稳定低表达miR-497的HPMC细胞株及其应用的制作方法

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种稳定低表达mir-497的hpmc细胞株及其应用。

背景技术：

终末期肾脏病（endstagerenaldisease，esrd）是21世纪全人类面临的主要健康问题之一，esrd患者数以每年约10%的速度增长。近年来，随着高血压、肥胖、ⅱ型糖尿病发病率的逐年升高及人口老龄化的加剧，慢性肾脏疾病（chronickidneydisease，ckd）导致的esrd患者人数急剧增多。

esrd患者必须依赖肾脏代替治疗（renalreplacementtherapy，rrt）。目前已经有肾移植、血液透析（hemodialysis，hd）和腹膜透析（peritonealdialysis，pd）三大替代治疗方式。但是，rrt和hd费用昂贵，而pd具有保护残余肾功能、交叉感染少、居家透析、活动相对自由、花费相对较低等优势，已成为肾脏一体化疗法中的重要组成部分。

然而，临床研究发现，随着患者pd时间延长，高浓度葡萄糖及其在高温消毒时产生的降解产物、酸性透析液的低ph值、乳酸盐缓冲液的使用、透析液的高渗透压等生物不相容性因素和反复发作的腹膜炎，会引起腹膜形态和功能的改变，最终使腹膜纤维化（peritonealfibrosis，pf），导致超滤衰竭（ultrafiltrationfailure，uff），而其具体详细的发病机制尚未明了。

目前，已有研究表明，腹膜炎症、血管新生和间皮细胞损伤是pf的重要机制。血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor，vegf）在腹膜炎症、血管新生和间皮细胞损伤中发挥重要作用。mir-497高表达可抑制肿瘤组织血管新生及细胞外基质积聚。发明人前期实验已证明高糖可诱导损伤的腹膜间皮细胞mir-497表达减少，vegf表达增多。

为了深入探索pf的发生机制，寻找pf新的缓解措施，为患者继续维持pd奠定坚实的基础，对腹膜间皮细胞进行基因改造是十分必要的。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种稳定低表达mir-497的hpmc细胞株及其应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

构建一种稳定低表达mir-497的hpmc细胞株，其特征在于，所述细胞株的名称为：人腹膜间皮细胞稳定表达下调mir-497，其保藏编号为：cctccno：c2017235。

优选的，其基因组中含mirna-497inhibit质粒。

设计一种用嘌呤霉素筛选所述稳定低表达mir-497的hpmc细胞株的方法，所述嘌呤霉素的浓度为1.5～2.5μg/ml。

优选的，所述嘌呤霉素的浓度为1.8～2.2μg/ml。

优选的，所述嘌呤霉素的浓度为2μg/ml。

所述稳定低表达mir-497的hpmc细胞株在调控hpmc细胞vegf表达中的应用。

本发明所述的稳定低表达mir-497的hpmc细胞株，已于2017年10月19日保藏在中国典型培养物保藏中心，其简称为cctcc，地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山（八一路299号）武汉大学中国典型培养物保藏中心，该稳定低表达mir-497的hpmc细胞株在保藏中心的保藏编号为：cctccno：c2017235。

与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：

1.本发明首次制备出在hmpc细胞中稳定mir-497表达下调的细胞株。

2.本发明论证用嘌呤霉素筛选稳定低表达mir-497的hpmc细胞株的最佳筛选浓度为2μg/ml。

3.本发明论证hpmc细胞中mir-497的表达与vegf呈负相关。

4.本发明制备出的稳定mir-497表达下调的hmpc细胞株，可作为基础的试验材料和模型细胞株，用于进一步的动物实验乃至临床试验，可用于探索pf的发生机制，寻找pf新的缓解措施，为患者继续维持pd开辟新道路，意义重大。

附图说明

图1为mirna-497minic的质粒图谱图；

图2为mirna-497inhibit的质粒图谱图；

图3为mirna-497minic转染293t细胞的荧光显微镜检测图；

图4为mirna-497inhibit质粒转染293t细胞的荧光显微镜检测图；

图5为pcr检测mirnaorf的溶解曲线图；

图6为pcr检测mirnashrna的溶解曲线图；

图7为rt-pcr检测hpmc细胞稳转株中orf/shrna的表达柱状图；

图8为hpmc细胞中mir-497表达上调和下调对vegfmrna表达的影响图；

图9为hpmc细胞中mir-497表达上调和下调对vegf蛋白质表达的影响图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例一：实验材料

