本发明涉及病毒基因工程领域，特别涉及一种融合rgd的汉坦病毒样颗粒及其制备方法。
背景技术：
病毒样颗粒(viruslikeparticles，vlps)，是一种不含有病毒基因组的纳米颗粒，可由全部或部分病毒结构蛋白自组装构成，是一种非病毒载体。许多病毒结构蛋白都具有自动组装成vlps的能力，在形态结构上与天然的病毒颗粒相似，具有很强的免疫原性和生物学活性。vlps在结构上允许外源基因或基因片段的插入而形成嵌合型vlps并将外源性抗原展示在其表面。目前，至少有30种vlps已经在文献中报道这些vlps在生物医学各个领域发挥重要作用，大多作为疫苗载体研究，也可作为病毒感染途径研究或是作为纳米颗粒应用。
汉坦病毒为单负链rna病毒，直径为80-210nm，平均直径为120nm，呈圆形或卵圆形，有双层膜，内浆为疏松的颗粒性线状结构。汉坦病毒基因组有l、m和s三个片段，长度约6.5kb，3.6kb和1.7kb，三个基因片段均由单一的长开放读码框架组成，分别以病毒rna为模板从3’-5’方向转录相对应的mrna(3’-5’)，然后翻译合成相对应的基因产物即病毒依赖于rna的rna聚合酶(l)，包膜糖蛋白(g1和g2)，病毒核壳蛋白(np)。汉坦病毒膜蛋白构成病毒最外层包膜表面镶嵌的刺突，存在血凝素抗原和中和抗原决定簇，可诱导寄主产生中和抗体，具有保护作用。
肾综合征出血热(hfrs)和汉坦病毒肺综合征(hps)均是由汉坦病毒属病毒引起的急性传染病。hfrs的病原体(汉坦病毒、汉城病毒、普马拉病毒和多布拉伐病毒等)主要分布于有着几千年文明历史的欧亚大陆，在国际上多称为旧世界汉坦病毒；而辛诺柏病毒、安弟斯病毒等hps的病原体主要分布于仅有几百年文明史的南北美洲新大陆，故也称为新世界汉坦病毒。肾综合征出血热(hemorrhagicfeverwithrenalsyndrome，hfrs)是由汉坦病毒引起的急性病毒性传染病，以鼠类为主要传染源的自然疫源性疾病。主要表现为发热、出血、充血、低血压休克及肾脏损害。该病危害严重，病死率高，中国是世界上肾综合征出血热疫情最严重的国家，目前，对于该病尚无特异有效的治疗药物，主要靠疫苗进行预防。rgd肽是含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的短肽，广泛存在于生物体内，作为配体相互作用的识别位点，介导小分子核酸及细胞之间的相互作用。
笔者通过反复的生物学假设和实验方法，最终得到通过使汉坦病毒样颗粒携带rgd肽作为药物靶向配体，使得当将汉坦病毒样颗粒作为基因治疗的转移载体时，能让载体更好的识别靶位肿瘤细胞，从而减少对人体正常细胞的损害，此外，利用原核表达载体降低操作难度，使该方法更好的适于工业生产。
技术实现要素：
鉴于以上问题，本发明提供了一种携带rgd肽的汉坦病毒样颗粒，使得当将汉坦病毒样颗粒作为基因治疗的转移载体时，能让载体更好的识别靶位肿瘤细胞，从而减少对人体正常细胞的损害。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明中一种肿瘤基因治疗中使用的融合rgd的汉坦病毒样颗粒及其制备方法，所述hfrs病毒样颗粒上融合rgd短肽。
优选的，所述rgd短肽插入到hfrs病毒样颗粒的m片段区。
优选的，所述融合rgd短肽的hfrs病毒样颗粒是通过构建原核表达载体pet30a-rgd-hfrs原核蛋白表达获得。
一种融合rgd汉坦病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：
s1.mrna的提取按照mrna小量制备试剂盒说明书进行操作，最终根据od260/od280比值确定rna的纯度和浓度；
s2.逆转录反应合成cdna按照rt-pcr试剂盒说明书操作，在冰上操作；
s3.pcr扩增hfrs目的片段按照pcr试剂盒说明书操作，在冰上配制pcr反应体系；
s4.双酶切配置酶切反应体系，将酶切体系在37℃孵育1h，加入10×loadingbuffer终止反应；
s5.酶切产物的连接配置10μl连接反应体系，吹打混匀连接反应液，瞬时离心将溶液收集到管底，在16℃下连接过夜；
s6.重组产物鉴定经pcr和质粒双酶切的鉴定实验后，将连接产物pet-30a-hfrs进行测序鉴定；
