一种复合微生物菌剂及其在发酵腐植酸褐煤产生黄腐酸中的应用的制作方法

本发明涉及一种微生物菌剂及其应用，具体涉及一种复合微生物菌剂及其在发酵腐植酸褐煤产生黄腐酸中的应用，属于微生物技术领域。

背景技术：

黄腐酸可广泛应用于工、农、医、牧等方面。以应用在农业方面为例，黄腐酸可促进植物生长，可控制作物叶面气孔的开放度，可减少蒸腾，可对抗旱情，可提高作物抗逆能力，可增产和改善作物品质。

目前，黄腐酸的生产主要采用化学方法，主要从风化煤中提取。我国有丰富的褐煤资源，但是褐煤燃烧的热效率低，且容易造成环境污染。传统的化学方法从褐煤中提取黄腐酸，不仅提取效率低，而且提取到的黄腐酸活性差、絮凝极限低，同时在提取过程中还会产生污染环境的二次污染物。

技术实现要素：

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种复合微生物菌剂，以及应用该复合微生物菌剂发酵腐植酸褐煤产生黄腐酸的方法，使用本发明提供的复合微生物菌剂来发酵腐植酸褐煤产生黄腐酸，与化学方法相比，不产生污染物，更加环保。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

一种复合微生物菌剂，其特征在于，由保藏编号为cgmccno.12905的枯草芽孢杆菌、保藏编号为cgmccno.13762的哈茨木霉和保藏编号为cgmccno.13763的草酸青霉组成。

前述的复合微生物菌剂，其特征在于，在前述复合微生物菌剂中，保藏编号为cgmccno.12905的枯草芽孢杆菌的孢子含量≥20亿/克，保藏编号为cgmccno.13762的哈茨木霉的孢子含量≥5亿/克，保藏编号为cgmccno.13763的草酸青霉的孢子含量≥8亿/克。

前述的复合微生物菌剂在发酵腐植酸褐煤产生黄腐酸中的应用。

前述的应用，其特征在于，应用方法为：将腐植酸褐煤与辅料混合，然后加入权利要求1前述的复合微生物菌剂，在底料中加水，控制湿度在60％，静置腐熟7～14d，之后再加水，搅拌均匀，室温静置2h，分离上清液，前述上清液中含黄腐酸。

前述的应用，其特征在于，前述辅料为麦麸和/或豆粕。

前述的应用，其特征在于，以体积比计，前述腐植酸褐煤、麦麸、豆粕、复合微生物菌剂的混合比例为7～10：0～3：0～3：1～3。

或者，应用方法为：将腐植酸褐煤与权利要求1前述的复合微生物菌剂混合，在底料中加水，控制湿度在60％，静置腐熟7～14d，之后再加水，搅拌均匀，室温静置2h，分离上清液，前述上清液中含黄腐酸。

前述的应用，其特征在于，以体积比计，前述腐植酸褐煤与复合微生物菌剂的混合比例为7～10：1～3。

本发明的有益之处在于：

(1)使用本发明提供的复合微生物菌剂来发酵腐植酸褐煤产生黄腐酸，与化学方法相比，不产生污染物，更加环保；

(2)废料可以作为有机肥，实现了绿色、高效、高质的可持续利用。

附图说明

图1是实施例1分离得到的上清液的红外光谱图；

图2是实施例2分离得到的上清液的红外光谱图；

图3是实施例3分离得到的上清液的红外光谱图；

图4是实施例4分离得到的上清液的红外光谱图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。

一、分离筛选枯草芽孢杆菌

1、筛选分离菌株

我们从青岛莱西市的褐煤堆肥发酵堆中采集土样，并将土样稀释10⁵倍。

选择lb培养基：蛋白胨10g、酵母浸粉5g、氯化纳10g、琼脂15g，水补至1l，ph自然。

将稀释后的样品均匀涂布在lb培养基上，37℃培养12h，然后挑取培养基上的菌落，纯化培养，得到一株菌株。

2、鉴定菌株

我们对上述筛选分离得到的菌株进行了鉴定，具体如下：利用16srrna、gyra基因和gyrb基因进行测序，并在ncbi数据库中进行比对。

比对结果：我们筛选分离得到的菌株的基因序列与数据库中bacillussubtilis的序列的相似性达到99％以上。

根据基因序列测定结果，我们最终确定上述筛选分离得到的菌株为枯草芽孢杆菌(bacillussubtlis)。

3、保藏菌株

2016年8月26日，我们将分离筛选得到的枯草芽孢杆菌保藏在了中国普通微生物菌种保藏中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmccno.12905，分类命名：枯草芽孢杆菌(bacillussubtlis)。