1.所用主要仪器及耗材如表1所示：

表1仪器及耗材

。

2.所用主要试剂如表2所示：

表2试剂

。

实施例二：重组质粒转染293t细胞

1.细胞培养

（1）293t细胞由郑州大学第一附属医院肾脏病基础研究室原代培养。

（2）细胞常规培养：

293t细胞用含10%胎牛血清的dmem培养基培养，置于37℃，5%co2培养箱中培养，根据培养基颜色及细胞生长情况更换新鲜培养基。

2.质粒转染

（1）mirna-497minic和mirna-497inhibit质粒由genecopoeia构建，质粒图谱如图1和图2所示；

（2）选取生长状态良好的处于对数生长期的293t细胞1×10⁵，接种于6cm细胞培养皿中，培养过夜；

（3）更换1%fbs培养基同步化处理细胞12h，依次接种于新的6cm培养皿中；

（4）10%fbs，dmem，37℃，5%co2培养，待细胞均匀地完全地贴壁于生长后且细胞密度大于80%用于质粒转染；

（5）往无菌ep管加入质粒7.5μg，以opti-memi稀释至200μl；在另一无菌ep管内，以opti-memi稀释15μlendofectin转染试剂；边轻柔进行涡旋，边往质粒中滴加以上稀释endofectin转染试剂，不可颠倒添加顺序，室温培养该溶液10～25min，使质粒-endofectin混合物产生；

（6）将质粒-endofectin复合物接加入细胞板，轻柔涡旋平板使复合物分散，细胞在co2条件下，37℃过夜培养8～14h，以加入2～5%热灭活胎牛血清、青霉素和链霉素的新鲜dmem培养基更换旧培养基并继续在co2条件下，37℃继续培养；

（7）转染48h后荧光显微镜检测荧光，判断转染效率；

（8）收集细胞提取rna及蛋白用于下游检测。

结果如有绿色荧光的图3和有红色荧光的图4所示所示，mirna-497minic和mirna-497inhibit质粒分别转染到了293t细胞中。

实施例三：筛选重组细胞株

（1）抗生素母液的配制：

取抗生素固体粉末溶于无菌的ddh2o中，4℃保存；

母液的配制浓度为：嘌呤霉素10mg/ml，用细胞培养基稀释1000倍，稀释成终浓度为10µg/ml，本发明的最少致死浓度为2µg/ml；

（2）药筛：

细胞胰酶消化计数后，按每孔500µl筛选培养基、1～5×10⁴个细胞接种24孔板中的12个孔，其中每个梯度2个复孔；另外2孔作为不加药对照，在37℃、5%co2条件下培养；

根据细胞大小和生长快慢调节细胞接种量，保证开始药筛时细胞密度为20～35%，因细胞处于生长状态时，抗生素产生作用效果，细胞生长代谢旺盛，抗生素效果显著；

（3）换液：

根据培养基的颜色和细胞生长情况，每2～3天更换一次筛选培养基。保持抗生素筛选浓度不变。

实施例四：慢病毒包装及纯化

1.dna溶液的制备

使用magen无内毒素质粒抽提试剂盒，提取慢病毒包装系统中所需的minic克隆和inhibit克隆，使用紫外分光光度计测定提取物的浓度和纯度，所提质粒dna的a260/a280值在1.8～2.0之间，进行后续实验。

2.病毒包装

（1）培养包装细胞：

将1.3×10⁶～1.5×10⁶的293t细胞接种入10cm的细胞培养皿中在37℃、5%co2条件下进行培养两天，培养皿中加入含10%热灭活胎牛血清dmem培养基10ml，当细胞的融合率达到70～80%时，进行质粒的转染；

（2）准备dna-endofectin慢病毒混合物：

使用hipureplasmidefminikit试剂盒，往无菌ep管加入orf/shrna表达质粒2.5μg、lentipachiv混合试剂5.0μl，以opti-memi稀释至200μl。在另一个无菌ep管内，以opti-memi稀释15μlendofectin转染试剂。同时，将上述稀释的endofectin转染用试剂滴加到dna和lentipachiv试剂的混合溶液中，按照添加顺序进行添加，将该溶液，置于室温下孵育10～25min，产生dna-endofectin复合物；

（3）转染包装细胞：

将dna-endofectin复合物加入细胞板中，将细胞板进行轻柔的涡旋，以利于复合物的分散。细胞在co2条件下，37℃过夜培养，用新鲜的含2～5%热灭活的胎牛血清、青霉素以及链霉素的dmem培养基更换旧的培养基，培养基中加入1/500体积的titerboost试剂，置于37℃、5%co2条件下培养；

