本发明涉及植物生理学和微生物学领域，具体涉及一种室内鉴定野生棉苗期黄萎病抗性的方法。
背景技术：
棉花黄萎病是大丽轮枝菌经土壤传播、侵染棉花植株最终引发维管束疾病的一种真菌性病害，具有寄主范围广、传播途径多、存活时间久和变异频繁等特点，可造成棉花大量减产甚至绝收，很难有效防治，被形象地称为棉花的“癌症”。
棉属包括4个栽培棉种和47个野生棉种，在当前棉花栽培种中，缺乏对大丽轮枝菌高抗的种质资源，直接限制了其在抗黄萎病育种方面的应用。棉属野生种经过长期自然选择形成了许多优良性状，如抗病虫、抗寒、耐干旱、耐盐碱和优质的纤维品质等特性，这为棉花黄萎病的防治提供了宝贵的种质资源。对棉花野生种质资源的黄萎病抗性准确鉴定和评价是充分利用这些优异性状的首要环节。野生棉多为二倍体，种子小，外壳坚硬致密，自然条件下无法正常萌发，获得成株困难，所以参照推荐性国家标准(棉花抗病虫性评价技术规范第5部分：黄萎病标准号：gb/t22101.5-2009)对野生棉种进行鉴定无法获得理想的结果。因此，探索一种适合野生棉的苗期黄萎病抗性鉴定方法和高效的评价体系，对棉花野生资源的利用及抗黄萎病棉花新品种的培育具有重要的指导意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种室内鉴定野生棉苗期黄萎病抗性的方法，用来弥补棉花黄萎病抗性筛选方法的不足，以期能够快速准确的对野生棉种质资源苗期黄萎病抗性进行客观鉴定，为棉花的抗病育种提供依据。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种室内鉴定野生棉苗期黄萎病抗性的方法，包括以下步骤：
s1、种子预处理：
对选用的野生棉种子进行浓硫酸脱绒处理后，用5％naclo消毒8-10min，清水冲洗4-5遍，晾干，置于40℃烘箱中加热干燥1d，以打破种子休眠，干燥完成后，在种子珠孔端切一个小口，以不伤害胚根为准；
s2、催芽处理：
采用规格为20cm×20cm的滤纸作为发芽纸，平铺两层发芽纸，用无菌水打湿后，将完成预处理后的种子均匀的放置在发芽纸上，种尖向下，用另一张发芽纸覆盖在种子上，然后将三层发芽纸围着种子卷成纸卷，按不同棉种直接放入湿润的发芽盒中，使发芽纸始终保持湿润状态；
将发芽盒置于温度28℃，湿度85％的光照培养箱中，遮光培养2-3d，待胚根长到1cm左右，即可进行移苗；
s3、移苗和育苗：
将蛭石装入底部有四孔(底部中间开设1个孔，周边开设3个孔)的营养杯内，压实后，在蛭石中央按压出一个凹坑，把胚根长到1cm左右的幼苗，胚根向下，子叶向上放入坑内，随后覆盖一层蛭石，喷洒水分，保持基质湿润，移入30℃，16h/8h昼夜的人工气候室，培养至第一片真叶展平；
s4、培养鉴定用黄萎病菌：
将冷藏保存的单孢菌系转至pda平面培养基上，25℃，活化7-10d后，将长有黄萎病菌的固体平板，切成小块，转移至灭菌的pda液体培养基中，25℃，180r/min，培养4-5d；
将培养好的菌液，用四层纱布过滤并收集滤液，利用血球计数板进行计数，稀释黄萎病菌液浓度至1.2×107个/ml，得孢子悬浮液；
血球计数板的计算公式为：
孢子数(个/ml)＝每小格平均孢子数α×400×104，α≈3
s5、接菌处理：选择长势一致的棉花幼苗，使用一字头螺丝刀，从营养杯底部周边的3个孔伸入3cm左右，轻微转动；然后用10ml注射器吸取8ml所得的孢子悬浮液由营养杯底部的中间孔打入；控制室内温度在25℃-26℃之间，湿度60％以上进行棉苗培育观察；
s6、抗性分级：
根据发病情况对每株棉苗进行评分，然后计算病情指数及校正病指对不同野生棉的抗性水平进行分级，具体按照以下标准对棉花受害情况调查和评分：
