一种人巨细胞病毒核酸检测试剂盒的制作方法

本发明涉及一种人巨细胞病毒核酸荧光PCR检测试剂盒，属于生物技术领域。

背景技术：

人巨细胞病毒（Human Cytomegalic Virus，HCMV) 属于疱疹病毒科，是人类疱疹病毒组中最大的一种病毒，直径200nm，核心为双股线形DNA，有典型的疱疹病毒结构。HCMV只能在人纤维母细胞培养中增殖，而不能在其他动物细胞中生长，增殖非常缓慢，初次分离需1个多月才能出现细胞致病变作用(CPE)，导致细胞变圆，膨胀，细胞及核巨大化，核周围出现大型嗜酸性包涵体，故又称为巨细胞包涵体病(Cytomegalic inclusion disease，CID)。人感染HCMV是一种全身性感染综合征，在临床上为多脏器受累，症状复杂多样，多数为隐性感染，少数可发生视网膜炎、肝炎、肺炎、脑炎、结肠炎、单核细胞增多症、血小板减少性紫癜等多器官病变。HCMV感染十分普遍，呈世界性流行，在人群中感染率很高，发达和发展中国家的感染率分别为45～50%和90%以上。HCMV病毒可长期潜伏体内，一旦机体免疫力减退，病毒将会被激活而致病，特别是对白血病、免疫移植病人，潜伏的疱疹病毒活化形成复发感染，严重时引起移植器官坏死并危害病人生命，威胁人类健康。此外，由于巨细胞病毒可经宫内感染造成死胎、流产、早产，也可导致先天畸形，因而HCMV感染还可影响到优生优育和人口质量。

临床实验室HCMV感染检测一般采用金标准病毒分离培养、血清学以及核酸检测方法，并各有优缺点。由于HCMV生长周期长（30天），病毒分离培养法不适合临床实验室使用。血清学检测利用抗原抗体反应检测病毒相关蛋白，具有检测快速、简单、易于操作的优点，但检测灵敏度不高，由于感染后抗体产生“窗口期”，检测还存在一定的滞后性。核酸检测技术中，特别是荧光PCR方法具有特异性和灵敏度高、可定量、操作简便、成本较低等优点，能检测全血、血浆、血清、尿液以及乳汁等样本中HCMV核酸的存在，已经作为HCMV感染检测的辅助工具推广应用。

本发明基于上述技术背景，目的是设计筛选高灵敏检测人巨细胞病毒特异性引物探针，开发HCMV核酸荧光PCR试剂盒，能实现HCMV病毒核酸的高灵敏度定性或定量检测，为临床HCMV感染的辅助诊断或治疗提供依据。

技术实现要素：

本发明提供一种高灵敏检测人巨细胞病毒核酸的荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒采用一对人巨细胞病毒扩增引物和两条荧光探针，一对引物具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的序列，两条荧光荧光探针具有SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4序列、且荧光探针5’端标记相同的荧光素或荧光染料报告基团，3’端标记荧光淬灭基团。试剂盒采用SEQ ID NO：1～4引物和荧光探针，辅以Tris-HCl、KCl、dNTPs、Taq DNA聚合酶以及UNG酶组成的荧光PCR反应体系，能高灵敏定性或定量检测全血、血浆、尿液、乳汁样品中人巨细胞病毒核酸。试剂盒操作简便快速、检测结果灵敏准确，可作为人巨细胞病毒感染的有效辅助检测手段。

技术方案

通过对GenBank中人巨细胞病毒基因序列查询，用分子生物学引物探针设计软件对各种来源的基因序列进行比对设计，按照TaqMan荧光PCR设计的原则，优选了一对HCMV特异性上下游引物扩增病毒基因组中高度保守高度保守的即可早期基因（IE2）中UL122区域的139bp片段靶序列，上下游引物之间设计了在检测靶序列位置上互不重叠或互补的两条荧光探针A、B，其中荧光探针A与靶序列反义链互补、荧光探针B与靶序列正义链互补，因此一次PCR循环反应能产生2个荧光分子，大大提高了检测灵敏度。4条引物和探针核苷酸序列（5’ -> 3’）如下。

