针对转基因大豆dsABS品系的特异性PCR检测方法与流程

本发明属于转基因食品检测技术领域，具体涉及一种针对转基因大豆dsabs品系的检测方法专利申请事宜。

背景技术：

在对进行转基因植物及其加工产品进行成分定性检测时，可根据其检测的特异性分为筛选检测方法、基因特异性检测方法和品系特异性检测方法等。其中品系特异性检测是通过检测插入载体与植物基因组的连接区序列实现的。由于每一个转基因植物品系，都具有特异的外源插入载体与植物基因组的连接区序列，因此品系特异性具有更高的特异性和准确性，最适合做转基因产品检测。

根据《转基因植物及其产品成分检测》国家标准，品系特异性检测方法中往往对特异性pcr反应扩增的产物有一定要求，即：长度120~300bp之间、扩增条带单一、并可用于多种仪器进行结果显示。只有符合这些要求，才能较好满足检测快速、准确、特异的要求，才能更加方便应用于转基因产品成分检测。

就转基因大豆dsabs品系而言，该品系是由美国俄亥俄州立大学和中国热带农业科学院热带生物技术核技术研究所开发的大豆新品系。该品系以非转基因大豆（glycinemax）栽培品种throne为受体，通过农杆菌介导法导入同时含有苜蓿花叶病毒、菜豆荚斑点病毒和大豆花叶病毒复制酶基因保守序列的发夹结构，因此该品系具有极好的同时抗苜蓿花叶病毒、菜豆荚斑点病毒和大豆花叶病毒三种病毒的能力。该品系目前正在一定范围内用于进一步的试验、推广种植阶段。但现有技术中尚未建立较好的针对该品系的检测方法，而建立一种较好的针对转基因大豆dsabs品系的特异性pcr检测方法，对于今后有效的对该转基因品系的推广种植及监控具有十分重要的技术意义和应用价值。

技术实现要素：

本申请主要目的在于提供一种针对转基因大豆dsabs品系的特异性pcr检测方法，从而为对该品系的准确和有效检测奠定基础。

本申请所提供的技术方案详述如下。

一对用于转基因大豆dsabs品系检测用pcr引物，该引物根据转基因大豆dsabs的转化载体3'端及侧翼大豆序列(所述侧翼大豆序列如seqidno.1所示)设计而成，包括primer-f和primer-r，引物序列如seqidno.2~3所示，具体为：

primer-f：5'-gagaggcggtttgcgtattggcta-3'，

primer-r：5'-acactgttcgctcgcacttatctact-3'。

一种针对转基因大豆dsabs品系的特异性pcr检测方法，具体包括如下步骤：

（1）提取待检测大豆样品的dna；具体例如采用：ctab法、异硫氰酸胍法或盐酸胍法等各种从植物材料中提取dna的方法；

（2）利用上述所设计引物primer-f和primer-r，以步骤（1）中所提取dna为模板，进行pcr扩增；

pcr扩增时，25μl扩增体系设计如下：

10×pcr缓冲液，2.5μl，

dntps混合溶液，2μl，

引物primer-f，10μmol/l、1.0μl；

引物primer-r，10μmol/l、1.0μl；

easytaq酶，5u/μl、0.2μl；

步骤（1）中所提取的dna模板，25mg/l、2.0μl；

双蒸水加至25μl；

pcr扩增条件为：94℃、5min；94℃、20s，58℃、20s，72℃、50s，35个循环；72℃、2min；

（3）对步骤（2）中pcr扩增产物进行电泳检测，根据是否能扩增到预期的特定片段确定待测大豆样品的品系特异性，判定标准为：

如果pcr扩增片段大小与预期的特异性片段一致，表明待测样品含有转基因大豆dsabs；如果没有特异性扩增片段或扩增片段大小与预期的特异性片段不一致，则待测样品不含有转基因大豆dsabs；

所述特异性片段序列，包括320bp，如seqidno.4所示，具体为：

gagaggcggtttgcgtattggctagagcaattcggcgttaattcagtacattaaaaacgtccgcaatgtgttattaagttgtctaagcgtcaatttgtttacaccacaagaaggaaatatcacaacaaaaaaggcaacaagaaaaaaaaatgcaataccacgttaatccagattgctaattaaatctgaatgagacatacaaagcaaaaccaaggtgataaatctgaacaagacatctaataccttaatctatgttccactctttgtcgttaaaggcaccattcgcagtggtatagtagataagtgcgagcgaacagtgt。

