病能力显著提高。

附图说明

图1所述季也蒙毕赤酵母(meyerozymaguilliermondii)y-1在ypd琼脂培养基上的菌落形态；

图2季也蒙毕赤酵母(meyerozymaguilliermondii)y-1提取dna的its序列pcr扩增示意图；

图中m为核酸markerdl2000；1-8均为菌株y-1基因组dna的its序列扩增结果；

图3季也蒙毕赤酵母(meyerozymaguilliermondii)y-1对葡萄灰霉病菌菌丝生长的抑制作用；

图中a为葡萄灰霉病菌在不添加菌株y-1的pda上培养3d的菌落；图中b-f为葡萄灰霉病菌在添加菌株y-1菌体浓度分别为10³，10⁴，10⁵，10⁶和10⁷cfu·ml^-1的pda上培养3d的菌落；

图4季也蒙毕赤酵母(meyerozymaguilliermondii)y-1对葡萄炭疽病菌菌丝生长的抑制作用；

图中a为葡萄炭疽病菌在不添加菌株y-1的pda上培养3d的菌落；图中b-f为葡萄炭疽病菌在添加菌株y-1菌体浓度分别为10³，10⁴，10⁵，10⁶和10⁷cfu·ml^-1的pda上培养3d的菌落；

图5季也蒙毕赤酵母(meyerozymaguilliermondii)y-1显著提高葡萄果实内防御酶活性；

图6季也蒙毕赤酵母(meyerozymaguilliermondii)y-1不同浓度菌悬液对苹果轮纹病的防治效果；

图中a为接种pda培养基再接种轮纹病菌的对照；图中b，c和d分别为y-1菌悬液10⁶cfu·ml^-1，10⁷cfu·ml^-1和10⁸cfu·ml^-1对苹果轮纹病的防治效果。

具体实施方式

以下实施例仅用于对本发明做进一步的描述，并不是用来限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1所述季也蒙毕赤酵母(meyerozymaguilliermondii)y-1的分离与菌株鉴定

1.1菌株的分离与筛选

从山东烟台商品化葡萄园采集成熟健康巨峰葡萄，从葡萄表面分离菌株，采用常规梯度稀释涂布分离法，用pda培养基(含有硫酸链霉素)和ypd琼脂培养基(含有硫酸链霉素)分别在28℃条件下培养，挑取菌落形态差异明显的菌落，在ypd琼脂培养基上纯化保存，并以葡萄白腐病菌为靶标病原菌进行拮抗菌的初筛和多次复筛，最终得到一株活性强的拮抗酵母菌菌株，命名为y-1。

上述所用pda培养基，其组分及配方如下：马铃薯削皮后称取200g，切成小块在水中煮沸15～20min，四层纱布过滤后加入葡萄糖20g，琼脂粉15g，定容至1000ml，ph值天然，在121℃高压蒸汽灭菌20min。

1.2菌株的鉴定

(1)形态特征：菌株y-1在ypd琼脂培养基上培养24h后，菌落表面光滑、湿润、粘稠，容易挑起，菌落质地均匀，正反面和边缘、中央部位的颜色都很均一，菌落多为乳白色，但比细菌菌落稍大且厚，如图1所示。

(2)生理生化特性：菌株y-1在ypd液体培养基中，28℃振荡培养基2d，原来透明的培养基逐渐变浑浊，溶液呈淡黄色。菌株y-1可利用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖，不能利用乳糖和甘露醇，可水解淀粉，发酵需要氧气。

(3)dna的its序列分析：采用酵母基因组dna提取试剂盒(生工)提取酵母基因组dna，采用通用引物primerf：5’-tccgtaggtgaacctgcgg-3’，primerr：5’-tcctccgcttattgatatgc-3’对dna模板进行pcr扩增；pcr扩增反应体系(25μl)：2.5μl10×taq酶缓冲液，0.2μmol/l引物，2μl200mmol/ldntps，20ngdna模板，1utaq酶(takara)，17μlddh2o。pcr扩增程序：94℃预变性4min,94℃变性45s,54℃退火45s,72℃延伸1min，进行35个循环，72℃延伸5min。扩增产物(8μl)经1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。pcr扩增结果如图2所示。

pcr扩增产物经切胶回收后，直接送交上海生物工程有限公司进行序列测定。测定序列的分析结果表明its序列扩增片段长度为606bp，其序列如序列表seqidno:1所示。将所得序列采用ncbi数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中的blast软件与genbank中的核酸序列进行比对，与季也蒙毕赤酵母(meyerozymaguilliermondii)ap.msu5菌株(accessionno:kt282394.1)的its序列同源性为99％。