0分：健壮，无症状；
1分：25％以下叶片显现症状，具有淡黄色，不规则病斑；
2分：25％-50％叶片显现症状，具有黄色、黄褐色病斑，叶片边缘略向上卷曲；
3分：50％-75％叶片显现症状，具有黄褐色病斑，叶片凋落；
4分：全株75％以上叶片显现症状，干枯脱落成光杆或早期枯死。
调查后计算出各材料的病情指数及校正病指。根据校正病指判断出实验材料的抗病性；
病情指数＝(∑fx)/(n×4)，f为该级别的株数，x为相应级别的指数(0-4)，n为调查总株数；
校正病指＝鉴定材料病指×50/感病对照实际病指，50为规定感病对照的标准病指。
本发明具有以下有益效果：
1、首次进行室内野生棉苗期的黄萎病抗性鉴定，这种鉴定方法对环境条件严格控制，材料和用具能保证不受其他病菌污染，可有效避免其他微生物对实验的干扰。通过针对野生棉设置的前处理和催芽处理，种子出苗均匀一致，根系发育完整，生长期一致，保证了鉴定的准确性。
2、常规四倍体棉花种质黄萎病抗性鉴定试验的感病对照都是四倍体，野生棉作为二倍体，与四倍体棉花处于长期地理隔离和生殖隔离的状态，形成了野生棉独特的形态和生理特征。把四倍体棉花作为野生棉黄萎病抗性鉴定的感病对照没有参考价值，甚至会影响结果的准确性，所以该方法采用戴维逊氏棉作为野生棉感病对照。
3、本发明根据棉花叶片发病症状显现的百分比进行评分，计算病情指数，然后根据指数大小进行客观分级。为棉花黄萎病抗性鉴定提供了系统客观的评价标准，对叶片受害情况进行量化，极大降低了人为主观因素造成的误差。
4、选用实验室微生物发酵液模拟黄萎病菌存在的土壤环境，这样相较于病圃鉴定，减少了因为土壤菌量不均匀所导致的鉴定结果不准确，使结果稳定可靠。
5、本发明周期短，不受外界环境限制，可快速鉴定野生棉材料的黄萎病抗性。野生棉苗期黄萎病抗性鉴定方法，处理后第14天即可进行抗病鉴定。较病圃鉴定更节约时间，可快速对野生棉苗期黄萎病抗性进行筛选，为棉花抗病育种提供技术支持。
6、野生棉种子使用量小。野生棉种子在自然条件下是无法正常萌发的，获得成株也十分困难，种子的收获量非常有限。本发明可用较少的种子量，获得准确的鉴定结果。
7、节省人力物力。野生棉苗期黄萎病抗性鉴定方法，使用商品一次性营养杯、一次性针管、配方简易的pda培养基，省去大量人力物力的投入，可进行大批量材料的鉴定，易于推广和利用。
具体实施方式
为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供了一种室内鉴定野生棉苗期黄萎病抗性的方法，包括以下步骤：
s1、种子预处理
供试种子经浓硫酸脱绒后，依据饱满度和成熟度来挑选种子，然后利用5％次氯酸钠浸泡种子8-10min，用清水清洗4-5次后晾干，将种子摊成一薄层，置于40℃烘箱中加热干燥1d。这样可以打破种子的休眠状态以使每一粒种子的生理期都保持一致。播种前在种子的珠孔端切一个小口，以不伤害胚根为准。前期实验发现有些野生棉种子的种壳较硬，不易破壳，切剥可以使种子保持一致的萌发吸水状态。
s2、催芽处理
采用20×20cm方形发芽纸，先平铺两层，用无菌水打湿，横向间隔摆放两排种子，每排各5粒，胚根向下，再盖一层发芽纸，将三层发芽纸从一侧卷起并使棉种固定，纸卷按不同棉种放入各自的发芽盒中，加入高度2-3cm的无菌水，保持湿润。将发芽盒置于温度28℃，湿度85％的光照培养箱中，遮光培养2-3d，待胚根长到1cm左右；
s3、移苗和育苗
将蛭石装入底部有四孔(底部中间1个孔，周边3个)的营养杯内，压实，在蛭石中央按压出一个凹坑。把萌发的幼苗，胚根向下，子叶向上放入坑内，随后覆盖一层蛭石，喷洒水分，保持基质湿润，移入人工气候室内，16h/8h昼夜，30℃培养至第一片真叶展平；