二、分离筛选哈茨木霉和草酸青霉

1、筛选分离菌株

我们从青岛莱西市的褐煤堆肥发酵堆中采集样品，将土样稀释10⁵倍。

选择pda培养基：马铃薯(去皮)200g、葡萄糖20g、琼脂15g，蒸馏水补至1l，自然ph。

将稀释后的样品均匀涂布在pda培养基上，27℃培养24h，然后挑取培养基上的菌落，纯化培养，得到两株菌株。

2、鉴定菌株

我们对上述筛选分离得到的两株菌株进行了鉴定，具体如下：利用its1-its5基因进行测序，并在ncbi数据库中进行比对。

比对结果：我们筛选分离得到的两株菌株，其中一株的基因序列与数据库中哈茨木霉(trichodermaharzianum)的序列的相似性达到99％以上，另外一株的基因序列与数据库中草酸青霉(penicilliumoxalicum)的序列的相似性达到99％以上。

根据基因序列测定结果，我们最终确定上述筛选分离得到的两株菌株分别为哈茨木霉(trichodermaharzianum)和草酸青霉(penicilliumoxalicum)。

3、保藏菌株

2017年3月14日，我们将分离筛选得到的哈茨木霉保藏在了中国普通微生物菌种保藏中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号分别为cgmccno.13762和cgmccno.13763，前者的分类命名为哈茨木霉(trichodermaharzianum)，后者的分类命名为草酸青霉(penicilliumoxalicum)。

三、制备复合微生物菌剂

1、活化菌种

将保藏编号为cgmccno.12905的枯草芽孢杆菌在lb液体培养基中活化12h，活化后的菌株作为原种。

将保藏编号为cgmccno.13762的哈茨木霉和保藏编号为cgmccno.13763的草酸青霉分别接种在pda平板培养基上，27℃暗培养7d，培养好的菌株作为原种。

2、制备种子液

将活化后的枯草芽孢杆菌在30℃下震荡15h，发酵好的液体作为种子液。

将活化后的哈茨木霉原种和草酸青霉原种分别接种在pda液体培养基上，27℃、121rpm暗培养4d，发酵好的液体作为种子液。

3、发酵培养

1^#发酵培养基：酵母膏5～10g/l、可溶性淀粉8～16g/l、葡萄糖4～8g/l、黄豆饼粉8～16g/l、牛肉膏6～12g/l、玉米粉8～16g/l、消泡剂适量，其余为水。

在本实施例中，1^#发酵培养基：酵母膏8g/l、可溶性淀粉10g/l、葡萄糖6g/l、黄豆饼粉12g/l、牛肉膏9g/l、玉米粉12g/l、消泡剂2g/l，其余为水。

向1^#发酵培养基中加入适量水，使1^#发酵培养基的初始ph值为7±5，高温灭菌，然后待1^#发酵培养基温度降到30℃以下时接入枯草芽孢杆菌种子液，之后在温度为30℃、通气量为180l/h、搅拌速度为200rpm的条件下发酵培养，待发酵液中芽孢率达到30～50％时停止发酵培养。