上游引物：AgAgAgCgATTggTgTTgCg，序列记为SEQ ID NO：1。

下游引物：CCgAgTTggACAACgAgAAgg ，序列记为SEQ ID NO：2。

荧光探针A：ATgCggCTCACCTCgTCAATCTTg ，序列记为SEQ ID NO：3，其中探针5’端标记FAM（6-carboxy-fluorescein）荧光报告基团、3’端标记BHQ（Black hole quencher）淬灭基团。

荧光探针B：AAgAACACCCCCTTCTgCACACCC ，序列记为SEQ ID NO：4，其中探针5’端标记FAM荧光报告基团、3’端标记BHQ淬灭基团。

两条荧光探针5’ 端要求标记相同的荧光素或荧光染料报告基团，除了FAM荧光基团，也可以选择JOE（carboxy-dichloro-dimethoxyfluorescein）、VIC、HEX（carboxy-hexachloro-fluorescein）、ROX（5-Carboxy-X-rhodamine）、Cy3（Cyanine 3）、Cy5（Cyanine 5）等荧光基团，3’端除了标记BHQ淬灭基团，也可以选择TAMRA（Carboxy-tetra-methyl-rhodamine）等淬灭基团。

本发明设计HCMV一对引物之间、两条荧光探针之间具有非常接近的Tm值，且荧光探针Tm值高于引物Tm值5～10℃，引物探针序列之间没有明显的引物二聚体或发夹结构，保证了扩增的特异性和高效率，有利于提高试剂盒检测灵敏度。

所述扩增反应体系各成分组成如下：10mM Tris-HCl（pH8.3）、50mM KCl、0.2～0.5mM dNTPs、1.5～5 mM MgCl₂、各0.1～0.5μM引物和荧光探针（SEQ ID NO：1～4）、1～5 U Taq DNA聚合酶和0.01～1 U UNG酶，提取的模板10μl，总反应体积30μl。更具体的，扩增反应液各成分终浓度为：Tris-HCl（pH8.3）10 mM，KCl 50 mM，dATP、dGTP、dCTP、dUTP各0.2 mM，MgCl₂ 3.5 mM，一对引物（SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4）各0.3μM，两条荧光探针（SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4）各0.2 μM，Taq DNA聚合酶2 U，UNG酶0.5 U。

所述HCMV核酸检测试剂盒使用扩增程序如下：50℃ 2min、94℃ 5min后按照94℃ 10sec、60℃ 45sec循环扩增45次，循环步骤中60℃时采集FAM通道波长荧光信号。

所述HCMV核酸检测试剂盒的质控品包括1个阴性对照、1个阳性对照、以及4个线性梯度浓度的病毒核酸定量校准品，4个校准品HCMV核酸浓度分别为5.0x10⁷ copies/ml、5.0x10⁶ copies/ml、5.0x10⁵ copies/ml、5.0x10⁴ copies/ml，校准品为含有SEQ ID NO：1～2扩增靶序列的TA克隆质粒。阳性对照为含有该克隆质粒的大肠杆菌。

所述HCMV核酸检测试剂盒，采用基于磁珠法核酸提取的病毒DNA提取试剂，在核酸提取仪上实现样本核酸自动化提取。

通过上述设计优选获得的一对HCMV引物和两条荧光探针，辅以荧光PCR反应的其它组分，以及试剂盒试剂盒，本发明提供了实时荧光定量PCR检测的试剂盒，优化了PCR反应体系和扩增程序。当然本研究领域技术人员根据荧光PCR的一般要求可以调整PCR反应体系和程序，也同样能实现检测的目的。