结合以上3点，形态学特征、生理生化特性及基因组的its序列分析，将菌株y-1鉴定为季也蒙毕赤酵母(meyerozymaguilliermondii)。

实施例2季也蒙毕赤酵母(meyerozymaguilliermondii)y-1对多种植物病原真菌的抑制作用

不同浓度季也蒙毕赤酵母(meyerozymaguilliermondii)y-1菌体对葡萄灰霉病菌和葡萄炭疽病菌具有显著的抑制作用，其中pda中添加10⁷cfu·ml^-1菌株y-1时抑制效果最显著(图3和图4)。此外，10⁷cfu·ml^-1的季也蒙毕赤酵母y-1菌体还对葡萄白腐病菌、葡萄青霉病菌、葡萄褐腐病菌、苹果轮纹病菌、苹果树腐烂病菌、梨树腐烂病菌、苹果果实斑点病病原菌及苹果霉心病病原菌等其它多种果树病原真菌均具有显著的抑制作用，表现出良好的广谱抗菌特性，结果见表1。

表1季也蒙毕赤酵母(meyerozymaguilliermondii)y-1对果树主要病原真菌的抑制作用

注：抑菌效果判断标准为：d<10mm为不敏感者(-)；10mm≤d<20mm为低度敏感者(+)；20mm≤d<30mm

为中度敏感者(++)；d>30mm为高度敏感者(+++)。

实施例3季也蒙毕赤酵母(meyerozymaguilliermondii)y-1菌悬液喷雾施用对葡萄病害的防治效果

将季也蒙毕赤酵母(meyerozymaguilliermondii)y-1种子发酵液接种于ypd液体培养基中，30℃恒温震荡培养48h，得到y-1菌株的细胞培养液，并将浓度调节为10⁶cfu·ml^-1，10⁷cfu·ml^-1和10⁸cfu·ml^-1菌悬液。葡萄灰霉病菌、葡萄炭疽病菌、葡萄白腐病菌、葡萄青霉病菌和葡萄褐腐病菌在pda上活化培养3d，在菌落边缘打取直径5mm的菌饼备用。挑选果粒大小均匀健康的巨峰葡萄，75％酒精表面消毒后室温晾干，在葡萄赤道位置，刺伤造成微伤口，每个果实一个伤口，每个伤口直径为0.3mm，深为0.1mm。将上述菌株y-1的10⁶cfu·ml^-1，10⁷cfu·ml^-1和10⁸cfu·ml^-1菌悬液均匀喷雾到果实上，直到有水滴滴下，室温晾干后，在刺伤处接种上述病原菌菌饼。接种后2d观察并测量病斑直径，根据发病病斑面积计算防治效果。

防治效果＝(对照组病斑面积-处理组病斑面积)/对照组病斑面积×100％。

所述不同浓度菌株y-1菌悬液对上述葡萄病害的防治效果见表2，三个浓度菌株y-1菌悬液均对5种葡萄病害均具有显著的防治效果，防效均在50％以上，最高防效可达90％以上，其中10⁷cfu·ml^-1的菌株y-1菌悬液对各病害的防治效果显著高于其余两个浓度，说明该生防酵母菌y-1表现出良好的广谱抗病性且防效显著。

表2不同浓度菌株y-1菌悬液防治葡萄病害的效果

实施例4季也蒙毕赤酵母(meyerozymaguilliermondii)y-1不同浓度菌悬液对苹果轮纹病的防治效果

按照实施例3种方法，制备季也蒙毕赤酵母(meyerozymaguilliermondii)y-1不同浓度菌悬液，10⁶cfu·ml^-1，10⁷cfu·ml^-1和10⁸cfu·ml^-1。苹果采摘后，经菌株y-1菌悬液浸泡处理1min，室温下自然晾干，于4℃，相对湿度95％条件下，黑暗贮藏。贮藏60d后，刺伤接种苹果轮纹病菌，根据发病病斑面积计算防治效果(图5)，防治效果＝(对照组病斑面积-处理组病斑面积)/对照组病斑面积×100％。菌悬液浓度为10⁶cfu·ml^-1时，防效为74.4％，菌悬液浓度为10⁷cfu·ml^-1时，防效可达92.3％；菌悬液浓度为10⁸cfu·ml^-1时，防效为85.5％。可见，菌悬液浓度为10⁷cfu·ml^-1时防治效果最好。实施例5季也蒙毕赤酵母(meyerozymaguilliermondii)y-1浸泡施用对葡萄病害的防治效果