以常规大豆和转基因大豆dsabs、mon89788、cv127、a5547-127、ctst-3-2以及其它转基因植物（油菜gt73、水稻tt51、玉米mon810、玉米bt176等）作为待检材料，利用本申请所提供的针对转基因大豆dsabs品系的特异性pcr检测方法进行初步的定性检测后，pcr扩增结果表明，仅在转基因大豆dsabs基因组中扩增得到了目的片段大小的条带(320bp)，而在其它转基因植物以及常规大豆等基因组中没有扩增得到目的片段大小的片段。进一步测序分析表明，待检转基因大豆dsabs基因组中扩增获得的序列与目的扩增片段序列一致。这一结果表明，本申请所建立的转基因大豆dsabs品系特异性定性pcr检测方法具有较强的特异性。

分别以待测样品中含有1%、0.5%、0.1%、0.05%质量比例的转基因大豆dsabs品系为例，进一步对本申请所提供的针对转基因大豆dsabs品系的特异性pcr检测方法的检出限进行检测判定，结果表明，该方法的检出限为0.05%，即，只要待测样品中含有不小于0.05%质量比例的转基因大豆dsabs品系时，均可检出，表现出较高的灵敏性。

总体而言，本申请具有特异性强、灵敏度高、检测结果准确可靠等优点，可为转基因大豆dsabs品系的种植监测、品种检测等奠定良好的方法学基础，具有较好的实用价值。

附图说明

图1为pcr扩增后产物的电泳结果，其中：1~3为转基因大豆dsabs，4为空白对照，m为2000dnamarker；

图2为方法特异性（准确性）检测，其中：m为2000dnamarker，1为空白对照，2~6分别为样品1、样品2、样品3、样品4、样品5；

图3为方法检测限（灵敏性）结果，其中：m为2000dnamarker，1为空白对照，2~5分别为转基因大豆dsabsdna拷贝数为20000、2000、200、20和2的样品。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中涉及部分生物材料、实验试剂、实验设备等背景情况简要介绍说明如下。

生物材料：

常规大豆，为以非转基因大豆（glycinemax）栽培品种throne；

转基因水稻tt51，转基因玉米mon810、bt176，转基因大豆mon89788、cv127、a5547-127、ctst-3-2，均为常见的研究用转基因植物或国外种植用转基因植物品种；

转基因大豆dsabs，申请人作为该品系开发者之一，因此保留有该材料；

相关引物及测序均由上海生物工程技术服务有限公司提供和完成；

实验试剂：

pcr扩增用10×pcr缓冲液、dntps混合溶液、easytaq酶等试剂均购自宝生物（大连）有限公司；

植物dna分离试剂盒、质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒均购于全式金生物技术有限公司；

实验设备：

arktik多功能pcr仪，美国赛默飞世尔。

实施例1

本实施例就转基因大豆dsabs品系特异性片段序列的pcr扩增过程简要介绍如下。

（一）提取dna作为pcr扩增用模板，具体可参考如下操作：

（1）取经加入液氮充分研磨后的dsabs转基因大豆种子粉末约100mg

到预先装有700μl、65℃预热缓冲液gp1的离心管中（实验前在预热的gp1中加入巯基乙醇，巯基乙醇终浓度为0.1%），迅速颠倒混匀后，将离心管65℃水浴20min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次；

（2）在步骤（1）的离心管中加入700μl氯仿，充分混匀后，12000rpm离心5min；

然后小心地将所得上层水相转入一个新的离心管中，再加入700μl缓冲液gp2，充分混匀；

（3）将步骤（2）中混匀的液体转入吸附柱cb3中，12000rpm离心30sec，弃掉废液；

再向吸附柱cb3中加入500μl缓冲液gd（使用前加入无水乙醇），12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中；

（4）向吸附柱cb3中加入600μl漂洗液pw（使用前加入无水乙醇），12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中；重复此步骤一次；

（5）将收集管中吸附柱cb3进行离心，12000rpm离心2min，倒掉废液；再将吸附柱cb3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

最后将吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加200μl左右洗脱缓冲液te，然后室温放置5min左右，再12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，此即为所提取dna。

取5μl所提取的dna溶液，进行0.8%的琼脂糖凝胶电泳，根据其亮度和带型来判断dna的质量；同时采用nirodrop测定所提dna的浓度和纯度，以判定是否适合作为后续pcr扩增用模板。