2^#发酵培养基：将麦麸加水，控制湿度在20％左右，121℃灭菌30min。

将哈茨木霉种子液和草酸青霉种子液分别接种到2^#发酵培养基中，27℃暗培养14d。

4、后处理

将枯草芽孢杆菌的发酵液进行喷雾干燥，得到枯草芽孢杆菌菌粉。

将发酵结束的哈茨木霉培养基烘干，粉碎，过100目筛子，得到哈茨木霉粉剂。经检测，粉剂中哈茨木霉孢子的含量≥200亿/克。

将发酵结束的草酸青霉培养基烘干，粉碎，过100目筛子，得到草酸青霉粉剂。经检测，粉剂中草酸青霉孢子的含量≥300亿/克。

5、混合

将枯草芽孢杆菌菌粉、哈茨木霉粉剂和草酸青霉粉剂按照1～60：1～40：1～70的质量比例混合，得到复合微生物菌剂，在该复合微生物菌剂中，枯草芽孢杆菌的孢子含量≥20亿/克、哈茨木霉的孢子含量≥5亿/克、草酸青霉的孢子含量≥8亿/克。

四、发酵腐植酸褐煤

在本实施例中，我们所使用的复合微生物菌剂，其中含有枯草芽孢杆菌的孢子20亿/克、哈茨木霉的孢子5亿/克、草酸青霉的孢子8亿/克。

实施例1

将腐植酸褐煤与复合微生物菌剂按照7：3的体积比混合，混合后在底料中加水，控制湿度在60％左右，然后静置腐熟7d，之后按照物料：水＝1：50的体积比再加水，搅拌均匀，室温静置2h，分离上清液。

经红外光谱分析，参照图1，该上清液在1720cm^-1、1620cm^-1、1400cm^-1、1250cm^-1处有吸收峰，与黄腐酸的吸收光谱相符，证实该上清液中含有黄腐酸。

该含有黄腐酸的上清液可直接利用，也可经干燥后得到黄腐酸粉末，残渣可以进一步提取或者直接作为肥料使用。

实施例2

将腐植酸褐煤与辅料麦麸混合，然后加入复合微生物菌剂，腐植酸褐煤、麦麸、复合微生物菌剂三者的体积比为8：1：1，混合后在底料中加水，控制湿度在60％左右，然后静置腐熟7d，之后按照物料：水＝1：50的体积比再加水，搅拌均匀，室温静置2h，分离上清液。

经红外光谱分析，参照图2，该上清液在1720cm^-1、1620cm^-1、1400cm^-1、1250cm^-1处有吸收峰，与黄腐酸的吸收光谱相符，证实该上清液中含有黄腐酸。

实施例3

将腐植酸褐煤与辅料豆粕混合，然后加入复合微生物菌剂，腐植酸褐煤、豆粕、复合微生物菌剂三者的体积比为7：1：2，混合后在底料中加水，控制湿度在60％左右，然后静置腐熟7d，之后按照物料：水＝1：50的体积比再加水，搅拌均匀，室温静置2h，分离上清液。

经红外光谱分析，参照图3，该上清液在1720cm^-1、1620cm^-1、1400cm^-1、1250cm^-1处有吸收峰，与黄腐酸的吸收光谱相符，证实该上清液中含有黄腐酸。

实施例4

将腐植酸褐煤与辅料麦麸、豆粕混合，然后加入复合微生物菌剂，腐植酸褐煤、麦麸、豆粕、复合微生物菌剂四者的体积比为8：0.5：0.5：1，混合后在底料中加水，控制湿度在60％左右，然后静置腐熟7d，之后按照物料：水＝1：40的体积比再加水，搅拌均匀，室温静置2h，分离上清液。

经红外光谱分析，参照图4，该上清液在1720cm^-1、1620cm^-1、1400cm^-1、1250cm^-1处有吸收峰，与黄腐酸的吸收光谱相符，证实该上清液中含有黄腐酸。

需要说明的是，在本发明的利用复合微生物菌剂发酵腐植酸褐煤产生黄腐酸的方法中，腐植酸褐煤、麦麸、豆粕、复合微生物菌剂四者的体积比可在7～10：0～3：0～3：1～3的范围内适当调整，静置腐熟的时间可适当延长至14d。

由此可见，使用本发明提供的复合微生物菌剂来发酵腐植酸褐煤产生黄腐酸，与化学法相比，不产生污染物，更加环保，废料还可以作为有机肥，实现了绿色、高效、高质的可持续利用，具有非常积极的社会意义，值得推广应用。

需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。