s7.pcr扩增rgd基因片段设计引物，配制pcr反应体系，置于pcr仪上；
s8.重组质粒的转化解冻感受态细胞，加入连接产物，于冰上放置30min，
加入预热的水浴中的lb液体培养基900μl，于37℃下，在摇床上转速为40rpm转动45～60min，弃去上清，留约100μl，缓慢吹匀，涂板，在恒温箱中于37℃下，倒置过夜培养。
s9.诱导表达挑取含表达载体pet-30a质粒的大肠杆菌bl21单菌落，在lb培养基中培养至od600值为0.4～0.6之间结束；加入100μl0.1mol·l-1iptg，使其工作浓度为0.1mmol·l-1，恒温摇床中，25℃下250rpm，开始诱导，诱导至4h时取出菌液12,000rpm离心1min富集到离心管中，弃尽上清，加入1ml破菌缓冲液以洗涤沉淀，使用移液器彻底吹打悬浮，12,000rpm离心1min，弃尽上清，加入500μl破菌缓冲液；细胞超声破碎仪破碎后离心分离，取上清于一新的离心管中，上清液中既含有融合rgd短肽的hfrs病毒样颗粒。
优选的，所述步骤s2中反应体系为：
优选的，所述步骤s3中pcr反应体系为：
优选的，所述步骤s3中pcr反应条件为：
优选的，所述步骤s4中双酶切反应体系为：
优选的，所述步骤s5中酶切产物的连接反应体系为：
优选的，所述步骤s7中的pcr反应体系为：
本发明的优点和有益效果在于：提供一种携带rgd肽的汉坦病毒样颗粒，使得当将汉坦病毒样颗粒作为基因治疗的转移载体时，能让载体更好的识别靶位肿瘤细胞，从而减少对人体正常细胞的损害，此外，制备方法中利用原核表达载体降低操作难度，使该方法更好的适于工业生产。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为原核表达载体pet30a-rgd-hfrs。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
实施例1.mrna的提取
按照mrna小量制备试剂盒说明书进行，具体操作如下：
1)向250μl经抗凝处理的血清样本中加入750μltripurelsreagent，用移液枪反复抽打并振荡混匀，在室温裂解5min；
2)将氯仿以每毫升0.2ml的比例加入到裂解液中，振荡充分使样品混匀；
3)将混合物于4℃以12000r/min离心15min，使混合物分为两相，dna和蛋白质被抽提进有机相，rna留在水相。将上层水相转移到一个新的离心管中；
4)加异丙醇与rna沉淀液到水相中，使其充分混匀后，在室温下放置25min，以使rna沉淀；
5)以12000r/min于4℃下离心15min，去除上清，收集沉淀的rna；
6)使用75％乙醇充分洗涤沉淀，操作两次，再次重复上一步离心过程；
7)室温放置，让乙醇完全挥发干净，但不能使沉淀下来的rna完全干透；
8)加入50μl的无rnase的水，反复吹打混匀，充分溶解rna；
9)以超纯水对照调零，使用微量紫外分光光度计分别测定rna在260nm和280nm两处的吸光度。根据od260/od280比值确定rna的纯度和浓度。
实施例2.逆转录反应合成cdna
按照rt-pcr试剂盒说明书操作，在冰上配制逆转录反应体系，操作于0.2ml微量离心管进行。具体的成分如下所示：
在pcr仪器内，将微量离心管放入相对应的孔中，在42℃反应1h，然后在70℃水浴锅中水浴10min使rt酶失活，将得到的rt产物cdna置于-80℃以保存备用。
实施例3.pcr扩增hfrs目的片段
按照pcr试剂盒说明书操作，在冰上于0.5ml微量离心管中配制pcr反应体系。其中，
上游引物p1：5’-atggacatcgaccactac-3’；
下游引物p2：5’-ttagtggtggtggtggtggtgcggcagagtgg-3’。
具体成分如下所示：
配完体系后，盖上离心管盖子，上下颠倒几次混匀，立即置于pcr仪上，执行扩增，反应条件如下所示：
结束反应，将pcr产物放置于4℃待电泳检测或于-20℃长期保存。
实施例4.双酶切
按如下体系，将各组分混匀：
将上述酶切体系在37℃孵育1h，加入10×loadingbuffer终止反应，将样品加入1.2％琼脂糖凝胶胶孔中，以8v/cm的电压电泳20min，在凝胶成像仪中观察是否有目的片段。