综合电泳结果及浓度、纯度结果，采用上述步骤所提取dna适合作为后续pcr扩增用模板。

（二）设计引物并进行pcr扩增

根据转基因大豆dsabs的转化载体3'端及侧翼大豆序列(序列如seqidno.1所示，该序列为转基因大豆dsabs的转化载体3’端及侧翼大豆序列，共663bp，其中从起始位置开始至269bp（含）处为载体序列（共269bp），从270bp碱基至末端663bp处碱基序列为大豆基因组序列（共394bp）)设计pcr扩增用引物primer-f和primer-r，引物序列如seqidno.2~3所示，具体为：

primer-f：5'-gagaggcggtttgcgtattggcta-3'，

primer-r：5'-acactgttcgctcgcacttatctact-3'。

pcr扩增时，25μl扩增体系设计如下：

10×pcr缓冲液，2.5μl，

dntps混合溶液，2μl，

引物primer-f，10μmol/l、1.0μl；

引物primer-r，10μmol/l、1.0μl；

easytaq酶，5u/μl、0.2μl；

步骤（1）中所提取的dna模板，25mg/l、2.0μl；

双蒸水加至25μl；

pcr扩增条件为：94℃、5min；94℃、20s，58℃、20s，72℃、50s，35个循环；72℃、2min。

（三）结果分析

对步骤（二）中pcr扩增产物进行电泳，结果如图1所示。进一步测序分析表明，利用该引物扩增所得特异性片段序列大小为320bp，该序列为外源插入载体和大豆基因组的连接区序列，具体序列为seqidno.4所示（该序列中，从起始位置开始至109bp（含）处为载体序列（共109bp），从110bp碱基至末端320bp处碱基序列为大豆基因组序列（共211bp））。

实施例2

在实施例1基础上，为进一步检测评价本申请所提供针对转基因大豆dsabs品系特异性pcr检测方法的准确性和灵敏性，发明人进行了进一步的实验，相关实验简要介绍如下。

准确性实验检测

采用不同样品原料分别制备dna样品，具体样品原料设计如下：

样品1：常规大豆；

样品2：转基因水稻tt51；

样品3：转基因玉米mon810、bt176，含量各50%（质量比），混合均匀作为1个样品；

样品4：转基因大豆mon89788、cv127、a5547-127、ctst-3-2，含量各25%（质量比），混合均匀作为1个样品；

样品5：转基因大豆dsabs。

利用实施例1中的引物对及参考实施例1中扩增体系，分别以上述不同样品所提取dna样品为模板进行pcr扩增，并对pcr扩增产物进行电泳检测，结果如图2所示。

分析可以看出，仅在转基因大豆dsabs样品中扩增得到了与目的片段大小相同的条带(320bp)，而在其他样品基因组中均未扩增得到与目的片段大小相似的片段。进一步的测序分析也进一步验证了此结果。此结果表明，采用特定引物primer-f和primer-r进行pcr扩增检测验证时，所得pcr扩增产物对于检测判定是否为转基因大豆dsabs品系具有高度特异性，能够较好保证结果的准确性。

灵敏性实验检测

为检测本申请所提供针对转基因大豆dsabs品系特异性pcr检测方法的灵敏性，首先制备检测用dna模板样品如下：

将dsabs阳性dna样品（参考实施例1，采用转基因大豆dsabs制备），和其对应的非转基因大豆受体dna按不同质量比混合制备系列样品，制备含dsabs转基因大豆50%、5%、0.5%、0.05%、0.005%的样品，提取dna。然后，参考实施例1的pcr反应体系，利用引物primer-f和primer-r进行pcr扩增。所取dna样品中dsabs阳性dna拷贝数分别为相当于20000、2000、200、20和2，对pcr扩增产物进行电泳检测分析，结果如图3所示。

分析结果表明：在dna拷贝数分别为20000、2000、200、20的模板样品中，均能有效扩增获得320bp的目的片段，而在dna拷贝数为2的模板样品及反应体系中，未能扩增获得目的片段。这一结果表明本发明所提供检测方法的检测限为20拷贝，即，只要待测样品中含有不小于0.05%质量比例的转基因大豆dsabs品系时，均可有效检测出，具有较高灵敏度。

sequencelisting

<110>中国热带农业科学院热带生物技术研究所

<120>针对转基因大豆dsabs品系的特异性pcr检测方法

<130>none

<160>4

<170>patentinversion3.5

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<212>dna

<213>glycinemax

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tgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattg180

gctagagcaattcggcgttaattcagtacattaaaaacgtccgcaatgtgttattaagtt240

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