有益效果

本发明根据上述设计的引物探针和技术方案，通过优化反应体系和扩增条件研制成人巨细胞病毒核酸荧光PCR定量检测试剂盒，其主要特点如下：

（1）基于改进的TaqMan探针荧光PCR技术，在一对PCR引物之间设计了两条和扩增靶序列位置互不重叠或互补的荧光探针，突破了传统TaqMan探针荧光PCR一次循环反应产生一个荧光分子的局限，每个靶序列DNA分子一次PCR循环能产生两个荧光分子，大大提高了试剂盒检测HCMV核酸灵敏度。

（2）设计的HCMV引物之间、荧光探针之间Tm值接近且无交叉次级结构，保证了病毒扩增的特异性和高效率，有利于提高了试剂盒检测HCMV核酸的灵敏度。

（3）扩增体系中的dUTP－UNG酶系统可避免了因扩增产物污染导致的结果假阳性，提高了试剂盒检测结果的准确性。

（4）试剂盒采用磁珠法自动化提取样本核酸、适用于全血、血浆、血清、尿液、乳汁等样本类型，提取检测操作简便快速，可在2小时内报告检测结果，提高了工作效率。

试剂盒的上述特点，均为采用特异性设计的HCMV引物探针并与荧光PCR技术组合应用而直接引起。从原理上说，本发明试剂盒在HCMV临床样本检测中通过对实时荧光PCR扩增荧光信号的分析，判断病毒核酸特异性片段的存在和病毒载量，本发明的技术方案设计合理，可以广泛应用于人巨细胞病毒的高灵敏定性或定量检测，可作为HCMV感染的有效辅助检测手段。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以通过技术常识对本发明作各种技术性改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1：人巨细胞病毒核酸检测试剂盒引物探针设计

根据NCBI GenBank数据库中查询的HCMV基因序列，采用分子生物学引物设计软件，优选获得的引物探针序列如表1所示，HCMV引物扩增的是该病毒IE2基因上139bp片段。

表1 设计的试剂盒引物探针

以上引物探针委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

实施例2：人巨细胞病毒核酸检测试剂盒配制

试剂盒反应缓冲液为自行配制，按表2各组分浓度和体积配制32人份试剂盒反应缓冲液，配制的反应缓冲液每个反应分装用量为20μl，加入模板10μl后总反应体积为30μl。

表2 试剂盒反应缓冲液配制各组分体积

试剂盒阴性对照采用正常人阴性血浆；定量校准品为含有HCMV扩增靶序列片段的克隆质粒，用TE缓冲液稀释到4个浓度作为试剂盒定量校准品：5.0x10⁷ copies/ml、5.0x10⁶copies/ml、5.0x10⁵ copies/ml、5.0x10⁴ copies/ml；阳性对照为含有上述克隆质粒的大肠杆菌，用人阴性血浆稀释到浓度为5.0x10³ copies/ml。

试剂盒病毒DNA提取试剂采用上海星耀医学科技发展有限公司研制的磁珠法病毒DNA提取试剂盒，它包括磁珠、裂解液、蛋白酶K、清洗缓冲液、洗脱缓冲液5个组分，使用时试剂盒阴性对照、阳性对照、标本均采用该试剂盒提取核酸。

试剂盒扩增程序为：50℃ 2min、94℃ 5min后按照94℃ 10sec、60℃ 45sec循环扩增45次，循环步骤中60℃时采集FAM通道波长荧光信号。

通过上述配制的HCMV核酸检测试剂盒组分包括：反应缓冲液、阴性对照、阳性对照以及4个定量校准品，要求-20℃保存和运输。

实施例3：试剂盒检测灵敏度的测定

（1）病毒DNA提取

取经临床鉴定、浓度已知的HCMV阳性血浆，样本中HCMV浓度均为2x10⁵ copies/ml）。然后采用正常人阴性血浆将该混合样本10倍连续梯度稀释到2x10⁴ copies/ml、2x10³copies/ml、2x10² copies/ml、2x10¹ copies/ml，吸取上述病毒稀释液、试剂盒阴性对照、阳性对照各400μl，一起采用实施例2中的磁珠法病毒DNA提取试剂在核酸提取仪上进行病毒DNA提取，最后每个样品获得的核酸各50 μl。