（4）经过48h的转染后收获慢病毒，将收集到培养基离心10min，转速500×g，用0.45μm的低蛋白结合pes过滤膜过滤上清液，弃去沉淀，即得到含慢病毒的培养基。

3.慢病毒滴度检测

使用lenti-pactmhiv和fivqrt-pcrtitrationkits进行快速、简单的慢病毒滴度检测。使用的试剂盒包括rna提取试剂盒、qrt-pcr试剂盒以及对照用的标准品。采用sybr®green检测方法的qrt-pcr技术定量慢病毒rna基因组，结果如图5和图6所示。

反应条件说明：95℃10min一个循环，（95℃15s，60℃30s，pcr仪采集荧光信号）40个循环。

引物信息如表3所示：

表3引物信息

。

实施例五：慢病毒感染人腹膜间皮细胞（hpmc）

1.慢病毒感染moi值预实验

（1）设置moi梯度：按照不加病毒0、10、20、30、50、80和100来设置moi梯度，不加病毒组用来判定细胞状态；

（2）将要感染慢病毒的细胞按每孔接种2×10⁴个细胞的量接种于24孔板中，以第二天的融合度达到30%～40%为宜。置37℃培养箱培养24h；

（3）按照设置好的moi值算好每孔需要加的病毒量；

每孔加病毒量按以下公式：

加病毒量（μl）=moi×细胞数/滴度（tu/ml）×1000

（4）按照算好的病毒量吸取病毒原液加入培养基中，摇动24孔板混匀，加完病毒的孔中再加入polybrene，终浓度5μg/ml，摇动孔板混匀置37℃培养箱继续培养24h；

（5）提前将培养基置于37℃预热，弃去含病毒的旧培养基，重新吸取预热好的新鲜完全培养基，加入24孔板中，置于37℃培养箱继续培养；

（6）第五天时观察细胞感染效率，确定合适的moi值。

moi值=病毒数/细胞数。

2.慢病毒感染hpmc细胞

hpmc细由郑州大学第一附属医院肾脏病基础研究室原代培养。

（1）将状态良好的hpmc细胞接种到24孔板中，计数后，进行铺板，每孔加入500μl的培养基，保证第二天感染病毒时融合率达到30～40%，以7×10⁴cells/孔的密度接种于新的24孔板；

（2）24h后，选择的合适moi值为20，进行病毒的感染。将病毒加完的孔中再加入polybrene，至终浓度为5μg/ml，摇动24孔板便于混匀，置37℃培养箱继续培养24h；

（3）病毒感染8～12h后，观察细胞状态：如细胞状态差，尽快更换新鲜培养基；如细胞状态良好，可以在24h内换液，但不宜超过24h，更换新鲜培养基后再将24孔板置于5%co2培养箱培养；

（4）病毒感染72h后，在荧光显微镜下观察细胞，估算慢病毒感染目的细胞的效率，若荧光弱，可到96h后观察，如果96h仍无荧光，即感染实验失败。

实施例六：hpmc细胞稳转株的筛选

1.稳转株筛选

（1）嘌呤霉素最优浓度筛选

以7×10⁴cells/孔的密度将hpmc细胞在24孔板内铺板，置于5%co2培养箱孵育过夜。

准备筛选培养基：用完全培养基将配好的嘌呤霉素（1mg/ml）进行梯度稀释，最终配成的培养基含嘌呤霉素浓度为：0.5μg/ml、1μg/ml、1.5μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、6μg/ml。