实施例5.酶切产物的连接
按如下体系，将各组分混匀，形成10μl体系：
吹打混匀连接反应液，瞬时离心将溶液收集到管底，在16℃下连接过夜；
实施例6.重组产物鉴定
经pcr和质粒双酶切的鉴定实验后，将连接产物pet-30a-hfrs送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序鉴定。
实施例7.pcr扩增rgd基因片段
在ncbi上查得rgd序列，采用非对称互补引物合成方法，设计正负两条引物，正向引物的5’端加保护碱基c及xhoⅰ酶切位点(ctcgag)，负向引物5’端加bglⅱ酶切位点(agatct)及保护碱基c，为融合基因连入表达载体奠定基础。设计引物如下：
上游引物p3：5’-cctcgagggttccaacctggaagacagaggtgat-3’；
下游引物p4：5’-cagatctcagctgatgatccggaaaaaagcccagcgggccatcacctct-3’。
按照pcr试剂盒说明书操作，在冰上于0.5ml微量离心管中配制pcr反应体系：
配完体系后，盖上离心管盖子，上下颠倒几次混匀，立即置于pcr仪上，使合成的rgd片段55℃退火10min扩增，以便后续将其插入到载体pet-30a-hfrs上，如图1所示。反应结束后，将pcr产物放置于4℃待电泳检测。
实施例8.重组质粒的转化
1)感受态细胞使用前先在0℃解冻，每支ep管中轻柔加入100μl细胞；
2)向ep管中加入体积为1μl的连接产物，于冰上放置30min；
3)42℃下90s，忌摇动，迅速放置于冰上3～5min；
4)超净台中加入预热的水浴中的lb液体培养基900μl，于37℃下，在摇床上转速为40rpm转动45～60min；
5)在1000rpm下20s，于超净台中弃去上清，留约100μl，缓慢吹匀；
6)涂板前，要将平板在37℃下预热，将涂布棒从乙醇烧杯中取出，在火焰上来回灼烧数秒，感觉涂布棒不再烫手时取100μl感受态细胞均匀涂布在lb固体平板(含10mg/l卡那霉素)上；在恒温箱中于37℃下，倒置过夜培养。
实施例9.诱导表达
1)挑取含表达载体pet-30a质粒的大肠杆菌bl21单菌落，在10mllb培养基(含浓度为5mg·l-1的卡那霉素)中，恒温摇床中37℃，250rpm培养至od600值为0.4～0.6之间结束，以上所有操作均需要超净台中进行；
2)加入100μl0.1mol·l-1iptg，使其工作浓度为0.1mmol·l-1，恒温摇床中，25℃下250rpm，开始诱导，诱导至4h时取出菌液12,000rpm离心1min富集到离心管中，弃尽上清，加入1ml破菌缓冲液以洗涤沉淀，使用移液器彻底吹打悬浮，12,000rpm离心1min，弃尽上清，加入500μl破菌缓冲液；
3)使用细胞超声破碎仪于300w下，冰浴，超声破碎10min，工作2s，间歇2s；
4)将经细胞超声破碎的细菌细胞破碎液以12,000rpm离心1min离心分离，取上清于一新的离心管中，上清液中既含有融合rgd短肽的hfrs病毒样颗粒。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>宫丽丽
<120>一种肿瘤基因治疗中使用的融合rgd的汉坦病毒样颗粒及其制备方法
<130>11
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>18
<212>dna
<213>homosapiens
<400>1
atggacatcgaccactac18
<210>2
<211>32
<212>dna
<213>homosapiens
<400>2
ttagtggtggtggtggtggtgcggcagagtgg32
<210>3
<211>34
<212>dna
<213>homosapiens
<400>3
cctcgagggttccaacctggaagacagaggtgat34
<210>4
<211>49
<212>dna
<213>homosapiens
<400>4
cagatctcagctgatgatccggaaaaaagcccagcgggccatcacctct49