（2）荧光PCR检测

将实施例2中试剂盒反应缓冲液从-20℃冰箱取出冻融、混匀、短暂离心，按20μl/人份将反应缓冲液分装到PCR反应管中，然后分别加入上述提取的试剂盒阴性对照、阳性对照、病毒稀释液提取的模板、以及无需核酸提取的定量校准品各10 μl。每个反应管体积为30μl，将上述反应管放到ABI7500荧光PCR仪上，设定每个反应管样本类型并设置定量校准品浓度值，按照50℃反应2分钟，然后94℃保温5分钟，再按 94℃10秒→60℃45秒 循环45次（在60℃采集FAM通道波长荧光信号）的反应程序运行。扩增结束后按照仪器软件和试剂盒说明书分析判断实验结果。

（3）结果分析

试剂盒阴性对照检测结果为HCMV阴性，阳性对照检测结果为HCMV阳性，在FAM通道按浓度值设定HCMV定量校准品量值，校准品检测线性相关系数均大于0.98，符合试验质控要求。观察到2x10⁴ copies/ml、2x10³ copies/ml、2x10² copies/ml、2x10¹ copies/ml浓度的样品梯度分别重复5次检测，HCMV结果均为阳性，因此可以确定试剂盒对HCMV核酸的检测灵敏度可以达到2x10¹ copies/ml，能实现HCMV核酸的高灵敏定性或定量检测。

实施例4：试剂盒在人CID患者标本HCMV检测中的应用

（1）病毒DNA提取

取临床收集的HCMV感染样本25个（全血、血浆、血清、尿液、乳汁标本各5个）、Epstein-barr病毒感染全血样本5个，与试剂盒阴性对照、阳性对照一起采用实施例2中的磁珠法病毒DNA提取试剂在核酸提取仪上进行病毒DNA提取，每个样品取样体积400μl，提取后获得核酸各50 μl。

（2）荧光PCR检测结果

将实施例2中试剂盒扩增部分（反应缓冲液）从-20℃冰箱取出冻融、混匀、短暂离心，按20μl/人份将反应缓冲液分装到PCR反应管中，然后分别加入上述提取的试剂盒阴性对照、阳性对照、标本提取的模板、以及无需核酸提取的定量校准品各10 μl。每个反应管体积为30μl，将上述反应管放到ABI7500荧光PCR仪上，设定每个反应管样本类型并设置定量校准品浓度值，按照50℃反应2分钟，然后94℃保温5分钟，再按 94℃10秒→60℃45秒 循环45次（在60℃采集FAM通道波长荧光信号）的反应程序运行。扩增结束后按照仪器软件和试剂盒说明书分析判断实验结果，可知这25个标本（全血、血浆、血清、尿液、乳汁标本各2）均为HCMV核酸阳性、而5个Epstein-barr病毒感染全血样本为HCMV阴性，说明试剂盒适用于各种类型标本中的HCMV的检测，准确性和特异性良好。

序列表

<110> 上海星耀医学科技发展有限公司

<120> 一种人巨细胞病毒核酸检测试剂盒

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(20)

<223> 上游引物

<400> 1

agagagcgat tggtgttgcg 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(21)

<223> 下游引物

<400> 2

ccgagttgga caacgagaag g 21

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(26)

<223> 荧光探针A; b=FAM; d=BHQ

<400> 3

batgcggctc acctcgtcaa tcttgd 26

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(26)

<223> 荧光探针B; b=FAM; d=BHQ

<400> 4

baagaacacc cccttctgca cacccd 26