细胞孵育过夜，先加入一定量的筛选培养基，然后再次进行孵育细胞。48h后更换新的筛选培养基。每日对孵育的细胞进行监测、观察其存活细胞的比例。

持续筛选孵育的细胞4天后，最佳的嘌呤霉素筛选浓度就是能使孔中所有hpmc细胞死亡的最低浓度。

试验结果显示：确定hpmc细胞的最佳筛选浓度为2μg/ml。

（2）慢病毒感染细胞和稳定细胞系筛选

以5～8×10⁴cells/孔的细胞密度在24孔板内铺板，将24孔板置于5%co2培养箱孵育过夜。加入病毒颗粒，加polybrene至5μg/ml；

病毒感染细胞8～12h，弃去培养基，每孔加入500μl新鲜的完全培养基，置5%co2、37℃培养箱培养；

病毒感染细胞72h，使用嘌呤霉素筛选培养基替换旧的完全培养基，继续培养、传代扩增；

制备筛选培养基：先确定杀灭曲线，再配制含有2μg/ml嘌呤霉素的新鲜培养基；

按2～3天的周期更换新鲜的筛选培养基；

每天荧光显微镜下观察细胞，记录活细胞生长比例和荧光蛋白的表达水平和比例。

结果显示：嘌呤霉素最佳筛选的时间在3～10天之间，得到hpmc细胞稳转株。

实施例七：实时荧光定量pcr鉴定hpmc细胞稳转株

6孔板中，分别接种hpmc细胞、hpmc细胞hif-2αorf/shrna稳转株，用trizol法提取细胞的总rna，反转录得到cdna。

以人β-actin基因作为内参，hif-2α和β-actincdna引物序列均由genecopoeia合成。

20μl反应体系，反应条件为：95℃5min，进入45次循环（95℃45s，60℃1min采集荧光），最后55℃5min，实验重复进行3次。

rt-pcr结果如图7所示，表达效率分析结果如表4所示：

表4表达效率分析

。

结果显示荧光定量pcr检测结果显示过表达细胞株中mir497表达水平显著高于对照细胞株及正常细胞株，mir-497可以在hpmc细胞系中有效的上调mir-497表达；构建的mir-497下调细胞株中，mir-497inhibit可以在hpmc细胞系中有效的抑制mir-497表达。

稳定mir-497表达上调和稳定mir-497表达下调的hpmc细胞株的名称为：人腹膜间皮细胞稳定超表达mir-497，细胞株的保藏编号为：cctccno：c201776；稳定低表达mir-497的hpmc细胞株，细胞株的名称为：人腹膜间皮细胞稳定低表达mir-497，细胞株的保藏编号为：cctccno：c2017235。

实施例八：mir-497表达上调和下调对hpmc细胞中vegf表达的影响

1.对vegf的mrna表达的影响

rt-pcr检测稳定mir-497表达上调和稳定mir-497表达下调及对照组hpmc细胞中vegf的mrna表达，克隆vegf的引物序列为：

vegf-f：gtgaccacattcactgtgagcct

vegf-r：ggctcaccgccttggcttgt。

结果如图8所示：

可见稳定mir-497表达上调的hpmc细胞系中，vegf的mrna表达明显少于稳定mir-497表达下调的hpmc细胞株、对照组及正常组细胞株；稳定mir-497表达下调的hpmc细胞系中，vegf的mrna表达明显多于稳定mir-497表达上调的hpmc细胞株、对照组及正常组细胞株。

说明随着hpmc细胞中mir-497表达增多，vegf的mrna表达减少。

2.对vegf的蛋白质表达的影响

westernblot检测稳定mir-497表达上调和稳定mir-497表达下调及对照组hpmc细胞中vegf的蛋白质表达：

分别培养hpmc细胞正常组，稳定表达mir-497上调和稳定表达mir-497下调及其对照组的细胞株，提取总蛋白，把蛋白样品上样到sds-page胶加样孔，选择选择恒压80v电泳，目的蛋白被分离后停止电泳。然后利用pvdf膜在恒流250ma，冰浴，转膜70min，牛奶封闭2h，一抗封闭过夜。用1×tbst洗3遍，每次10min。二抗孵育2小时，1×tbst洗3遍，每次10min，曝光。

结果如图9所示：

可见稳定mir-497表达上调的hpmc细胞系中，vegf的蛋白质表达明显少于稳定mir-497表达下调的hpmc细胞株、对照组及正常组细胞株；稳定mir-497表达下调的hpmc细胞系中，vegf的蛋白质表达明显多于稳定mir-497表达上调的hpmc细胞株。

说明随着hpmc细胞中mir-497表达增多，vegf的蛋白质表达减少。

3.结论

稳定mir-497表达上调的hpmc细胞系中，vegf的mrna和蛋白质表达明显少于稳定mir-497表达下调的hpmc细胞株；稳定mir-497表达下调的hpmc细胞系中，vegf的mrna和蛋白质表达明显多于稳定mir-497表达上调的hpmc细胞株。

hpmc细胞中mir-497的表达与vegf的表达呈负相关。

鉴于vegf在腹膜炎症、血管新生和间皮细胞损伤中发挥重要作用，与腹膜纤维化有关，在hpmc细胞中调控mir-497表达可探索pf的发生机制，寻找pf新的缓解措施，为患者继续维持pd奠定基础。

上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。

sequencelisting

<110>郑州大学第一附属医院

<120>稳定低表达mir-497的hpmc细胞株及其应用

<130>2017

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<170>patentinversion3.2

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<213>人工合成

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