按照实施例3种方法，制备季也蒙毕赤酵母(meyerozymaguilliermondii)y-1的10⁷cfu·ml^-1菌悬液，葡萄果实采摘后，经上述浓度菌悬液浸泡1～2min，室温下自然晾干，于25℃，相对湿度95％条件下，黑暗贮藏，以无菌水浸泡处理作为对照。贮藏30d后，统计每处理中腐烂果粒数，计算防腐效果。

防腐效果＝(对照组腐烂果粒数-处理组腐烂果粒数)/对照组腐烂果粒数×100％。

结果表明，季也蒙毕赤酵母(meyerozymaguilliermondii)y-1菌悬液浸泡后对葡萄果实防腐保鲜效果非常显著，25℃贮藏30后，防腐效果可达80％以上。

实施例6季也蒙毕赤酵母(meyerozymaguilliermondii)y-1提高葡萄果实内防御酶活性

按照实施例3中方法处理果实，表面消毒晾干后，在葡萄赤道处刺伤，每伤口直径约0.3mm，深约0.1mm，每果实1处伤口，均匀喷施10⁷cfu·ml^-1的菌株y-1菌悬液，以无菌水处理的果实作为对照。以刺伤处为中心，分别于处理后0、0.5、1、2、3、4、5d取样，测定果实组织内防御相关酶活性的变化趋势。

结果如图6所示：10⁷cfu·ml^-1的菌株y-1菌悬液处理葡萄果实后，果实组织内过氧化氢酶(cat)、过氧化物酶(pod)、超氧化歧化酶(sod)和多酚氧化酶(ppo)活性相比对照均显著升高，说明季也蒙毕赤酵母(meyerozymaguilliermondii)y-1还可通过提高果实内防御酶活性防治葡萄病害。

实施例7一种对葡萄病害具有防治作用的微生物菌剂，其步骤如下：

1)培养基的制备：

ypd培养基：酵母提取物10g，蛋白胨20g溶解于900ml水中，如制备固体培养基加入20g琼脂粉，121℃高压蒸汽灭菌20min后，加入100ml已灭菌的20％葡萄糖溶液。

2)季也蒙毕赤酵母y-1菌株的活化：将菌株按无菌操作要求划线接种于含ypd琼脂培养基的平板中，28℃恒温培养2-3d；

3)季也蒙毕赤酵母y-1菌株的液体培养：挑取步骤2)中活化的y-1菌株的单菌落，接种于瓶装量为80ml/250ml的ypd液体培养基中，150r·min^-1，30℃恒温震荡培养24h，得到菌株y-1发酵种子液。将所述发酵种子液按1:100的接种量接种到所述的ypd液体培养基中，30℃恒温震荡培养48h，得到浓度为10⁷cfu·ml^-1的季也蒙毕赤酵母y-1菌株的细胞培养液；

4)季也蒙毕赤酵母y-1生防制剂的制备：将步骤3)中制备的细胞培养液，在4℃条件下，6000r·min^-1离心10min，收集菌体沉淀用无菌水重新悬浮，得到10⁸cfu·ml^-1的菌悬液；

5)稀释：将步骤4)中制备的10⁸cfu·ml^-1的菌悬液稀释0-100倍，步骤3)中所述的细胞培养液和4)中所述的菌悬液均为生防制剂。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

序列表

<110>青岛农业大学

<120>一种季也蒙毕赤酵母及其应用

<130>seq

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>606

<212>dna

<213>季也蒙毕赤酵母(meyerozymaguilliermondiiy-1)

<400>1

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agataggttgggccagaggtttaacaaaacacaatttaattatttttacagttagtcaaa180

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