s4、培养鉴定用黄萎病菌
将冷藏保存的单孢菌系转至pda固体培养基上，25℃，活化7-10d。检查菌丝是否生长正常，将长有黄萎病菌的固体培养基，切成小块，转移至灭菌的pda液体培养基中，25℃，180r/min，培养4-5d。用四层纱布对菌液进行过滤。取滤液少许，滴在血球计数板上观察并计数，稀释菌液浓度至1.2×107个/ml。
s5、接菌处理
棉花材料培养两周，至一片真叶平展后接菌。使用一字头螺丝刀，从营养杯底部的周边3个孔(底部中间1个孔，周边3个)伸入3cm左右，轻微转动。用10ml注射器吸取8ml孢子悬浮液由营养杯底部的中间的孔打入。控制室内温度在25℃-26℃之间，湿度60％以上。
s6、抗性分级：
处理1周后持续关注发病情况，待感病对照病指达到50(％)左右进行发病情况的评分定级，分级标准为：
0分：健壮，无症状；
1分：25％以下叶片显现症状，具有淡黄色，不规则病斑；
2分：25％-50％叶片显现症状，具有黄色、黄褐色病斑，叶片边缘略向上卷曲；
3分：50％-75％叶片显现症状，具有黄褐色病斑，少数叶片凋落；
4分：全株75％以上叶片显症状，干枯脱落成光杆或早期枯死。
调查后计算出各材料的病情指数及校正病指。根据校正病指判断出实验材料的抗病性。
病情指数＝(∑fx)/(n×4)，f为该级别的株数，x为相应级别的指(0-4)，n为调查总株数。
校正病指＝鉴定材料病指×50/感病对照实际病指，50为规定感病对照的标准病指。
根据抗病指数定性鉴定材料对黄萎病的抗性级别：
实施例1
采用野生棉苗期黄萎病抗性鉴定方法对野生棉(三裂棉、瑟伯氏棉、异常棉和戴维逊氏棉)的抗黄萎病水平进行鉴定和评价。
1、棉花材料：
野生棉：三裂棉、瑟伯氏棉、异常棉和戴维逊氏棉(感病对照)。
2、种子的前处理：
将带短绒的种子进行浓硫酸脱绒，挑选大小一致、饱满、无虫害的成熟种子再用5％次氯酸钠溶液浸泡8-10min，清水洗净，晾干，置于40℃烘箱中平铺干燥1d以打破种子休眠，然后单面刀片将野生棉的种子珠孔端(尖端)切小口，露出种仁即可，以不伤害胚根为准。
3、催芽处理：
采用20×20cm清洁干净的方形滤纸作为发芽纸，ph值为6.0-7.5。先平铺两层发芽纸，用无菌水打湿，横向间隔摆放两排种子，每排各5粒，胚根向下，再盖一层发芽纸，将三层发芽纸从一侧卷起并使棉种固定，纸卷按不同棉种放入各自的发芽盒中，加入高度2-3cm的无菌水，发芽纸始终保持湿润。将发芽盒置于温度28℃，湿度85％的光照培养箱中，遮光培养2-3d，待胚根长到1cm左右；
4、移苗和育苗
将消毒后的蛭石装入底部有四孔的营养杯内，压实，在蛭石中央按压出一个凹坑。将萌发的幼苗，胚根朝下，子叶朝上放入坑内，随后覆盖一层蛭石，喷洒水分，保持基质湿润，移入人工气候室内，30℃，16h/8h昼夜培养至第一片真叶展平。
5、培养黄萎病菌液
将冷藏保存的单孢黄萎病菌系转至pda固体培养基上，25℃，活化7-10d。检查菌丝是否生长正常，将长有黄萎病菌的固体培养基，切成小块，转移至灭菌的pda液体培养基中，180r/min，25℃培养4-5d。用四层纱布过滤菌液。取滤液少许，滴在血球计数板上观察并计数，稀释菌液浓度至1.2×107个/ml。6、统计与抗性分级：
处理1周后持续关注野生棉苗期黄萎病发病情况。待感病对照病指达到50(％)左右，根据评分标准度对每一株棉苗进行评分。抗病水平分级：按照本发明的评分标准，对每个材料进行评分，依据公式计算病情指数，对材料的抗病水平进行分级。结果见表1。
表1：野生棉苗期黄萎病抗性水平评价结果
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。